BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THANH MAI TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 11-AZAARTEMISININ CHỨA ARYL HALOGENID LU
TỔNG QUAN
Tổng quan về artemisinin
Artemisinin được phân lập từ cây Thanh Hao hoa vàng Artemisia annua L (họ Cúc, Asteraceae) [10] Cây Thanh Hao hoa vàng từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc làm thuốc nhưng đến năm 1967 mới được nghiên cứu, năm 1972 được chiết xuất dưới dạng tinh thể và năm 1979 artemisinin được xác định cấu trúc hóa học [11] Việc khám phá ra artemisinin và khẳng định tác dụng chống rét của nó được xem là một trong những phát hiện thuốc vĩ đại nhất nửa sau thế kỉ XX
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của artemisinin
Artemisinin có tên khoa học là (3R,6R,9R,12S,12aR)-3,6,9-trimethyloctahydro- 12H-3,12-epoxy[1,2] dioxepino [4,3-i] isochromen-10 (3H) - one Khối lượng phân tử 282,33 g/mol Công thức phân tử C15H22O5[12]
Bên cạnh tác dụng nổi bật là chống sốt rét, gần đây nhiều nhà khoa học đã phát hiện ra rằng artemisinin và dẫn chất có nhiều tiềm năng mới đặc biệt là tác dụng kháng ung thư [2-4]
1.1.1 Tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét của artemisinin và dẫn chất
Artemisinin có tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét (ở nồng độ cỡ nM) [13] Tuy nhiên artemisinin có một số nhược điểm, do đó các dẫn chất của artemisinin đã được tổng hợp và sử dụng trong lâm sàng như dihydroartemisinin (2), artemether (3) và artesunic acid (4) với mong muốn nâng cao hiệu lực tác dụng
Hình 1.2 Artemisinin và dẫn chất
Artemisinin và dẫn chất tác động nhanh đối với thể phân liệt và làm sạch kí sinh trùng sốt rét trong 24 giờ Artemisinin tác dụng trên giai đoạn hồng cầu của kí sinh trùng sốt rét nhưng lại không ảnh hưởng đến giai đoạn ngoài hồng cầu, nên artemisinin không có tác dụng dự phòng sốt rét Ở nồng độ 10 -7 M, artemisinin và dẫn chất ức chế in vitro một cách rõ rệt sự phát triển và nhân lên của kí sinh trùng sốt rét P.falciparum
Do có chứa nhóm peroxid trong cấu trúc, khi được hoạt hóa bởi sắt tự do hay sắt gắn với hem, artemisinin tạo thành gốc tự do có thể alkyl hóa nhiều protein Tác dụng của artemisinin có thể liên quan đến gốc tự do trong không bào tiêu hóa của kí sinh trùng, làm ức chế enzym PfATP6 là ATPase phụ thuộc Ca 2+ của kí sinh trùng [14] Hồng cầu người chứa 20 mM hem, ở dạng hemoglobin Kí sinh trùng sốt rét tiêu hóa khoảng 25% hemoglobin của hồng cầu nhưng không thoái hóa hem, dẫn đến tích lũy hem trong không bào tiêu hóa Điều này giải thích tại sao artemisinin gây độc chọn lọc đối với kí sinh trùng [15]
1.1.2 Tác dụng chống ung thư của artemisinin và dẫn chất
Artemisinin lần đầu tiên được phát hiện có hoạt tính chống ung thư vào năm 1993 khi một số artemisinin và dẫn chất bao gồm artesunat đã được nghiên cứu trên tế bào khối u cổ trướng Ehrlich (dòng tế bào có nguồn gốc từ khối u tuyến vú trên mô hình chuột) Tất cả các hợp chất thể hiện hoạt tính trên dòng tế bào khối u với IC50 dao động từ 12,2 đến 29,8 μM [16] Tuy nhiên, giá trị IC50 trên tế bào khối u cao hơn rõ rệt khi so sánh với hoạt tính của artemisinin trong điều trị bệnh sốt rét (1,3 μM) cho thấy liều artemisinin cao hơn là cần thiết để có hoạt tính chống ung thư [16] Nghiên cứu đầy hứa hẹn này đã dẫn đến việc đánh giá artemisinin và dẫn chất của nó trong một số dòng tế bào ung thư in vitro
4 Artesunat và DHA là các dẫn chất thường được khảo sát nhiều nhất Artesunat đã được thử nghiệm với 55 loại dòng tế bào khối u khác nhau Kết quả cho thấy artesunat có tác dụng mạnh nhất đối với các dòng tế bào ung thư bạch cầu và ung thư ruột kết với giá trị IC50 lần lượt là 1,11±0,56 μM và 2,13±0,74 μM Các dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ cho giá trị IC50 trung bình cao nhất 25,62±14,95 μM cho thấy độ nhạy thấp nhất đối với artesunat trong thử nghiệm này [17] Một số dòng tế bào ung thư khác cũng nhạy cảm với artesunat như ung thư hắc tố, vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt, thần kinh trung ương và ung thư thận Điều quan trọng khi so sánh khả năng gây độc tế bào của artesunat với độc tính tế bào của các thuốc khác cho thấy artesunat có hoạt tính ở phạm vi phân tử tương đương với hoạt tính của các thuốc chống khối u đã được điều trị [17] Chất chuyển hóa có hoạt tính của artemisinin, dihydroartemisinin (DHA) đã được chứng minh là có hiệu quả với tế bào bệnh bạch cầu MOLT-4 với tốc độ gây chết tế bào nhanh sau 8 giờ với 27,5% tế bào trải qua quá trình apoptosis Chất chuyển hóa có hoạt tính của artemisinin, dihydroartemisinin (DHA) đã được chứng minh là có hiệu quả với tế bào bệnh bạch cầu MOLT-4 với tốc độ chết tế bào nhanh sau 8 giờ với 27,5% tế bào trải qua quá trình apoptosis Các hợp chất nhóm artemisinin (chủ yếu là artesunat và DHA) đã được thử nghiệm in vivo sử dụng một số mô hình động vật về bệnh ung thư bao gồm bệnh bạch cầu [18], sarcoma [19], ung thư vú [20], tuyến tụy [21], gan [22] và ruột kết [23]
Những nghiên cứu điển hình ban đầu này đã dẫn đến sự phát triển của các thử nghiệm lâm sàng được kiểm soát nhiều hơn Một thử nghiệm lâm sàng ở bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ tiến triển đã nghiên cứu sự kết hợp điều trị bằng artesunat [24] Vinorelbin và cisplatin được dùng có hoặc không có artemisinin bằng đường tiêm tĩnh mạch (120 mg) Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ kiểm soát bệnh của nhóm thử nghiệm (88,2%) cải thiện đáng kể khi so sánh với nhóm chứng (72,7%) Tiếp đó nghiên cứu lâm sàng riêng biệt đã thử nghiệm artenimol, một este succinat của DHA trong điều trị ung thư cổ tử cung Các triệu chứng của bệnh thuyên giảm trong vòng ba tuần sau khi điều trị bằng thuốc artenimol (200 mg/ngày) ở tất cả người bệnh [25]
Cơ chế gây độc tế bào ung thư của artemisinin đã được nghiên cứu in vitro Cầu endoperoxid của artemisinin rất quan trọng với hoạt tính chống ung thư và hoạt tính
5 chống sốt rét Khi cầu endoperoxid bị loại bỏ khỏi DHA, kết quả là làm giảm 50-130 lần độc tính ở tế bào ung thư bạch cầu HL60 (human leukemia cell line) và tế bào bệnh bạch cầu Jurkat khi so sánh với DHA chứa endoperoxid [26] Nghiên cứu cho thấy sự bẻ gãy cầu endoperoxid tạo nên trung gian ROS, gây hỏng DNA và chết tế bào Thêm vào đó, artesunat gây ra sự ức chế tăng sinh, quá trình apoptosis và sự suy giảm glutathion trong các tế bào bệnh bạch cầu KG-1a ở người để đáp ứng lại sự sản sinh ra ROS [27]
Sắt cần thiết cho hoạt tính của artemisinin Hai cơ chế tác dụng đã được giả thuyết [28] Thứ nhất, artemisinin tích lũy trong endosom trước khi được kích hoạt bởi sắt không liên kết Điều này dẫn đến việc tạo ra của các ROS gây ra tổn thương lysosom, làm gián đoạn quá trình vận chuyển nội tiêu hóa và quá trình apoptosis qua trung gian ti thể Thứ hai, một kiểu tác dụng thay thế bao gồm sự hoạt hóa của artemisinin bởi nhân hem trong ty thể dẫn đến sản xuất của các gốc carbon tự do Các gốc này sau đó tạo thành các sản phẩm cộng có thể can thiệp vào chuỗi vận chuyển điện tử bằng cách tương tác với các protein liên kết với hem
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự gia tăng nồng độ sắt nội bào có thể làm tăng khả năng gây độc tế bào của artemisinin gấp 100 lần nếu tế bào ung thư được nạp sắt hoặc holotransferrin bão hòa sắt [29] Các tế bào ung thư tăng đáng kể nhu cầu về sắt cũng như tốc độ chuyển hóa sắt và biểu hiện của các thụ thể transferrin khi so sánh với các tế bào khỏe mạnh, khiến chúng dễ bị nhiễm độc tế bào artemisinin hơn qua đó cho thấy tính chọn lọc của artemisinin với tế bào ung thư.
Tình hình nghiên cứu của artemisnin và dẫn chất
Một số dẫn chất của artemisinin đã được phát triển để tìm kiếm các hợp chất có tính kháng ung thư cao Các nghiên cứu này được thực hiện trên nguyên tử C-10 và O-
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
11-azaartemisinin lần đầu được nghiên cứu và tổng hợp bởi Ziffer và cộng sự [30] Phương pháp điều chế 11-azaatermisinin đi theo hướng tác động vào nguyên tử O-
11 trên phân tử artemisinin (1) bằng cách cho artemisinin (1) tác dụng với các alkyl, aryl và các amin thơm chứa dị tố, sau đó là phản ứng vòng hoá nhờ xúc tác acid Các kết quả
6 nghiên cứu in vitro cho thấy các hợp chất 11-azaartemisinin có hoạt tính cao hơn nhiều so với artemisisnin, trong đó dẫn chất 5c và 5d có hoạt tính cao gấp 22 và 26 lần so với artemisinin (1)
Sơ đồ 1.1 Quy trình tổng hợp 11-azaartemisinin
Năm 2017, Sampad và cộng sự đã tổng hợp các dẫn xuất 11-azaartemisinin và thử hoạt tính trên các dòng tế bào CEM, HeLa và HMEC-1 [31] Các hợp chất đã được tổng hợp bằng phản ứng Click thông qua phản ứng tạo vòng azid - alkyn xúc tác CuI
Sơ đồ 1.2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất artemisinin có chứa nhóm 1,2,3-triazol
Sau khi tiến hành thử nghiệm invitro, azaartemisinin không ức chế sự phát triển của cỏc dũng tế bào đó thử nghiệm (IC50> 150 àM) Ngoài ra, dẫn chất propargyl của nú chỉ cho thấy tỏc dụng kỡm tế bào ở 100 àM Tuy nhiờn, một số triazol cú nhúm thế ở vị trí meta thể hiện hoạt tính chống tăng sinh rõ rệt [31] Trong 23 hợp chất có chứa vòng triazol tổng hợp được, hoạt tính kháng tế bào ung thư hầu hết đều tăng rất cao so
7 với 11-azaartemisinin khi chưa lai hóa Đặc biệt, hợp chất 8d có nhóm thế propyl ở vị trớ meta của vũng thơm) cú hoạt tớnh cao nhất với giỏ trị IC50 là 0,92 àg/mL trờn tế bào CEM và 1,2 àg/mL trờn tế bào HeLa Hơn nữa, chất 8d đó chứng tỏ hoạt tớnh tỏc dụng trên các tế bào ung thư mạnh hơn 30 lần so với tế bào thường, điều này đã chỉ ra một cơ chế hoạt động chọn lọc khối u
Bảng 1.1 Hoạt tính chống ung thư in vitro của một số dẫn chất artemisinin chứa nhóm
Hợp chất IC 50 (àg/mL)
Chú thích: CEM (Human T-lymphoblastic leukemia): dòng tế bào nguyên bào lymphoT; Hela (Human cervical carcinoma): dòng tế bào ung thư cổ tử cung; HMEC-
1 (Human dermal microvascular endothelial ): dòng tế bào ung thư nội mô
8 Tiếp đó năm 2018, Kapkoti và cộng sự đã tổng hợp dẫn xuất artemisinin có chứa vòng 1,2,3-triazol bằng phản ứng cộng vòng azid - alkyn (CuAAC) xúc tác CuI và thử tác dụng gây độc trên các dòng tế bào ung thư bằng thử nghiệm MTT [32] Các kết quả thử hoạt tính in vitro cho thấy hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào khối u của các dẫn chất này khá cao ở trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Đặc biệt ở hợp chất 10a (IC50
= 4,06 àM ) đó cho thấy hoạt tớnh cao nhất ức chế dũng tế bào ung thư A431 và hợp chất 10i (IC50 = 7,16 àM ) cú hoạt tớnh chống lại tế bào khối u phổi ỏc tớnh A594 cao hơn rất nhiều so với hợp chất gốc artemisinin có hoạt tính ở hai dòng tế bào A431 và A594 lần lượt là IC50 A431 = 68,82 àM và IC50 A549 = 43,43 àM [32]
Hợp chất Gốc R Hợp chất Gốc R
Sơ đồ 1.3 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất artemisinin chứa vòng triazol theo Kapkoti
Bảng 1.2 Hoạt tính chống ung thư in vitro của một số dẫn chất artemisinin chứa vòng triazol theo Kapkoti
Chú thích: K562 (Human erythromyeloblastoid leukemia cell line): dòng tết bào ung thư bạch cầu, PC-3 (Human prostate carcinoma): dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt; A431 (Human squamous carcinoma): dòng tế bào ung thư biểu bì; MDAMB-231 (Human breast carcinoma): dòng tế bào ung thư vú; COLO-205 (Human colon carcinoma): dòng tế bào ung thư đại tràng; A549 (Human lung carcinoma): dòng tế bào ung thư phổi; HEK-293 (Human kidney cells): dòng tế bào thận của người bình thường
Cũng trong năm 2018, Li và cộng sự đã tổng hợp được 10 dẫn chất mới của artemisinin có chứa nguyên tử flo và đánh giá độc tính invitro trên 6 dòng tế bào ung thư bằng phương pháp MTT [33] Các hợp chất này cho thấy khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư hiệu quả hơn so với artemisinin (giá trị IC50 từ 2,1 μM đến 28,8 μM) nhưng có độc tính tế bào thấp hơn so với doxorubicin trên tế bào thường Đặc biệt hợp chất 14j cho thấy khả năng gây độc tế bào mạnh nhất (IC50 = 2.1 μM) chống lại dòng tế bào MCF-7 ở bệnh nhân ung thư vú Hợp chất 14j gây ra hiện tượng apoptosis của tế bào và chu kỳ tế bào bị bắt giữ ở pha G1 trong các tế bào MCF-7
Sơ đồ 1.4 Quy trình tổng hợp dẫn chất của artemisinin chứa nguyên tử flo
Bảng 1.3 Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn chất artemisinin chứa nguyên tử flo
Chú thích: U87 (Human neuroblastoma cell lines): dòng tế bào u nguyên bào thần kinh; SH-SY5Y (Human Neuroblastoma Cell Line): dòng tế bào u tủy xương; MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7): dòng tế bào ung thư vú; MDA-MB-231 (Human breast carcinoma): dòng tế bào ung thư vú; A549 (Human lung carcinoma): dòng tế bào ung thư phổi; A375 (Among human melanoma cell): dòng tế bào u ác tính
1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Nhóm nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành và cộng sự đã tổng hợp 15 dẫn chất của 11- azaartemisin dựa trên phản ứng đa cấu tử Ugi [34]
Sơ đồ 1.5 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất 11-azaartemisinin
Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng phản ứng Ugi để tổng hợp các 11- aza artemisinin chứa mạch amid thông qua phản ứng của chất trung gian carboxylic 16, paraformaldehyd, benzyl isocyanid và các amin khác nhau Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng FcB1, một chủng P falciparum kháng cloroquin cho thấy tất cả chúng đều thể hiện sự ức chế chủng sốt rét này ở nồng độ 100 ng/mL, trong đó 17c (IC50 = 0,3nM),
17f (IC50 = 0,7 nM) cao hơn rất nhiều so với artemether (IC50 = 19nM) Các nghiên cứu cho thấy rằng chiều dài nhóm R chuỗi trên nitơ amid có thể đóng vai trò quan trọng với hoạt tính chống sốt rét của hợp các chất
12 Tiếp đó năm 2015, Trần Hữu Giáp và các cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất lai hóa aza artemesinin mang nhóm chức acid với dẫn chất 4-aminoquinolin qua cầu nối amid [35] Acid 18 được hoạt hóa nhóm chức acid, tiếp đó cho tác dụng với các dẫn chất 4-aminoquinolin để thu được hợp chất lai hóa Kết quả thu được 5 hợp chất lai hóa mới
Sơ đồ 1.6 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất lai azaartemisinin acid với dẫn chất
4-aminoquinolin qua cầu nối amid
Năm 2016, Lê Huy Bình và cộng sự đã tổng hợp một số dẫn xuất của artemisinin có chứa cầu nối triazol qua phản ứng click và thử tác dụng độc tính trên dòng tế bào MCF-7, LU-1, HL-60 và P388 [36] Kết quả tổng hợp được 19 hợp chất, đặc biệt hợp chất 26g chứa nhóm thế 4-metylpiperidin cho thấy hiệu quả cao nhất trong hoạt tính ức chế dũng tế bào HL-60 (IC50 = 2,51 àM), MCF-7 (IC50 = 4,7 àM), LU-1 (IC50 = 3,0 àM), P388 (IC50 = 3,8 àM) [36] Cỏc nghiờn cứu đỏnh giỏ sinh học cho thấy một số dẫn xuất mới (26g và 26h) có tiềm năng để thiết kế thêm các tác nhân chống ung thư
Sơ đồ 1.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất artemisinin với amino benzoic acid
Gần đây nhất năm 2021, Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự đã tổng hợp 18 dẫn chất artemisinin chứa vòng triazol dựa trên phản ứng click [37]
Sơ đồ 1.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất lai artemisinin chứa vòng triazol
Phản ứng Click, vòng 1,2,3 triazol và nhóm thế halogen
"Click Chemistry" là thuật ngữ được KB Sharpless đưa ra để mô tả các phản ứng có hiệu suất cao, phạm vi rộng, chỉ tạo ra các sản phẩm phụ có thể loại bỏ mà không cần sắc ký và có thể tiến hành dễ dàng [38] Một số loại phản ứng đã đáp ứng các tiêu chí
15 này, các phản ứng nhiệt động lực học đặc biệt dẫn đến một sản phẩm chẳng hạn như phản ứng mở vòng của epocid và aziridin, phản ứng carbonyl loại aldol, phản ứng cộng tạo các liên kết đa carbon-carbon,…
Sharpless và các cộng sự đã tìm ra được xúc tác đặc hiệu cho phản ứng của nhóm azid và alkyn là xúc tác Cu(I) [39] Với xúc tác này, phản ứng ghép đôi giữa nhóm azid và ankin chỉ cho một sản phẩm duy nhất là sản phẩm 1,2,3-triazol với hai nhóm thế ở vị trí 1 và 4, phản ứng này gọi là phản ứng Click Tuy nhiên dưới tác động của nhiệt độ cao hoặc sử dụng xúc tác Ru (II) thì phản ứng lại chọn lọc theo hướng tạo ra sản phẩm thế ở vị trí 1 và 5
Sơ đồ 1.9 Quá trình tổng hợp 1,2,3 triazol
Vòng 1,2,3-triazol có công thức hóa học C2H3N3, bao gồm một vòng dị vòng 5 cạnh với 3 nguyên tử nitơ và 2 nguyên tử carbon [40] Dị vòng này có đặc tính thơm vì tất cả các nguyên tử của nó đều được lai hóa sp2 và các electron 6π Đặc biệt, dị vòng 1,2,3 triazol có khả năng hình thành liên kết hydro giúp cải thiện khả năng hòa tan và tăng khả năng tương tác với các mục tiêu phân tử sinh học [41] Các 1,2,3-triazol có tính ổn định cao trước sự phân hủy trao đổi chất so với các hợp chất khác chứa ba nguyên tử nitơ liền kề Triazol được ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh nhờ hoạt tính sinh học đa dạng của chúng như tính kháng khuẩn [42], kháng virus [43], chống viêm, giảm đau [44], chống ung thư [45],…Với những tính năng ưu việt về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học 1,2,3-triazol vừa là tác nhân vừa là cầu nối lý tưởng để lai hóa các hợp chất có hoạt tính khác
16 Gần đây, liên kết halogen đã dẫn đầu trong những tiến bộ cải thiện liên kết giữa phối tử và thụ thể [46] Liên kết halogen giúp cho các tương tác phối tử - thụ thể được tối ưu hóa hơn, thiết kế có định hướng thông qua việc lựa chọn chính xác các nguyên tử để đưa vào các gốc phối tử có hoạt tính sinh học Các nghiên cứu cho thấy tương tác liên kết halogen là nguyên nhân tạo ra các cấu trúc khác nhau của các phân tử trong vị trí hoạt động [47] Liên kết halogen cũng ảnh hưởng đến liên kết giữa thuốc và protein vận chuyển, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân bố thuốc Việc gắn thêm nhóm thế halogen giúp tăng tính thấm của các hợp chất qua hàng rào máu não và giảm khả năng đào thải [8-9] Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chứa brom đã được nghiên cứu và phát hiện như: chống ung thư, chống sốt rét, kháng khuẩn, chống oxy hóa và giảm co thắt dạ dày [48]
Như vậy từ phần tổng quan cho thấy:
- Hiện nay, để tăng độ ổn định của artemisinin và các dẫn xuất với enzym P-450, các nhà khoa học thường gắn thêm các nhóm thế hoặc thay đổi các nguyên tố ở vị trí C-
- Qua việc tìm hiểu các nghiên cứu về mối quan hệ giữa vị trí, dạng hình học của nhóm thế trên vòng thơm của các hợp chất 11-azaartemisinin có chứa vòng triazol với hoạt tính kháng tế bào ung thư có thể nhận thấy rằng các hợp chất có nhóm thế halogen làm tăng hoạt tính đáng kể Do đó, việc định hướng tổng hợp các dẫn xuất có nhóm thế halogen và đa dạng về cấu trúc có thể tìm ra các hợp chất có hoạt tính cao
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
Các hóa chất và dung môi phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ được mua từ các hãng của Việt Nam, Merck (Đức), Trung Quốc hoặc Aldrich (Mỹ) Các hóa chất được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế
Bảng 2.1 Danh mục các dung môi hóa chất
STT Tên hóa chất Xuất xứ STT Tên hóa chất Xuất xứ
1 2-bromoanilin Sigma 15 Natri hydrid Trung Quốc
2 2-nitroanilin Sigma 16 Diclomethan Trung Quốc
3 3-bromoanilin Sigma 17 DMF Trung Quốc
4 3-nitroanilin Sigma 18 NaNO2 Trung Quốc
6 4-nitroanilin Sigma 20 Tetrahydrofuran Việt Nam
7 Amoniac Trung Quốc 21 Na2SO4 Việt Nam
8 Artemisinin Việt Nam 22 Ethanol Trung Quốc
9 BF3.Et2O Merck 23 Propargyl bromid Sigma
11 CuSO4.5H2O Trung Quốc 25 Natri azid Merck
12 Na2S2O4 Trung Quốc 26 n-hexan Trung Quốc
13 C2H5OH Việt Nam 27 CH2Cl2 Trung Quốc
14 Ethyl acetat Trung Quốc 28 NaHCO3 Trung Quốc
Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ, thiết bị
STT Tên thiết bị Xuất xứ
2 Bình cầu 1 cổ, 2 cổ 50 mL, 100 mL, 250 mL Đức
3 Bình chiết 250 mL, 500mL Trung Quốc
4 Bình nón 100 mL, 250 mL, 500 mL Trung Quốc
5 Bơm hút chân không DIVAC.1,21 Việt Nam
6 Cân kỹ thuật 10 -2 Ohaus Explorer Pro EP4102C
7 Cân phân tích Precisa XB 220A Trung Quốc
8 Đèn soi UV sắc ký CN6 Đức
9 Giấy chỉ thị màu vạn năng Trung Quốc
11 Máy cất quay chân không IKA RV 8 Đức
12 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-
13 LC- MS/MS Q-Exactive focus Mỹ
14 Máy khuấy từ gia nhiệt VELP AREX Ý
Nội dung nghiên cứu
- Tổng hợp một số dẫn chất 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid theo sơ đồ tổng quát 2.1 dưới đây
Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp chung
- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp
- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được bằng cách đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) và khối phổ MS
- Thử hoạt tính sinh học: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất 11- azaartemisinin chứa aryl halogenid được thực hiện theo phương pháp MTT của
Mosmann tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học &
Công nghệ Việt Nam trên 4 dòng tế bào ung thư ở người là Kb, HepG2, MCF7, A549 và 1 dòng tế bào thường Hek293.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thực hiện các phản ứng tổng hợp hóa học
- Tổng hợp 11-azaartemisinin : thực hiện phản ứng aza hóa artemisinin bằng NH3
- Tổng hợp 11-azaartemisinin có nhóm thế propargyl: thực hiện phản ứng alkyl hóa amin propargyl bromid
- Tổng hợp các azid: tiến hành phản ứng khử nitro thành amin thơm sau đó tổng hợp các azid từ amin thơm
-Phản ứng Click tạo dẫn chất 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid
-Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp
- Sử dụng phương pháp lọc, chiết lỏng – lỏng và sắc ký cột để tinh chế và thu sản phẩm
2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Các chất được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng đã xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chưa kết thúc dựa vào vị trí các vết sắc kí trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tương ứng Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của chất và phụ thuộc vào dung môi pha động Dựa trên tính chất đó, có thể tìm được dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phù hợp để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất
2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc của các hợp chất mới được xác định là đúng bằng các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR; 13 C-NMR và phổ khối lượng HRMS
2.3.2.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ 1 H-NMR (600 MHz) và 13 C-NMR (150 MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker avance neo với dung môi CDCl3 và TMS là chất chuẩn tại Phòng nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ dịch chuyển hóa học được ghi trên đơn vị phần triệu (parts per million, ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ 310 o K
Trong phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, sai số được chấp nhận của quy trình đo phổ là 1 Hz Độ dịch chuyển hóa học của proton (δ H ) được lấy tới số thập phân thứ 3 (đo ở tần số 600 MHz) và độ dịch chuyển hóa học của carbon (δ C ) được lấy tới số thập phân thứ 2 (đo ở tần số 150 MHz) Giả trị hằng số tương tác J được lấy tới 0,5 Hz và chấp nhận sai số 1 Hz Đặc điểm hệ phổ NMR thực nghiệm: Toàn bộ 6 dẫn chất được điều chế bằng phương pháp tổng hợp hóa học, do đó có thể hoàn toàn dựa trên các nguyên lý cơ bản của cộng hưởng từ để phân tích dữ liệu NMR nhằm xác định cấu trúc của các dẫn chất này:
+ Phổ 1 H-NMR cung cấp các dữ liệu về tỷ lệ cường độ giữa các pic, độ bội của từng pic, dạng vân phổ, từ đó xác định được giá trị hằng số tương tác J H-H tương quan giữa các hằng số này để sơ bộ khẳng định khung cấu trúc, vị trí nhóm thế [49-50]
22 + Phổ 13 C-NMR cho biết số carbon có trong phân tử hợp chất, độ dịch chuyển hóa học 13 C, bậc của các carbon để sơ bộ xác nhận cấu tạo của hợp chất cũng như vị trì nhóm thế [49-50]
Biện giải phổ NMR tham khảo tài liệu [49-50]
Phổ khối ESI-MS của các chất nghiên cứu được ghi trên máy LC- MS/MS Q-
Exactive focus với dung môi MeOH tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Đặc điểm của loại phổ này là tùy theo phương thức phá mẫu (ESI (+), ESI (-)) mà ion ghi nhận được là dương hay âm
+ Chế độ ESI (+): Các ion dương được tạo thành do sự kết hợp của phân tử trung hòa (hoặc mảnh vỡ) với một chất mang có điện tích dương như H + , Na + , K + , H3O + Số khối của các ion phân tử ghi nhận trên phố đồ lớn hơn số khối thực là 1 (nếu chất mang là H + ) hoặc 23 (nếu chất mang là Na + ) hoặc 39 (nếu chất mang là K + )
+ Chế độ ESI (-): Các ion được tạo thành do sự tách ra từ phân tử (hoặc mảnh vỡ) một ion dương, thường ion tách ra này là H + Các pic thu được đều có số khối nhỏ hơn số khối thực 1 đơn vị Số khối ion phân tử được ghi nhận có dạng [M-H] -
Toàn bộ 6 chất đều được phân tích cụm pic phân tử nhằm chứng minh hợp chất thu được có công thức phân tử phù hợp với công thức dự kiến [49-51] Nếu hợp chất chứa các đồng vị đặc trưng như clo, brom, lưu huỳnh, nitơ việc phân tích phổ cần chú ý tới cụm pic ion phân tử và sử dụng đặc điểm đồng vị, tỷ lệ đồng vị của các nguyên từ thường gặp trong hóa học hữu cơ Để kết luận được sự phù hợp của hợp chất tổng hợp về công thức phân tử với hợp chất dự kiến, cần phải dựa trên cả pic đồng vị bền và pic đồng vị đặc trưng
2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Hoạt tính sinh học được thử tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
❖ Vật liệu và hóa chất
- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)
- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA
- Các hóa chất thông thường khác
- Các dòng tế bào ung thư có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC): ung thư biểu mô KB (CCL -17 TM ), ung thư gan Hep G2 (HB - 8065 TM ), ung thư vú MCF7 (CRL-3435 ™ ), ung thư phổi A549 (CCL-185™) và dòng tế bào thường Hek293
❖ Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro
Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosman [52] Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm Giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào
Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC): ung thư biểu mô biểu mô KB (CCL -17 TM ), ung thư gan Hep G2 (HB - 8065 TM ), ung thư vú (MCF7) và ung thư phổi (A549) Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37 0 C, vô trùng tuyệt đối) Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính
Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/ml Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2564; 640; 160; 40 và 10 àg/ml Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128; 32; 8; 2 và 0,5 àg/ml Chất tham chiếu Ellipticin pha trong DMSO với nồng độ 0,01mM
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 1-3x10 4 tế bào/ml)
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Tổng hợp hóa học
Quy trình tổng hợp 6 dẫn chất 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid theo sơ đồ tổng quát 3.1 dưới đây
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung các dẫn chất VIIIa-f
Trong đó nhân thơm Ar có nhóm thế R là:
3.1.1 Tổng hợp dẫn chất 11-azaartemisinin
Hợp chất (II) được tổng hợp như quy trình được công bố trước đây của Nguyễn
Tiến Dũng và cộng sự [37] Hòa tan 5 g artemisinin I (17,7 mmol) và 60ml dung dịch
NH3 (33%) trong 100ml dung môi THF và 30ml EtOH ở nhiệt độ -15°C Hỗn hợp phản ứng được khuấy đều trong 12 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Sau khi kết thúc
26 phản ứng, dung môi được loại bỏ dưới áp suất giảm ở nhiệt độ phòng thu được chất rắn màu trắng
Tiếp theo, hòa tan chất rắn trong 100 ml dung dịch CH2Cl2, thêm vào hỗn hợp 4,8g acid p-toluensunfonic monohydrat (21,4 mmol) và tiếp tục khuấy trong 12 giờ ở
0 o C Theo dõi phản ứng bằng SKLM
Kết thúc phản ứng, rửa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch NaHCO3 10% Dịch hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột với hệ dung môi n Hexan -
EtOAc (7:3) thu được 3,3 g sản phẩm II dạng tinh thể hình kim màu trắng, hiệu suất phản ứng đạt 66,01%
Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp 11-azaartemisinin (II)
3.1.1.2 Tổng hợp 11-aza-artemisinin có nhóm thế propargyl
Sơ đồ 3.3.Quy trình tổng hợp 11-azaartemisinin có nhóm thế propargyl (IV)
Hợp chất (IV) được tổng hợp như quy trình được công bố trước đây của Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự [37] Hỗn hợp gồm 2g chất II (7,12mmol) và 0,44g NaH
(11mmol) được hòa tan trong 50 ml THF khuấy ở 0°C trong 2 giờ Sau đó thêm 1,36 g propargyl bromid (11,4 mmol) vào hỗn hợp và khuấy ở 0°C Theo dõi phản ứng bằng SKLM Kết thúc phản ứng, loại bỏ tetrahydrofuran dưới áp suất thấp, thêm 30ml nước vào hỗn hợp phản ứng và chiết bằng 30mL ethyl acetat x 3 lần Dịch chiết hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế sản phẩm
27 bằng sắc ký cột với hệ dung môi n hexan - EtOAc (4:1) thu được 1,68g sản phẩm IV là tinh thể hình kim màu trắng, hiệu suất 74,04%
Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp azid VIIa-f
3.1.2.1 Tổng hợp các amin thơm VIa-f
Thêm 0,52 g Na2S2O₄ 1M (3 mmol) vào dung dịch gồm 1 mmol 1-bromo-2- nitrobenzen trong hỗn hợp dung môi ethanol : nước (1:1) Đun nóng hỗn hợp ở 50°C trong 2 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Kết thúc phản ứng, loại bỏ ethanol dưới áp suất giảm, thêm 30ml nước vào hỗn hợp phản ứng và chiết bằng 30mL ethyl acetat x
3 lần Dịch chiết hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 445,53 mg sản phẩm VIa là chất rắn màu nâu xám, hiệu suất 71,08%
Chất VIb được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIa, từ 0,52 g Na2S2O₄ 1M
(3 mmol) vào dung dịch gồm 1 mmol 1-bromo-3-nitrobenzen trong hỗn hợp dung môi ethanol : nước (1:1), thu được 460,32 mg sản phẩm VIb là chất rắn màu nâu xám, hiệu suất 73,44%
Chất VIc được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIa, từ 0,52 g Na2S2O₄ 1M
(3 mmol) vào dung dịch gồm 1 mmol 1-bromo-4-nitrobenzen trong hỗn hợp dung môi ethanol : nước (1:1), thu được 474,30 mg sản phẩm VIc là chất rắn màu nâu xám, hiệu suất 75,67%
28 Chất VId được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIa, từ 0,52 g Na2S2O₄ 1M (3 mmol) vào dung dịch gồm 1 mmol 1-iodo-2-nitrobenzen trong hỗn hợp dung môi ethanol : nước (1:1), thu được 453,49 mg sản phẩm VId là chất rắn màu vàng nâu, hiệu suất 72,35%
Chất VIe được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIa, từ 0,52 g Na2S2O₄ 1M (3 mmol) vào dung dịch gồm 1 mmol 1-iodo-3-nitrobenzen trong hỗn hợp dung môi ethanol : nước (1:1), thu được 493,10 mg sản phẩm VIe là chất rắn màu vàng nâu, hiệu suất 78,67%
Chất VIf được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIa, từ 0,52 g Na2S2O₄ 1M (3 mmol) vào dung dịch gồm 1 mmol 1-iodo-4-nitrobenzen trong hỗn hợp dung môi ethanol : nước (1:1), thu được 473,92 mg sản phẩm VIf là chất rắn màu vàng nâu, hiệu suất 75,61%
3.1.2.2 Tổng hợp azid VIIa-f từ các amin thơm
❖ Tổng hợp 1-azido-2-bromobenzen (VIIa)
Hòa tan 2-bromoanillin (VIa) (1,0 mmol) và TsOH (1,0 mmol) trong 10 ml nước và làm lạnh hỗn hợp về 0°C Tiếp đó, đó thêm từ từ NaNO2 (1,0 mmol) vào hỗn hợp, khuấy tiếp ở 0°C trong 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM
Tiếp theo, thêm NaN3 vào hỗn hợp, khuấy trong vòng 30 phút Kết thúc phản ứng, thêm 30ml nước vào hỗn hợp sản phẩm và chiết 3 lần bằng dung môi ethyl acetat x 3 lần Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô VIIa là chất rắn có màu xám trắng, hiệu suất 71,40%
❖ Tổng hợp 1-azido-3-bromobenzen (VIIb)
Chất VIIb được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIIa, từ 3-bromoanillin (VIb) (1,0 mmol) và TsOH (1,0 mmol) trong 10 ml nước và làm lạnh hỗn hợp về 0°C Tiếp đó, đó thêm từ từ NaNO2 (1,0 mmol) vào hỗn hợp, khuấy tiếp ở 0°C trong 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Tiếp theo, thêm NaN3 vào hỗn hợp, khuấy trong vòng
30 phút Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô VIIb là chất rắn có màu xám trắng, hiệu suất 75,52%
❖ Tổng hợp 1-azido-4-bromobenzen (VIIc)
Chất VIIc được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIIa, từ 4-bromoanillin (VIc) (1,0 mmol) và TsOH (1,0 mmol) trong 10 ml nước và làm lạnh hỗn hợp về 0°C Tiếp đó, đó thêm từ từ NaNO2 (1,0 mmol) vào hỗn hợp, khuấy tiếp ở 0°C trong 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Tiếp theo, thêm NaN3 vào hỗn hợp, khuấy trong vòng
30 phút Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô VIIc là chất rắn có màu xám trắng, hiệu suất 73,15%
❖ Tổng hợp 1-azido-2-iodobenzen (VIId)
Chất VIId được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIIa, từ 2-iodoanillin (VId) (1,0 mmol) và TsOH (1,0 mmol) trong 10 ml nước và làm lạnh hỗn hợp về 0°C Tiếp đó, đó thêm từ từ NaNO2 (1,0 mmol) vào hỗn hợp, khuấy tiếp ở 0°C trong 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Tiếp theo, thêm NaN3 vào hỗn hợp, khuấy trong vòng
30 phút Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô VIId là chất rắn có màu nâu, hiệu suất 70,35%
❖ Tổng hợp 1-azido-3-iodobenzen (VIIe)
Chất VIIe được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIIa, từ 3-iodoanillin (VIe) (1,0 mmol) và TsOH (1,0 mmol) trong 10 ml nước và làm lạnh hỗn hợp về 0°C Tiếp đó, đó thêm từ từ NaNO2 (1,0 mmol) vào hỗn hợp, khuấy tiếp ở 0°C trong 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Tiếp theo, thêm NaN3 vào hỗn hợp, khuấy trong vòng
30 phút Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô VIIe là chất rắn có màu nâu, hiệu suất 75,67%
❖ Tổng hợp 1-azido-4-iodobenzen (VIIf)
Chất VIIf được tổng hợp theo quy trình tương tự chất VIIa, từ 4-iodoanillin (VIf) (1,0 mmol) và TsOH (1,0 mmol) trong 10 ml nước và làm lạnh hỗn hợp về 0°C Tiếp đó, đó thêm từ từ NaNO2 (1,0 mmol) vào hỗn hợp, khuấy tiếp ở 0°C trong 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Tiếp theo, thêm NaN3 vào hỗn hợp, khuấy trong vòng 30
30 phút Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô VIIf là chất rắn có màu nâu, hiệu suất 72,61%
3.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid VIIIa-f
Sơ đồ 3.5 Phản ứng Click tổng hợp chất VIIIa-f
Kiểm tra độ tinh khiết
Độ tinh khiết của các chất II, IV, VIa-f, VIIa-f, VIIIa-f được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy
- Sắc kí lớp mỏng được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 Các chất được hòa tan trong dung môi ethyl acetat Khảo sát với hệ dung môi khai triển Bản mỏng được quan sát dưới đèn từ ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc với thuốc thử hiện màu
Ce (IV) Kết quả các sắc kí đồ được chạy với 2 hệ dung môi khác nhau đều là một vết rõ, gọn Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
- Đo nhiệt độ nóng chảy: các chất có dạng rắn II, IV, VIa-f, VIIId-f được đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Nhiệt độ nóng chảy các chất dao động trong khoảng 1-2°C Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Giá trị Rf và t o nc của các chất tổng hợp được
Chất Hệ dung môi Rf t o nc
EtOAc - CH2Cl2 (5:95) 0,33 EtOAc – Aceton (1:2) 0,34
EtOAc - CH2Cl2 (5:95) 0,34 EtOAc – Aceton (1:2) 0,36
Như vậy từ kết quả SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất đã được tổng hợp, các chất tổng hợp được là tinh khiết và có thể được sử dụng để đo phổ MS, phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR.
Xác định cấu trúc
Các phương pháp ghi phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR) được sử dụng để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được Kết quả ghi phổ cụ thể của các chất được trình bày trong phần phân tích phổ và phụ lục
Phổ khối ESI-MS của các chất nghiên cứu được ghi trên máy LC- MS/MS Q-Exactive focus với dung môi MeOH tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Kết quả được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Số liệu phổ MS của các chất VIIIa-f
Chất Công thức cấu tạo CTPT M
39 Kết quả phân tích phổ cho thấy giá trị m/z của các pic ion giả phân tử [M+H] + của các chất VIIIa-c phù hợp với khối lượng phân tử của các chất VIIIa-c , đồng thời chứng tỏ các hợp chất VIIIa-c có một nguyên tử Br trong phân tử Các giá trị m/z của các pic ion giả phân tử [M+H] + của các chất VIIId-f phù hợp với khối lượng phân tử của các chất VIIId-f
3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H ( 1 H-NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H ( 1 H-NMR) được ghi trên máy Bruker Avance neo với dung môi CDCl3 và TMS là chất chuẩn tại Phòng nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ dịch chuyển hóa học được ghi trên đơn vị phần triệu (parts per million, ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ 310 o K Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.4
Bảng 3.4 Số liệu phổ 1 H-NMR của các chất II, IV, VIIIa-f
Chất Công thức cấu tạo 1 H-NMR (600 MHz, CDCl3, δH ppm)
6,00 (1H, s, NH); 5.39 (1H, s, 12-CH); 3,27-3,20 (1H, m, 9-CH); 2,45-2,38 (1H, m, 4-CH2); 2,04- 1,96 (2H, m, 4-CH2, 5-CH2); 1,85-1,79 (1H, m); 1,77-1,70 (2H, m); 1,52-1,45 (1H, m); 1,45-1,39 (1H, m); 1,37 (3H, s, 13-H overlap 1H, m); 1,14 (3H, d, J=7,2Hz, 15-CH3); 1,07-1,02 (2H, m, 8-
CH2); 3,91 (1H, dd, J,8; 2,4 Hz, 1’-CH2); 3,34-3,27 (1H, m, 9-CH); 2,47-2,40 (1H, m, 4-CH2); 2,14 (1H, t, J=2,4Hz, 3’-CH2); 2,07-1,98 (2H, m); 1,81-1,72 (2H, m); 1,71-1,65 (1H, m); 1,58-1.42 (2H, m); 1,40-1,33 (3H, s, 13-CH3 overlap 1H, m);
7,97 (1H, s, 3’-CH); 7,73 (1H, dd, J=7,8; 1,2 Hz); 7,52 (1H, dd, J=7,8; 1,8 Hz); 7,47 (1H, td, J=7,8; 1,2 Hz); 7,39-7,35 (1H, m); 5,52 (1H, s, 12-CH); 5,00 (1H, d, J Hz, 1’-CH2); 4,89 (1H, d, J
Hz, 1’-CH2); 3,40-3,30 (1H, m, 9-CH); 2,46-2,38 (1H, m, 4-CH2); 2,07-1,95 (2H, m, 4-CH2, 5-CH2); 1,72-1,61 (3H, m, 7-CH2, 8-CH2, 8a-CH); 1,60- 1,50 (1H, m, 5-CH2); 1,45-1,36 (1H, m, 6-CH); 1,36-1,32 (1H, m, 5a-CH); 1,31 (3H, s, 13-CH3); 1,12 (3H, d, J= 7,2 Hz, 15-CH3); 1,03-0,93 (4H, m, 14-CH3, 7-CH2); 0,83-0,73 (1H, m, 8-CH2)
8,04 (1H, s, 3’-CH); 7,96 (1H, t, J=1,8Hz, 2”-CH); 7,68 (1H, ddd, J=8,1; 2,1; 0,9Hz); 7,54 (1H, ddd,
CH2); 2,07-1,96 (2H, m, 4-CH2, 5-CH2); 1,73-1,65 (3H, m, 7-CH2, 8-CH2, 8a-CH); 1,60-1,50 (1H, m, 5-CH2); 1,50-1,40 (1H, m, 6-CH); 1,38-1,30 (1H, m, 5a-CH); 1,24 (3H, s, 13-CH3); 1,13 (3H, d, J 7,2 Hz, 15-CH3); 1,04-0,93 (4H, m, 14-CH3, 7-
8,04 (1H, s, 3’-CH); 7,63 (4H, s); 5,56 (1H, s, 12- CH); 4,83 (2H, s); 3,40-3,30 (1H, m, 9-CH); 2,45- 2,37 (1H, m, 4-CH2); 2,06-1,95 (2H, m, 4-CH2, 5-
CH2); 1,74-1,64 (3H, m, 7-CH2, 8-CH2, 8a-CH); 1,59-1,50 (1H, m, 5-CH2); 1,48-1,39 (1H, m, 6-
CH3); 1,13 (3H, d, J= 7,2 Hz, 15-CH3); 1,04-0,93 (4H, m, 14-CH3, 7-CH2); 0,85-0,75 (1H, m, 8-
7,98 (1H, dd, J=7,8; 1,2 Hz); 7,90 (1H, s, 3’-CH); 7,49 (1H, td, J=7,5; 1,0 Hz); 7,41 (1H, dd, J=7,8; 1,2 Hz); 7,22 (1H, td, J=7,7; 1,4 Hz); 5,53 (1H, s, 12-CH); 5,02 (1H, d, J Hz); 4,77 (1H, d, J Hz); 3,37-3,33 (1H, m, 9-CH); 2,46-2,37 (1H, m, 4-CH2); 2,08-1,95 (2H, m, 4-CH2, 5-CH2); 1,70- 1,60 (3H, m, 7-CH2, 8-CH2, 8a-CH); 1,60-1,53 (1H, m, 5-CH2); 1,45-1,38 (1H, m, 6-CH); 1,38- 1,30 (4H, m, 5a-CH, 13-CH3); 1,12 (3H, d, J= 7,2
Hz, 15-CH3); 1,04-0,90 (4H, m, 14-CH3, 7-CH2); 0,85-0,74 (1H, m, 8-CH2)
8,14 (1H, t, J=1,8Hz, 2”-CH); 8,02 (1H, s, 3’-CH); 7,75 (1H, ddd, J=8,1; 1,5; 0,9Hz); 7,71 (1H, ddd,
(1H, s, 12-CH); 4,86-4,78 (2H, m, 1’-CH2); 3,37- 3,33 (1H, m, 9-CH); 2,45-2,37 (1H, m, 4-CH2); 2,06-1,95 (2H, m, 4-CH2, 5-CH2); 1,74-1,64 (3H, m, 7-CH2, 8-CH2, 8a-CH); 1,60-1,50 (1H, m, 5-
Hz, 15-CH3); 1,03-0,93 (4H, m, 14-CH3, 7-CH2); 0,85-0,74 (1H, m, 8-CH2)
8,01 (1H, s, 3’-CH); 7,83 (2H, d, J=9,0 Hz); 7,50 (2H, d, J=9,0 Hz); 5,56 (1H, s, 12-CH); 4,82 (2H, d, J=0,6 Hz, 1’-CH2); 3,38-3,32 (1H, m, 9-CH); 2,45-2,37 (1H, m, 4-CH2); 2,06-1,95 (2H, m, 4-
CH2, 5-CH2); 1,74-1,64 (3H, m, 7-CH2, 8-CH2, 8a-CH); 1,60-1,50 (1H, m, 5-CH2); 1,50-1,40 (1H, m, 6-CH); 1,37-1,30 (1H, m, 5a-CH); 1,24 (3H, s, 13-CH3); 1,13 (3H, d, J= 7,2 Hz, 15-CH3); 1,03- 0,93 (4H, m, 14-CH3, 7-CH2); 0,85-0,75 (1H, m, 8-CH2)
Ghi chú: δ: độ dịch chuyển hóa học (ppm); J: hằng tương tác (Hz); s: singlet, d: doublet; dd: doublet of doublet; t: triplet; q: quartet
Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở bảng 3.4 cho thấy số lượng proton, độ bội của tín hiệu, độ dịch chuyển hóa học phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến
3.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 3 C-NMR) được ghi trên máy Bruker Avance neo với dung môi CDCl3 và TMS là chất chuẩn tại Phòng nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ dịch chuyển hóa học được ghi trên đơn vị phần triệu (parts per million, ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ 310 o K Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.5
Bảng 3.5 Số liệu phổ 13 C-NMR của các chất VIIIa-f
Chất Công thức cấu tạo 13 C-NMR (150 MHz, CDCl3, δC ppm)
Ghi chú: δ: độ dịch chuyển hóa học (ppm)
Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở bảng 3.5 cho thấy số lượng carbon, độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử carbon phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến.
Thử hoạt tính sinh học
Các dẫn chất của 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid VIIIa-f được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư ở người là dòng tế bào ung thư biểu mô Kb, ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF7, ung thư phổi A549 và 1 dòng tế bào thường Hek293 theo phương pháp MTT của Tim Mosmann tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Elipticin được sử dụng làm chất đối chứng
Chất đối chứng, ellipticin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào chống lại Kb, Hep- G2, A549 và MCF-7 cú giỏ trị IC50 lần lượt là 1,75 ; 1,75 ; 1,75 và 1,79 àM Cỏc giỏ trị là trung bình của ba lần xác định
Bảng 3.6 Hoạt tính sinh học của hợp chất VIIIa-f
Nhận xét : Toàn bộ 6 dẫn chất đã thể hiện hoạt tính khá tốt với 3/4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm Giá trị IC50 thấp nhất đạt được là 7,75±0,74 μM (hợp chất VIIIb) cho thấy đây là một hợp chất có tiềm năng
BÀN LUẬN
Về tổng hợp hóa học
4.1.1 Tổng hợp dẫn chất 11-azaartemisinin (IV)
Dẫn chất 11-azaartemisinin (IV) được tổng hợp từ artemisinin qua 2 phản ứng gồm 4 giai đoạn (Sơ đồ 4.1)
Sơ đồ 4.1 Phản ứng tạo dẫn chất 11-azaartemisinin (IV)
Hợp chất 11-azaartemisinin (II) được tổng hợp qua hai giai đoạn theo sơ đồ 4.1 Đầu tiên cho artemisinin (I) phản ứng với dung NH3 trong hỗn hợp dung môi THF và EtOH ở nhiệt độ dưới -15°C Trong giai đoạn này, phản ứng phải thực hiện ở điều kiện nhiệt độ nghiêm ngặt bởi tính kém bền của nhóm chức peroxid –O–O– trong cấu trúc artemisinin Nếu tiến hành phản ứng ở điều kiện nhiệt độ trên 0 o C, một lượng lớn sản phẩm phụ 11-deoxy azaartemisinin tạo thành cho hoạt tính thấp Qua khảo sát cho thấy, thiệt độ từ 0 o C đến -15 o C phù hợp với điều kiện tại phòng thí nghiệm, tuy nhiên hiệu suất phản ứng đạt được từ 30 – 40 % Ở nhiệt độ -15 o C hiệu suất phản ứng cao nhất đạt ở 70 % do tại nhiệt độ này cầu endoperoxyd được bảo toàn và không bị phá vỡ Ở giai đoạn 2, sản phẩm trung gian được xử lý bằng acid p-toluenufonic trong dung môi CH2Cl2 ở 0 o C Do phản ứng đóng vòng xảy ra nhanh nên không cần thực hiện ở -15 o C như giai đoạn đầu Tuy nhiên, bước 2 của phản ứng cần tối ưu điều kiện nhiệt độ ở 0 o C để giảm sản phẩm phụ
47 Tiến hành phản ứng alkyl hóa 11-azaartemisinin (II) với propargyl bromid với xúc tác NaH trong dung môi THF tạo ra sản phẩm 11-azaartemisinin có nhóm thế propargyl (IV) Thông thường, phản ứng alkyl hóa amin sẽ được thực hiện bằng cách cho alkyl halogenid phản ứng với các amin ở trong môi trường base ở nhiệt độ cao Tuy nhiên, do tính kém bền của cầu nối peroxid trong cấu trúc artemisinin nên phản ứng được thực hiện ở 0 o C Vì vậy dùng NaH trong trường hợp này giúp giảm nhiệt độ của phản ứng nhằm tránh sự thủy phân liên kết amid Ngoài ra, do NaH rất nhạy cảm với ẩm nên phản ứng cần tiến hành nhanh, tránh ẩm do sẽ thủy phân sản phẩm gây khó khan cho quá trình tinh chế
Sơ đồ 4.2 Phản ứng tạo azid
Các azid được tổng hợp qua 2 phản ứng từ nguyên liệu ban đầu là các nitro thơm
(Va-f) Ở phản ứng thứ nhất, các nitro thơm được khử hóa bằng Na2S2O4 trong môi hỗn hợp dung môi EtOH/ H2O ở 50 o C Xử lý phản ứng cần loại bỏ ethanol dưới áp suất thấp để tránh hao hụt sản phẩm Ở bước thứ hai, nhóm -NH2 của các hợp chất VIa-f được thay thế bằng nhóm -N3 Giai đoạn đầu của phản ứng tạo azid có sản phẩm trung gian là muối diazoni không bền nên cần tối ưu hóa phản ứng ở điều kiện nhiệt độ 0-5 o C và theo dõi kỹ thời gian phản ứng
4.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid VIIIa-f
Phản ứng Click ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc Sự hình thành 1,2,3-triazol từ azid và sử dụng đồng (I) làm xúc tác là con đường rất hữu ích để tạo ra các hợp chất mới cho hoạt động sàng lọc hoạt tính sinh học Với xúc tác CuI, phản ứng ghép đôi giữa nhóm azid và alkyn chỉ cho một sản phẩm duy nhất là sản phẩm 1,2,3-triazol với hai nhóm thế ở vị trí 1 và 4 [39]
48 Phản ứng Click có tính đặc hiệu, thân thiện môi trường và có khả năng tương thích sinh học cao của các chất phản ứng Hơn nữa, triazol là cầu nối dễ dàng liên kết với đích tác dụng thông qua liên kết hydro và tương tác lưỡng cực [46-48] Trong nghiên cứu này, bằng việc sử dụng phản ứng Click một loạt các dẫn chất mới triazol của artemisinin VIIIa-f được thiết kế và tổng hợp như sơ đồ 4.3
Sơ đồ 4.3 Phản ứng Click tổng hợp các dẫn chất 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid VIIIa-f Theo cơ chế phản ứng Click, ở bước đầu tiên của phản ứng, alkyl có nối ba ở đầu mạch liên kết với nguyên tử Cu(I) đầu tiên bằng liên kết σ và liên kết với nguyên tử Cu(I) thứ hai bằng liên kết π tạo phức alkyl-Cu2 Tiếp theo, phức này phản ứng thuận nghịch với một azid hữu cơ, sau đó là sự tấn công ái nhân của nguyên tử C-2 ở phức ankin-Cu2 vào nguyên tử N-3 ở azid tạo liên kết cộng hóa trị C–N đầu tiên Cuối cùng, sự hình thành liên kết cộng hóa trị C–N thứ hai dẫn đến đóng vòng, tạo sản phẩm và phục hồi xúc tác Cu + [39]
Hình 4.1 Cơ chế phản ứng Click
Quá trình tổng hợp các hợp chất VIIIa-f được bắt đầu từ chất chìa khóa IV Đầu tiên, hỗn hợp hợp chất IV, Et3N và CuI trong dung môi THF được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Sau đó, thêm azid vào hỗn hợp phản ứng và tiếp tục khuấy trong 12 giờ ở nhiệt độ này Xúc tác được sử dụng trong phản ứng là CuI Cho đến nay, đây vẫn là chất xúc tác tốt nhất cho phản ứng giữa azid và alkyl Ở giai đoạn đầu, hợp chất IV và CuI được phản ứng trong ít nhất 1 giờ nhằm tạo phức ổn định trước khi thêm azid Sau đó, Et3N được thêm vào hỗn hợp nhằm tạo phức ổn định alkyl-Cu2 và bảo vệ Cu +1 khỏi quá trình oxy hóa Thêm vào đó, dung môi THF phải khan để tránh phản ứng chuyển Cu +1 thành Cu +2 làm mất khả năng xúc tác Trong hầu hết các trường hợp, các hợp chất mong muốn thu được với hiệu suất trung bình đến khá tốt sau khi tinh chế qua sắc ký cột Cấu trúc, hiệu suất và tính chất sản phẩm được đưa ra như bảng 4.1
Bảng 4.1 Hiệu suất phản ứng Click tạo các dẫn chất VIIIa-f
Dạng dầu màu vàng nhạt
Dạng dầu màu vàng nhạt
Dạng dầu màu vàng nhạt
Dạng rắn màu vàng nâu
Dạng rắn màu vàng nâu
Dạng rắn màu vàng nâu
Về xác định cấu trúc
4.2.1 Khẳng định cấu trúc của 11-azaartemisinin (II)
Cấu trúc của hợp chất 11-azaartemisinin (II) được chứng minh bằng phương pháp phổ 1 H- NMR
Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất II xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của các proton có mặt trong phân tử được thể hiện trên hình 4.2
Hình 4.2 Phổ 1 H-NMR của hợp chất II Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của một số proton đặc trưng được đưa ra như sau:
- Proton H-11 do liên kết với nguyên tử N có độ âm điện cao và không đứng cạnh bất kỳ proton nào nên tín hiệu cộng hưởng có dạng singlet và chuyển về trường yếu tại 6,00 ppm
- Proton H-12 là proton no nhưng do đứng gần một nguyên tử O và một nguyên tử N có độ âm điện cao nên tín hiệu cộng hưởng chuyển về trường yếu tại 5,39 ppm và có dạng ở singlet Đây là một proton đặc trưng của khung artemisinin
Hình 4.3 1 Phổ dãn rộng 1 H-NMR của hợp chất II phần 1
- Ba proton H-13 trong nhóm methyl (CH3-) do đứng gần hai nguyên tử O có độ âm điện cao và không đứng gần bất kỳ proton nào khác nên tín hiệu cộng hưởng xuất hiện tại 1,37 ppm ở dạng singlet.
- Hai nhóm methyl (H-14 và H-15) đứng gần một proton khác nên tín hiệu cộng hưởng có dạng doublet với J = 7,2 Hz và 6 Hz Nhóm methyl H-15 đứng gần nhóm amid hút electron nên tín hiệu cộng hưởng chuyển về trường yếu hơn ba proton H-14 Do đó, ba proton H-15 có tín hiệu cộng hưởng tại 1,14 ppm và ba proton H-14 có tín hiệu cộng hưởng tại 1,00 ppm
Hình 4.4 2 Phổ dãn rộng 1 H-NMR của hợp chất II phần 2
4.2.2 Khẳng định cấu trúc của 11-azaartemisin có nhóm thế propagyl (IV)
Cấu trúc của hợp chất 11-azaartemisinin có nhóm thế propagyl (IV) được chứng minh bằng phương pháp phổ 1 H- NMR
Trên phổ đồ của hợp chất IV xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của các proton có mặt trong phân tử được thể hiện trên hình 4.4
Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của hợp chất IV
Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của một số proton đặc trưng được đưa ra như sau:
-Proton H-12 là proton đặc trưng của khung artemisinin có tín hiệu cộng hưởng singlet Tuy là proton no, nhưng do đứng cạnh một nguyên tử O và một nguyên tử N nên tín hiệu cộng hưởng được chuyển về trường yếu tại 5,45 ppm
- Trong khung artemisinin có nhiều trung tâm bất đối nên hai H liên kết với C-1’ có tín hiệu không tương đương nhau Hai proton này do đứng cạnh nguyên tử N có độ âm điện cao và liên kết liên kết C≡C đầu mạch nên tín hiệu chuyển về trường yếu Proton H-1a’ do tương tác spin – spin với nguyên tử H-1b’ và nguyên tử H-3’ nên tín hiệu cộng hưởng có dạng doublet doublet Hơn nữa, proton H-1a’ và H-1b’ ở dạng gem và không tương đương nên hằng số tương tác spin – spin lớn và bằng 17,1 Hz Proton H-1a’ và H-3’ do ở vị trí 1,3 nên J = 2,7 Hz và cộng hưởng tại tại 4,81 ppm Proton H-1b’ cũng xuất hiện tín hiệu dưới dạng doublet doublet tại 3,91 ppm
Hình 4.5 1 Phổ dãn rộng 1 H-NMR của hợp chất IV phần 1
Hình 4.5 2 Phổ dãn rộng 1 H-NMR của hợp chất IV phần 2
- Proton H-3’ đứng gần liên kết ba có hiệu ứng chắn không đẳng hướng và hai proton H-1’ nên tín hiệu cộng hưởng có dạng triplet xuất hiện tại 2,14 ppm với J = 2,4
- Ba proton H-13 trong nhóm methyl (CH3-) do đứng gần hai nguyên tử O có độ âm điện cao và không đứng gần bất kỳ proton nào khác nên tín hiệu cộng hưởng xuất hiện tại 1,40-1,33 ppm ở dạng singlet.
- Hai nhóm methyl (H-14 và H-15) đứng gần một proton khác nên tín hiệu cộng hưởng có dạng doublet Nhóm methyl H-15 đứng gần nhóm amid hút electron nên tín hiệu cộng hưởng chuyển về trường yếu hơn ba proton H-14 Do đó, ba proton H-15 có tín hiệu cộng hưởng tại 1,15 ppm và ba proton H-14 có tín hiệu cộng hưởng tại 1,07- 0,99 ppm
4.2.3 Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất 11-azaartemisinin chứa vòng thơm có nhóm thế bromo VIIIa-c
Cấu trúc của sản phẩm được khẳng định bằng bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR) và phổ HRMS
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR
Trên phổ đồ của các hợp chất VIIIa-c thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của các proton có mặt trong phân tử Đặc biệt có số đặc điểm của các proton vòng triazol, proton trên nhóm thế của nhân thơm
Ví dụ trên phổ đồ của dẫn chất VIIIb (hình 4.6) có thể thấy xuất hiện đầy đủ các pic tương ứng với các proton có mặt trong phân tử với cường độ mạnh và rõ nét
Hình 4.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của hợp chất VIIIb
Hình 4.7 1 Phổ dãn rộng 1 H-NMR của hợp chất VIIIb phần 1
58 Trong đó có các proton đặc trưng như:
- Vòng 1,2,3-triazol là dị vòng thơm do hiệu ứng chắn không đẳng hướng nên tín hiệu cộng hưởng của proton H-3’ chuyển về trường yếu và cộng hưởng tại 8,04 ppm Ngoài ra, do proton H-3’ không đứng cạnh proton nào nên tín hiệu có dạng singlet
- Bốn proton của vòng benzen cộng hưởng trong khoảng 7,96-7,38 ppm
+ Do vòng benzen có hai nhóm thế ở vị trí 1,3 nên hằng số tương tác spin-spin của proton H-2” và hai proton H-4”, H-6” nhỏ và có giá trị J=1,8 Hz Tín hiệu cộng hưởng của H-2” có dạng triplet tại 7,96 ppm
+ Proton H-4” do đứng cạnh 3 loại proton khác nhau nên tín hiệu cộng hưởng có dạng doublet doublet doublet Hằng số tương tác spin-spin với H-5”, H-2” và H-6” lần lượt là 8,1; 1,8 và 0,9 Hz
+ Proton H-6” có tín hiệu cộng hưởng tương tự proton H-4” Tuy nhiên proton H-6” có tương tác spin-spin với H-5”, H-2” và H-4”
+ Proton H-5” do đứng cạnh proton H-4” và H-6” nên tín hiệu có dạng triplet với hằng số tương tác spin-spin lớn và bằng 8,1 Hz Tín hiệu của H-5” cộng hưởng tại 7,38 ppm
Hình 4.7 2 Phổ dãn rộng 1 H-NMR của hợp chất VIIIb phần 2
Về hoạt tính sinh học
Sau khi khẳng định cấu trúc các dẫn chất của 11-azaartemisinin chứa aryl halogenid VIIIa-f là đúng, các hợp chất này được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên
4 dòng tế bào ung thư ở người là dòng tế bào ung thư biểu mô Kb, ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF7, ung thư phổi A549 và 1 dòng tế bào thường Hek293 theo phương pháp MTT của Tim Mosmann
Trong thử nghiệm này, elipticin được sử dụng làm chất đối chứng, giá trị IC50 của ellipticine đối với các dòng tế bào ung thư Kb, Hep-G2, A549 và MCF-7 lần lượt là 1,75; 1,75; 1,75 và 1,79 àM Cỏc giỏ trị là trung bỡnh của ba lần xỏc định
Hình 4.14 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất VIIIa-f
Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trên bốn dòng tế bào cho thấy hầu hết các hợp chất VIIIa-f thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư (3/4 dòng tế bào ung thư); 18/24 kết quả thử nghiệm cho kết quả tốt (từ 7,75±0,74 – 53,75±2,48 àM) Cỏc hợp chất thử nghiệm gần như khụng cú hoạt tớnh gõy độc đối với tế bào ung thư vú (MCF-7)
Với dòng tế bào ung thư biểu mô Kb, hầu hết các hợp chất VIIIa-f thể hiện tác dụng gây độc gây độc tế bào khá tốt với các giá trị IC50trong khoảng 7,75±0,74 –
VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf Ellipticin
68 34,07±1,38 àM Nổi bật là ba hợp chất VIIIb, VIIIe và VIIIf thể hiện hoạt tớnh gõy độc tế bào khỏ cao với giỏ trị IC50 lần lượt là 7,75±0,74 ; 10,64±1,08 và 10,28±0,50 àM Các hợp chất VIIIa, VIIIc và VIIId cho kết quả hoạt tính chưa rõ ràng với giá trị IC 50 lần lượt là 32,32±1,47; 26,45±0,91 và 34,07±1,38 àM Kết quả so sỏnh được đưa ra như hình 4.15 sau đây
Hình 4.15 Biểu đồ hoạt tính gây độc tế bào Kb của các hợp chất VIIIa-f
Khi so sánh hoạt tính gây độc tế bào của các chất trên dòng tế bào ung thư phổi A549 Các hợp chất VIIIa-f thể hiện tác dụng gây độc gây độc tế bào khá tốt, 5/6 hợp chất được thử nghiệm cú giỏ trị IC50nằm trong khoảng 9,20±0,76 – 46,03±3,76 àM Một hợp chất (VIIIe) gần như không có hoạt tính gây độc tế bào, có giá trị IC50 bằng 134,95±9,70 àM Đặc biệt, hợp chất VIIIf thể hiện tỏc dụng gõy độc tế bào cao nhất với giỏ trị IC50là 9,20±0,76 àM
Hình 4.16.Biểu đồ hoạt tính gây độc tế bào A549 của các hợp chất VIIIa-f
VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf Ellipticin
VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf Ellipticin
69 Đối với dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 (hình 4.17), hầu hết các hợp chất VIIIa- f đều thể hiện tác dụng gây độc tế bào khá tốt Kết quả gây độc tế bào với các giá trị IC 50 trong khoảng 9,45±0,25 – 49,30±4,02 àM Nổi bật là hợp chất VIIIe thể hiện tỏc dụng gõy độc tế bào cao nhất với giỏ trị IC50là 9,45±0,25 àM
Hình 4.17.Biểu đồ hoạt tính gây độc tế bào Hep-G2 của các hợp chất VIIIa-f
Khi so sánh khả năng gây độc tế bào của sáu chất tổng hợp được trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (Hình 4.18) Nhìn vào kết quả ở bảng 4.16 ta thấy: với dòng tế bào ung thư vú MCF-7, các hợp chất VIIIa-f hầu như không có hoạt tính gây độc tế bào Kết quả gây độc tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng từ 53,75±2,48 – 213,45±11,10 àM
Hình 4.18 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các hợp chất VIIIa-f
VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf Ellipticin
VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf Ellipticin
70 Khi nghiên cứu mối quan hệ giữa vị trí nhóm thế và tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất chứa bromo (VIIIa, VIIIb và VIIIc) có thể nhận thấy:
- Đối với hai dòng tế bào Kb và A549, các dẫn chất có nhóm thế 3-bromophenyl (VIIIb) cú hoạt tớnh gõy độc tế bào lần lượt là: 7,75±0,74 và 15,49±1,87 àM, cỏc giỏ trị này cao hơn từ 2,97 – 3,41 lần so với các dẫn chất có nhóm thế ở vị trí ortho và para (VIIIa và VIIIc)
- Tuy nhiên, trên hai dòng tế bào HepG2 và MCF-7, các dẫn chất có nhóm thế 2- bromophenyl và 4-bromophenyl có hoạt tính tốt hơn so với vị trí meta
- Đối với các dẫn chất chứa bromo, nếu nhóm thế bromo ở vị trí meta thì hoạt tính có thể tăng hoặc giảm tùy từng dòng tế bào được thử nghiệm Giá trị IC50 của các dẫn chất có chứa bromo được đưa ra như hình 4.19 sau đây
Hình 4.19.Giá trị IC50 của dẫn chất chứa nhóm thế brom VIIIa-c
Cũng tương tự như trên, khi đánh giá mối liên quan giữa cấu trúc – tác dụng của các hợp chất chứa nhóm thế iodo:
- Đối với dòng tế bào ung thư A549, dẫn chất chứa nhóm thế 4-iodophenyl có hoạt tính cao hơn các dẫn chất có nhóm thế iodo ở vị trí ortho, meta và gấp khoảng 3,0 – 14,7 lần Tuy nhiên, trên dòng tế bào Kb thì hoạt tính gây độc tế bào của dẫn chất chứa nhóm thế 3-iodophenyl và 4-iodophenyl gần tương đương nhau và cao hơn dẫn chất có nhóm thế ở vị trí meta khoảng 3,4 lần
- Đối với dòng tế bào MCF-7 dẫn chất có nhóm thế ở vị trí ortho có hoạt tính gây độc tế bào tốt nhất, trong khi đó nếu nhóm thế ở vị trí meta có hoạt tính thấp nhất
- Còn lại, đối với dòng tế bào ung thư HepG2, dẫn chất có nhóm thế ở vị trí meta cú hoạt tớnh gõy độc tế bào cao nhất và cụ thể bằng 9,45±0,25 àM, cao hơn từ 1,9 – 3,3 lần so với các vị trí khác