(Luận văn tốt nghiệp) nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α glucosidase của cây chè vằng (jasminum subtriplinerve) trên mô hình in vitro và in silico

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC LÊ MINH NGỌC NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α – GLUCOSIDASE CỦA CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve) TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO VÀ IN SILICO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2022 Luan van ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC LÊ MINH NGỌC NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α – GLUCOSIDASE CỦA CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve) TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO VÀ IN SILICO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2017.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS BÙI THANH TÙNG HÀ NỘI - 2022 Luan van LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, tồn thể thầy giáo cơng tác trường tạo điều kiện cho học tập tận tâm truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ suốt năm học trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô môn Dược lý tạo điều kiện để thực đề tài khố luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gửi lời cảm ơn trân trọng đến PGS.TS Bùi Thanh Tùng, Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y Dược Thầy người trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình làm đề tài Bên cạnh đó, thầy đưa lời khuyên, kinh nghiệm để giúp định hướng cho tương lai sau Đồng thời, xin chân thành cảm ơn tập thể cán Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình làm thực nghiệm cho đề tài Tiếp đến, xin gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Bảo Kim – sinh viên lớp Dược học khố QH.2018.Y nhiệt tình hỗ trợ nhiều Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè bên cạnh động viên, quan tâm hỗ trợ tơi q trình thực nghiên cứu Tuy có nhiều cố gắng, kiến thức kinh nghiệm tơi cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi thiếu sót đề tài nghiên cứu Kính mong nhận lời nhận xét, góp ý quý thầy để Khố luận tốt nghiệp tơi hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Lê Minh Ngọc Luan van DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ AG Alpha-glucosidase GH Glycoside hydrolase AGIs Chất ức chế alpha-glucosidase (Alpha-glucosidase inhibitors) DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetate n-BuOH N-butanol TG Triglyceride TC Cholesterol toàn phần LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp VLDL Lipoprotein tỉ trọng thấp CSDL Cơ sở liệu Luan van DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mẫu nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Kết docking 39 hợp chất thành phần Chè vằng vào enzym α-glucosidase 25 Bảng 3.3 Liên kết hợp chất tiềm với acid amin enzym αglucosidase 26 Bảng 3.4 Kết đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski 27 Bảng 3.5 Kết dự đoán ADMET 28 Luan van DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian ba chiều GH13 Agases Hình 1.2 Cấu trúc không gian 3D GH31 Agases Hình 1.3 Cấu trúc hoạt chất acarbose, miglitol Hình 1.4 Đặc điểm thực vật Chè vằng 12 Hình 1.5 Cấu trúc hoá học terpene glycosides 13 Hình 2.1 Lá Chè vằng phơi khơ (Jasminum subtriplinerve)……… … 16 Hình 2.2 Mô hệ thống sàng lọc ảo hợp chất ức chế α-glucosidase 19 Hình 3.1 Quy trình kết chiết cao Chè vằng……………………………… 22 Hình 3.2 Vùng hoạt động Isomaltase 24 Hình 3.3 Kết re-docked α-D-glucopyranose 24 Hình 3.4 Hình ảnh ba chiều (3D) tương tác bề mặt thụ thể phối tử vị trí hoạt động α-glucosidase 29 Hình 3.5 Hình ảnh tương tác hai chiều hợp chất tiềm với α-glucosidase 30 Luan van MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh 1.1.4 Các biến chứng bệnh ĐTĐ 1.1.5 Điều trị bệnh ĐTĐ 1.2 Enzym α-glucosidase chất ức chế enzym α-glucosidase 1.2.1 Enzym α-glucosidase 1.2.2 Chất ức chế enzym α-glucosidase 1.3 Phương pháp docking phân tử 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Quy trình docking 1.3.3 Quy tắc Lipinski hợp chất giống thuốc 10 1.3.4 Dự đốn thơng số dược động học độc tính 10 1.4 Cây Chè vằng - Jasminum subtriplinerve 11 1.4.1 Vị trí phân loại Chè vằng 11 1.4.2 Đặc điểm thực vật vị trí phân bố 11 1.4.3 Thành phần hoá học 12 1.4.4 Tác dụng sinh học 14 1.4.5 Công dụng 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 16 2.1.1 Nghiên cứu mô hình in vitro 16 2.1.2 Nghiên cứu mơ hình in silico 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Nghiên cứu mơ hình in vitro 18 2.2.2 Nghiên cứu mơ hình in silico 19 Luan van CHƯƠNG KẾT QUẢ 22 3.1 Kết trình chiết cao Chè vằng 22 3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Chè vằng mơ hình in vitro 23 3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase hợp chất Chè vằng phương pháp docking phân tử 24 3.3.1 Đánh giá mô hình Docking 24 3.3.2 Tiến hành docking hợp chất có tiềm ức chế alphaglucosidase…………………………………………………………………… 24 3.3.3 Kết đánh giá quy tắc tiêu chí Lipinski 27 3.3.4 Dự đốn đặc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ độc tính (ADMET) 28 CHƯƠNG BÀN LUẬN 31 4.1 Về tác dụng ức chế enzym α-glucosidase 31 4.2 Về phương pháp sàng lọc ảo 32 4.3 Về kỹ thuật docking phân tử 32 4.4 Về kết sàng lọc ảo 33 4.4.1 Astragalin 34 4.4.2 Isoquercitrin 35 4.4.3 Verbascoside 35 4.4.4 Stigmasterol 35 KẾT LUẬN 36 ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Luan van MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, đời sống người không ngừng thay đổi mặt văn hoá, xã hội hay chăm sóc sức khoẻ Theo đó, mơ hình bệnh tật Việt Nam có thay đổi, bệnh khơng truyền nhiễm có xu hướng gia tăng nhanh chóng Theo thống kê Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, tính đến năm 2021, giới có 537 triệu người trưởng thành từ 20-79 tuổi sống chung với bệnh tiểu đường Tại Việt Nam, bệnh đái tháo đường dự báo trở thành bảy bệnh gây tử vong tàn tật hàng đầu Việt Nam vào năm 2030 Hiện nay, để kiểm soát mức đường huyết điều trị bệnh tiểu đường, nhiều nghiên cứu ức chế enzym α-glucosidase chiến lược điều trị tiềm Enzym α-glucosidase (AG) đóng vai trị quan trọng trình thủy phân tinh bột thành glucose Tuy nhiên, hợp chất ức chế AG miglitol, metformin acarbose gây nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm kiếm hợp chất nguồn gốc thiên nhiên an toàn hiệu điều trị đái tháo đường ngày trở nên cấp thiết Tại Việt Nam, nhiều dược liệu có chứa hợp chất có tác dụng sinh học flavonoid, anthocyanosid, tannin, polyphenol…được dùng làm thực phẩm, nước uống bổ dưỡng, giải độc ngày, có Chè vằng Các tác dụng sinh học Chè vằng nghiên cứu trước kháng khuẩn, chống oxy hóa gây độc tế bào Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết Chè vằng để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm tiềm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Bên cạnh đó, docking phân tử trở thành cơng cụ hiệu việc khám phá phát triển loại thuốc Do vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym αglucosidase Chè vằng (Jasminum subtriplinerve) mơ hình in vitro in silico” thực nhằm mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Chè vằng mơ hình in vitro Xác định hợp chất Chè vằng có tác dụng ức chế enzym αglucosidase phương pháp docking phân tử Luan van CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm Đái tháo đường hội chứng rối loạn chuyển hóa khơng đồng nhất, đặc trưng tăng glucose huyết rối loạn tiết insulin hay giảm hoạt tính insulin, hai Tăng glucose mạn tính thời gian dài gây nên rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương nhiều quan khác nhau, đặc biệt tim mạch máu, thận, mắt, thần kinh Bệnh đái tháo đường nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tồn giới, cần chẩn đốn, phát điều trị theo nguyên tắc để đảm bảo sức khoẻ chất lượng sống 1.1.2 Phân loại Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2022, ĐTĐ phân thành loại sau 7: - ĐTĐ tuýp 1: gọi ĐTĐ phụ thuộc insulin hay ĐTĐ ngưởi trẻ, - - gây phá hủy tế bào β đảo tuỵ, thường dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối ĐTĐ tuýp 2: hay cịn gọi ĐTĐ khơng phụ thuộc insulin, giảm chức tế bào beta tụy tiến triển tảng đề kháng insulin ĐTĐ thai kỳ: chẩn đoán vào giai đoạn thứ hai thứ ba thai kỳ mà trước thời kỳ mang thai dấu hiệu rõ ràng bệnh đái tháo đường ĐTĐ nguyên nhân khác: nguyên nhân khác gồm hội chứng đái tháo đường đơn gen , bệnh tuyến tuỵ ngoại tiết, bệnh nội tiết, thuốc, hoá chất sử dụng glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS sau cấy ghép nội tạng 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh 1.1.3.1 Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ Đái tháo đường typ tình trạng đặc trưng phá hủy tế bào β đảo tụy thông qua hệ thống trung gian miễn dịch, dẫn đến tình trạng thiếu hụt insulin Cụ thể, tế bào bạch huyết bao quanh tiểu đảo (viêm quanh mơ) sau vào bên tiểu đảo, gây suy giảm tế bào β kết dẫn đến tiểu đường typ Luan van CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Enzym α-glucosidase enzym đóng vai trị quan trọng q trình thủy phân tinh bột thành glucose Sự ức chế hoạt động enzym α-glucosidase làm giảm q trình thủy phân carbohydrate làm chậm thẩm thấu glucose vào máu 16 Do vậy, việc nghiên cứu chất ức chế enzym α-glucosidase giúp ích hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Các hợp chất ức chế AG acarbose, miglitol, voglibose sử dụng làm thuốc điều trị bệnh đái tháo đường typ Acarbose thuốc tân dược sử dụng rộng rãi nay, thường dùng làm chất chứng dương nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Trong nghiên cứu này, acarbose sử dụng làm chất chứng dương cho thí nghiệm đánh giá khả ức chế enzym α-glucosidase Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết phân đoạn n-hexane ethyl acetate từ Chè vằng có tác dụng ức chế enzym αglucosidase mạnh nhiều lần so với chất chứng dương acarbose Cụ thể, cao chiết phân đoạn n-hexane thể hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 7,27 ± 0,71 g/mL, cao chiết ethyl acetate có giá trị IC50 7,42 ± 0,95 g/mL Có thể nói, cao chiết từ Chè vằng có chứa hợp chất có khả ức chế enzym α-glucosidase, chủ yếu nằm hai phân đoạn n-hexane ethyl acetate Trong tương lai, hướng nghiên cứu tiến hành phân lập thành phần hóa học phân đoạn n-hexane ethyl acetate từ Chè vằng để xác định hợp chất tiềm có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Kết nghiên cứu chúng tơi có vài điểm tương đồng với nghiên cứu giới Các loài thực vật thuộc chi Jasminum thường trồng sử dụng rộng rãi Châu Á, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học Năm 2014, S.Vinay cộng thực nghiên cứu hoạt động kiểm sốt bệnh tiểu đường lồi thực vật thuộc chi Jasminum, với tên khoa học Jasminum cuspidatum Phương pháp nghiên cứu tiến hành mơ hình động vật thực nghiệm, với đối tượng nghiên cứu chuột Kết số đường huyết, TC, TG, LDL, VLDL giảm đáng kể nhóm chuột điều trị chiết xuất ethanol Jasminum cuspidatum với liều 200mg/kg 400mg/kg so sánh với nhóm điều trị glibenclamide 48 Một nghiên cứu khác, M.A Jaya Prakkash cộng sự, thực vào năm 2019, để đánh giá hợp chất có hoạt tính sinh học lồi thực vật Jasminum polyanthum (thuộc chi Jasminum) đặc tính y học Trong nghiên cứu này, đặc tính ức chế enzym α-glucosidase dịch 31 Luan van chiết từ hoa Jasminum polyanthum 31,92% 37,76% Kết coi có ý nghĩa hoạt động kiểm soát bệnh tiểu đường 49 Nhìn chung, khơng có nhiều nghiên cứu rõ ràng hay cụ thể Chè vằng (Jasminum subtriplinerve) khả chống lại bệnh tiểu đường chúng Tuy nhiên, có nghiên cứu lồi thực vật khác thuộc chi Jasminum, cho thấy kết tiềm việc điều trị bệnh tiểu đường Trong nghiên cứu này, rằng, cao chiết Chè vằng có khả ức chế enzym α-glucosidase, bước ngăn cản trình hấp thụ glucose, giúp hỗ trợ điều hòa đường huyết 4.2 Về phương pháp sàng lọc ảo Kỹ thuật sàng lọc ảo in silico trình nghiên cứu phát triển thuốc, thực phẩm chức trở thành xu chung ngành cơng nghiệp dược phẩm tồn giới nhiều ưu điểm so với phương pháp tổng hợp hóa học truyền thống Ngày nay, với nhiều CSDL lớn hợp chất tự nhiên, tổng hợp cập nhật liên tục nhà khoa học khắp giới, việc dự đốn tính chất dược lý, dược động học trở nên dễ dàng Công việc thực máy tính sàng lọc số lượng lớn hợp chất CSDL, giúp tiết kiệm công sức, thời gian chi phí nghiên cứu Trong nghiên cứu này, trình sàng lọc ảo áp dụng CSDL mà nhóm nghiên cứu xây dựng Các hợp chất nghiên cứu xác định, phân lập từ Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume.) có nguồn gốc giới Việt Nam Việc sàng lọc CSDL tránh giai đoạn tổng hợp hợp chất, từ tiết kiệm thời gian, cơng sức, chi phí nghiên cứu Bên cạnh đó, sàng lọc ảo in silico cịn hạn chế, khó khăn khác biệt mơ hình máy tính q trình thực tế diễn thể người, xác xác định cấu trúc protein cấu tử, hay sai số thuật toán máy tính Vì thế, việc tiếp tục nghiên cứu in vitro, in vivo nghiên cứu lâm sàng cần thiết 4.3 Về kỹ thuật docking phân tử Docking kỹ thuật mô tương tác protein với protein protein phối tử nhằm tạo phức chất ổn định, ứng dụng phổ biến để thiết kế thuốc dựa vào cấu trúc Để thực kỹ thuật này, cần thông tin cấu trúc 3D protein, phối tử Vì thế, có nhược điểm cấu trúc 32 Luan van chúng bị thay đổi có tương tác tương tác hydro, tương tác van de Waals, tương tác tĩnh điện, Cấu trúc tinh thể isomaltase (ID: 3A4A) chứng minh có tính tương đồng với α-glucosidase từ Saccharomyces cerevisiae phù hợp cho mơ hình docking 42 Do vậy, nghiên cứu lựa chọn cấu trúc tinh thể isomaltase từ Saccharomyces cerevisiae để phục vụ cho bước sàng lọc dựa vào cấu trúc (docking) 4.4 Về kết sàng lọc ảo Đánh giá khả hấp thu chất dựa ba thơng số khả hịa tan nước, tính thấm qua màng Caco2, phần trăm hấp thu thuốc đường ruột Từ kết bảng 3.5, nhận thấy khả hòa tan nước hợp chất không cao với nồng độ mol dao động từ 10-2- 10-6 mol/l Tính thấm qua màng Caco2 (log Papp 10—6 cm/s) có giá trị cao 0.9 cho có khả thấm tốt, hầu hết hợp chất có khả thấm khơng cao với giá trị log Papp 10—6 cm/s