lê thiên bảo long tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất thơm mới mang khung 2 5 pyridin2 yl 1h tetrazol 1 ylacetamid

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, các dẫn chất mang khung tetrazol có khả năng tương tác với một số đích phân tử tiềm năng trong điều trị Alzheimer, trong đó hướng ức chế enzym ac

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THIÊN BẢO LONG

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THƠM MỚI MANG KHUNG 2-(5-(PYRIDIN-

2-YL)-1H-TETRAZOL-1-YL)ACETAMID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THIÊN BẢO LONG

MÃ SINH VIÊN: 1901394

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THƠM MỚI MANG KHUNG 2-(5-(PYRIDIN-

2-YL)-1H-TETRAZOL-1-YL)ACETAMID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS TS Trần Phương Thảo NCS Nguyễn Viết Hùng

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa dược Khoa Công nghệ Hóa dược Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày những nội dung nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp của mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ và động viên tôi hoàn thành nghiên cứu của mình một cách tốt nhất

Trước hết, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Trần Phương Thảo, người luôn quan tâm và hỗ trợ tôi từ những ngày đầu tham gia nghiên cứu khoa

học và luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi được học tập, rèn luyện và tích lũy kiến thức, kỹ năng để tôi từng bước hoàn thiện bản thân mình Đồng thời, tôi xin cảm ơn

NCS Nguyễn Viết Hùng, người đã luôn theo sát, giúp đỡ và động viên tôi những lúc

gặp khó khăn trong quá trình làm thực nghiệm để tôi có thể hoàn thiện đề tài của mình một cách tốt nhất

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Tiến Anh, TS Hoàng Văn Hải, NCS Dương Văn Hiếu và NCS Nguyễn Hữu Long đã luôn giải đáp

những thắc mắc, chia sẻ những kiến thức, kinh nghiệm và góp ý trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn Hóa dược Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên, nghiên cứu viên, và các anh chị kĩ thuật viên đang công tác tại bộ môn Hóa dược - Khoa Công nghệ Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ và tạo một môi trường thuận lợi cho tôi hoàn thiện đề tài

Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới “Tập thể sinh viên NCKH lab PGS TS Trần Phương Thảo” đã luôn chia sẻ cùng tôi những niềm vui, nỗi buồn trong quá trình

nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc sống và đặc biệt đã cho tôi những trải nghiệm và những kỷ niệm tươi đẹp nhất trong quãng đời sinh viên của mình

Lời cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn bố, mẹ và chị gái đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững trãi, luôn tin tưởng và ủng hộ con để con vững bước trên con đường mình đã chọn Cảm ơn những người bạn luôn đồng hành, sẻ chia và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Một lần nữa xin gửi đến mọi người lời cảm ơn chân thành và tốt đẹp nhất!

Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Lê Thiên Bảo Long

MỤC LỤC MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼDANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh Alzheimer và giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer 3

1.1.1 Giới thiệu về bệnh Alzheimer 3

1.1.2 Giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer 3

1.2 Tổng quan về acetylcholinesterase (AChE) 5

1.2.1 Giới thiệu về acetylcholinesterase 5

1.2.2 Cấu trúc của acetylcholinesterase 6

1.3 Các chất ức chế acetylcholinesterase 10

1.3.1 Phân loại các chất ức chế AChE 10

1.3.2 Cấu trúc chung của các chất ức chế acetylcholinesterase 11

1.4 Khung tetrazol và hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất mang khung tetrazol 13

1.5 Phản ứng tổng hợp khung tetrazol 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 16

2.1.1 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 16

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Hóa học 17

2.2.2 Đánh giá hoạt tính ức chế AChE 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Hóa học 18

2.3.2 Đánh giá hoạt tính ức chế AChE 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 39

4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR) 39

4.3 Hoạt tính sinh học 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AD Alzheimer’s Disease (bệnh Alzheimer)

AChE Acetylcholinesterase AChEI Acetylcholinesterase inhibitors (chất ức chế acetylcholinesterase) ADI Alzheimer’s Disease International

(Liên đoàn bệnh Alzheimer Quốc tế)

Amyloid beta Aβ

ATCI Acetylthiocholin iodid BACE-1 β-secretase 1

BuChE Butyrylcholinesterase CAS Catalytic active site (vùng trung tâm hoạt động)

GSK-3β Glycogen synthase kinase-3 beta

hAChE Human acetylcholinesterase (acetylcholinesterase của người)

m Multiplet (đa vạch) MD Molecular dynamics (động lực học phân tử)

TcAChE Torpedo californica acetylcholinesterase

(acetylcholinesterase của cá Torpedo californica)

td Triplet of doublets (vạch chẻ đôi của vạch ba)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chất ức chế AChE 11

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 3.1 Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp của các chất IVa-e 28

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (Tonc) của các chất IVa-e 29

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-e 29

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ MS của các chất IVa-e 30

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất II, III và IVa-e 31

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất II, III và IVa-e 32

Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính ức chế AChE của các chất IVa-e 33

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Dẫn truyền thần kinh acetylcholin [22] 4

Hình 1.2 Minh họa cấu trúc của AChE bao gồm: vùng trung tâm hoạt động (CAS), vùng lòng kênh và vùng ngại biên (PAS) [60] 6

Hình 1.3 Cấu trúc 3D vùng trung tâm hoạt động của AChE [19] 7

Hình 1.4 Minh họa “cửa sau” và “cửa bên” của AChE [31] 9

Hình 1.5 Cơ chế phản ứng thủy phân ACh bởi enzym AChE [69] 10

Hình 1.6 Cấu trúc của hai dẫn chất KL1 và KL2 12

Hình 1.7 Các tương tác giữa KL1 với AChE qua mô phỏng docking phân tử 12

Hình 1.8 Cấu trúc của dẫn chất KL3-7 và hoạt tính ức chế AChE (eeAChE) trong kết quả nghiên cứu của S.T Tanoli 13

Hình 1.9 Một số dẫn chất ức chế AChE mang khung tetrazol 14

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Phản ứng tổng hợp tetrazol từ azid và nitril 14

Sơ đồ 1.2 Phản ứng tổng hợp tetrazol với xúc tác muối kẽm 15

Sơ đồ 1.3 Phản ứng tổng hợp tetrazol bằng lò vi sóng 15

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát tổng hợp các chất IVa-e 20

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II 20

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III 21

Sơ đồ 3.4 Quy trình chung tổng hợp các chất IVa-e 22

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVa 23

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất IVb 24

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất IVc 25

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp chất IVd 26

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp chất IVe 27

Sơ đồ 4.1 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tạo muối tetrazol trung gian 34

Sơ đồ 4.2 Cơ chế đề xuất cho phản ứng N-alkyl hóa 35

Sơ đồ 4.3 Cơ chế đề xuất phản ứng thủy phân este 36

Sơ đồ 4.4 Cơ chế đề xuất cho phản ứng amid hóa tạo các chất IVa-e 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Alzheimer (AD) là tình trạng thoái hóa thần kinh mãn tính và không hồi phục, đặc trưng bởi các triệu chứng như mất trí nhớ, rối loạn nhận thức và hành vi cùng với những tổn thương về tâm lý và thể chất của bệnh nhân [7, 56] Bên cạnh đó, AD cũng là nguyên nhân hàng đầu gây ra hội chứng sa sút trí tuệ Báo cáo năm 2023 của liên đoàn bệnh Alzheimer Quốc tế (ADI) chỉ ra AD chiếm khoảng 60-80% tổng số trường hợp sa sút trí tuệ [49] Cũng theo thống kê của ADI, tổng số người mắc sa sút trí tuệ trên toàn cầu năm 2019 là hơn 55 triệu người và dự kiến sẽ tăng lên 139 triệu vào năm 2050 do tình trạng già hóa dân số ngày càng tăng Cùng với đó, các chi phí liên quan trong điều trị sa sút trí tuệ cũng được dự đoán sẽ tăng gấp đôi từ 1300 tỷ đô trong năm 2019 lên 2800 tỷ đô vào năm 2030 [36] Trong năm 2015, Việt Nam có khoảng 660,000 người mắc bệnh sa sút trí tuệ và con số này được dự đoán sẽ tăng lên khoảng 1,2 triệu người vào năm 2030, gây ra nhiều gánh nặng cho hệ thống y tế và cộng đồng trong khi hệ thống chăm sóc sức khỏe của Việt Nam còn nhiều hạn chế trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh sa sút trí tuệ cũng như bệnh Alzheimer [46]

Cơ chế bệnh sinh của Alzheimer hiện nay còn là một ẩn số đối với các nhà khoa học, từ đó gây nhiều khó khăn trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh [50] Trong nhiều năm, chỉ 4 thuốc được cấp phép bởi Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm châu Âu (EMA) trong điều trị Alzheimer bao gồm 3 thuốc ức chế acetylcholinesterase (AChEI): donepezil, galantamin và rivastigmin; và 1

thuốc là chất đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartate (NMDA): memantin [39, 40] Gần

đây, hai kháng thể đơn dòng là Aducanumab và Lecanemab hoạt động dựa trên giả thuyết amyloid cũng đã được FDA phê duyệt lần lượt vào các năm 2021 và 2023 trong điều trị Alzheimer [10] Như vậy, số lượng thuốc điều trị AD còn tương đối khan hiếm cùng nhiều tác dụng không mong muốn và chi phí điều trị cao, việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới điều trị Alzheimer trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết [9, 43, 54]

Tetrazol là một dị vòng thơm 5 cạnh chứa 4 nguyên tử nitơ, 1 nguyên tử carbon và 2 nguyên tử hydro Các dẫn chất của tetrazol cho thấy nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, kháng ung thư, chống đái tháo đường và chống đông máu [30] Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, các dẫn chất mang khung tetrazol có khả năng tương tác với một số đích phân tử tiềm năng trong điều trị Alzheimer, trong đó hướng ức chế enzym acetylcholinesterase đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm [24, 32, 70]

Trên cơ sở đó, với mục đích tìm kiếm và sàng lọc những hợp chất có khả năng ức chế AChE tốt, đồng thời làm giàu cơ sở dữ liệu về những hợp chất ức chế AChE

mang khung tetrazol, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài “Tổng hợp và đánh

giá hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất thơm mới mang

khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid” với 2 mục tiêu chính:

1 Tổng hợp được khoảng 3-5 dẫn chất thơm mới mang khung

2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid

2 Bước đầu đánh giá tác dụng ức chế AChE của các dẫn chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Alzheimer và giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer

1.1.1 Giới thiệu về bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer (AD) là nguyên nhân phổ biến nhất gây chứng mất trí nhớ, đặc biệt ở người già trên 65 tuổi và cho đến nay chưa có phương pháp điều trị hiệu quả cho căn bệnh này [43] AD được tổ chức Y tế Thế giới định nghĩa là bệnh thoái hóa thần kinh không rõ nguyên căn, đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và nhận thức [29, 43] AD được Alois Alzheimer mô tả lần đầu tiên vào năm 1906 sau khi ông gặp một phụ nữ 51 tuổi tên Auguste Deter có các triệu chứng như rối loạn nhận thức, phương hướng, ảo tưởng và thay đổi hành vi [48] Alois Alzheimer tập trung vào các giai đoạn suy giảm chức năng của Auguste bao gồm: đầu tiên là suy giảm trí nhớ; sau đó là ảo tưởng và rối loạn giấc ngủ; và cuối cùng là suy giảm nhận thức và ý thức Qua kết quả đánh giá bệnh học thần kinh, Alois nhận thấy bệnh nhân có tình trạng teo não lan tỏa cùng với những mảng bám bất thường ở tế bào vỏ não [37, 48] Mặc dù đã được mô tả định tính vào năm 1906 bởi Alois, tận tới giữa những năm 1980, các nhà khoa học mới xác định được hai

dấu ấn sinh học quan trọng của AD bao gồm sự tích lũy của peptid amyloid beta (Aβ)

trong các mảng bám và sự tăng phosphoryl hóa của protein tau trong đám rối sợi thần kinh (NFTs) [37] Từ những phát hiện ban đầu này, các nghiên cứu bệnh lý thần kinh của AD đã tiếp tục phát triển và đóng góp vào việc phát hiện các triệu chứng lâm sàng của AD cũng như bệnh sa sút trí tuệ [37, 39]

Bên cạnh hai dấu ấn sinh học bao gồm sự tích lũy peptid Aβ và sự tăng

phosphoryl hóa của protein tau trong đám rối thần kinh ở não bệnh nhân, AD còn đặc trưng bởi nồng độ thấp các chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin (ACh), sự mất các sợi cholinergic, nhiễm độc thần kinh, giảm dẫn truyền thần kinh, tăng các yếu tố stress oxy hóa, viêm thần kinh mãn tính, rối loạn cân bằng kim loại và các rối loạn liên quan khác [51] Từ đó, nhiều giả thuyết về cơ chế bệnh sinh của AD đã được tìm hiểu và phát triển nhằm tìm kiếm các phương pháp tiềm năng để can thiệp, ngăn chặn và điều trị hiệu quả AD Các giả thuyết bao gồm: giả thuyết cholinergic, giả thuyết mảng bám amyloid, giả thuyết ion kim loại, giả thuyết tau, giả thuyết lysosome,… [39, 47]

1.1.2 Giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer

1.1.2.1 Acetylcholin và hệ dẫn truyền cholinergic

Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh được sử dụng bởi tất cả các tế bào thần kinh cholinergic và đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thần kinh trung ương và ngoại biên Trong hệ thần kinh trung ương, các tế bào thần kinh cholinergic cùng chất dẫn truyền thần kinh ACh chịu trách nhiệm chủ chốt trong việc điều hòa các chức năng và hoạt động sinh lý của hệ thống thần kinh bao gồm: sự tập trung, ghi nhớ, đáp ứng với stress, chu kỳ giấc ngủ và tiếp nhận thông tin từ các giác quan [13, 25]

ACh được tổng hợp ở trong các nơron tiền synap từ cholin và acetyl-coenzym A (acetyl-CoA) bởi enzym cholin acetyltransferase (ChAT), sau đó ACh được chuyển vào trong túi dự trữ của synap (synaptic vesicle) qua kênh vận chuyển acetylcholin Quá trình khử cực ở tiền synap thúc đẩy quá trình giải phóng acetylcholin từ bọc synap vào khe synap Tại đây, ACh có thể gắn với các thụ thể nicotinic hoặc muscarinic dẫn đến phản ứng kích thích hay ức chế dẫn truyền thần kinh Bên cạnh đó, ACh có thể nhanh chóng bị thủy phân và bất hoạt bởi AChE tạo acetat và cholin Cuối cùng, choline được thu hồi trở lại tiền synap thông qua kênh vận chuyển cholin (CHT1) và tiếp tục quay lại

quá trình tổng hợp ACh (Hình 1.1) [25, 61]

Hình 1.1 Dẫn truyền thần kinh acetylcholin [22]

(1): Tổng hợp acetylcholin; (2): Thủy phân acetylcholin; (3) Thu hồi choline

*Chú thích: mitochondrion: ty thể, synaptic vesicle: túi dự trữ của synap 1.1.2.2 Giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer

Giả thuyết cholinergic là một trong những giả thuyết lâu đời nhất trong quá trình nghiên cứu về AD [3] Những nghiên cứu đầu tiên đặt nền tảng cho giả thuyết cholinergic trong AD bắt đầu từ giữa những năm 1970 Những nghiên cứu này cho thấy bệnh nhân Alzheimer có tình trạng giảm sút đáng kể cholin acetyl transferase (ChAT) - enzym tổng hợp ACh ở vùng vỏ não [3, 4, 12] Hai dấu ấn quan trọng khác của AD theo giả thuyết cholinergic là sự giảm khử cực dẫn đến giảm giải phóng ACh vào khe synap và giảm thu hồi cholin ở khe synap cần thiết cho quá trình tổng hợp ACh [61] Từ đó dẫn tới suy giảm của chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong quá trình bệnh sinh của AD là ACh Những hệ quả này cho thấy sự thoái hóa của các tế bào thần kinh và sự mất dẫn truyền thần kinh cholinergic ở vỏ não và thần kinh trung ương đã góp phần gây ra bệnh, làm suy giảm đáng kể chức năng nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer [3]

Choline acetyltransferase (ChAT)

Ngoài ra, các thụ thể cholinergic bao gồm thụ thể nicotinic và muscarinic cũng cho thấy sự thay đổi trong AD Việc thiếu hụt ACh làm giảm hoạt hóa của thụ thể

muscarinic M1 dẫn tới bất hoạt protein kinase C và enzym α-secretase, từ đó dẫn tới hoạt hóa enzym glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) và enzym BACE-1 trong não bệnh nhân Alzheimer [18] Việc giảm hoạt động α-secretase và tăng hoạt tính của BACE-1 làm thay đổi con đường chuyển hóa Aβ protein dẫn tới hình thành mảng bám

amyloid beta Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc hoạt hóa quá mức glycogen synthase kinase (GSK) có nhiệm vụ phosphoryl hoá protein tau dẫn tới hình thành đám

rối sợi thần kinh và nồng độ cao các oligome Aβ gây độc [18, 26] Đối với thụ thể nicotinic, tiểu đơn vị α7 của thụ thể nicotinic sẽ bị giảm sút đáng kể gây rối loạn chức

năng các tế bào thần kinh đệm – các tế bào có chức năng quan trọng trong việc điều hòa sự dẫn truyền thần kinh, tạo môi trường đủ chất dinh dưỡng và oxy cho nơron và dọn sạch các nơron chết [38] Từ đó, các tế bào thần kinh đệm giải phóng một số cytokin

như TNF-α, IL-1β, IL-6… gây viêm lan rộng và tổn thương các khớp nối thần kinh, đồng thời gây hoạt hoá receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA) làm mở kênh Ca2+ ở màng sau synap, từ đó gây khử cực và gây độc tế bào thần kinh [56, 63] Như vậy, từ những nghiên cứu trên đã cho thấy mối quan hệ phức tạp giữa giả thuyết cholinergic và các giả thuyết khác cũng như các đặc điểm bệnh lý đa dạng trong AD [26]

1.2 Tổng quan về acetylcholinesterase (AChE)

1.2.1 Giới thiệu về acetylcholinesterase

Sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ trong AD chủ yếu do giảm chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin và rối loạn dẫn truyền hệ cholinergic Do đó, nhiều chiến lược điều trị đã được nghiên cứu nhằm làm chậm sự tiến triển các triệu chứng của AD đồng thời khôi phục nồng độ ACh trong khe synap và dẫn truyền cholinergic [8, 66] Trong đó, AChE thường được chọn làm mục tiêu của các phương pháp trị liệu với mục đích ức chế hoạt động của AChE Cơ chế hoạt động của các chất ức chế AChE đặc biệt hiệu quả do chúng làm tăng nồng độ ACh và cải thiện dẫn truyền cholinergic, từ đó góp phần phục hồi chức năng nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer [41, 66] Như vậy, AChE đã trở thành đích tác động quan trọng và tiềm năng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới trong điều trị và làm chậm quá trình tiến triển của AD [20]

AChE là một esterase thuộc họ enzym carboxylesterase AChE đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân chất dẫn truyền thần kinh ACh và được tìm thấy với nồng độ cao ở trong các tế bào hồng cầu và đặc biệt là trong hệ thần kinh trung ương tại các synap thần kinh cơ và synap cholinergic [41, 44] Mặt khác, ở trong cơ thể, ACh cũng được thủy phân bởi butyrylcholinesterase (BuChE) còn được gọi là “giả” cholinesterase BuChE là enzym cholinesterase không đặc hiệu, có tác dụng thủy phân các cholin ester khác nhau và được tìm thấy ở khắp vị trí trong cơ thể, chủ yếu ở gan, huyết tương, tuyến

tụy và hệ thần kinh trung ương của con người [33, 41, 44] Ở hệ thần kinh trung ương, AChE được coi là enzym chủ chốt trong việc thủy phân ACh trong khi BuChE chỉ đóng vai trò thứ yếu và đóng góp khoảng 10% hoạt động thủy phân acetylcholin [20, 44] Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng AChE có khả năng tương tác với các sợi amyloid đang phát triển và hình thành phức hợp AChE-Amyloid từ đó làm tăng tổng hợp các

peptid Aβ và các mảng bám Aβ hiện diện trong não bệnh nhân AD, đồng thời các phức

hợp AChE-Amyloid cũng được chứng minh là có độc tính gây tổn thương não cao hơn

so với các sợi Aβ riêng lẻ [6, 8, 19, 52] Do đó, AChE và các chất ức chế AChE dành

được nhiều sự quan tâm hơn của nhà khoa học trong các phương pháp ngăn chặn và điều trị AD [20]

1.2.2 Cấu trúc của acetylcholinesterase

Cấu trúc tinh thể của AChE lần đầu tiên được mô tả Joel Sussman và cộng sự vào

năm 1991 từ loài cá đuối điện Torpedo californica [62, 65] Cấu trúc vùng xúc tác của AChE của Torpedo californica, chuột và con người khá tương đồng với nhau và đều có

hình dạng tương tự hình elip có kích thước không gian khoảng 45x60x65 Å Bên cạnh

đó, AChE thuộc lớp α/β protein chứa 12 sợi gấp nếp β ở trung tâm và được bao quanh bởi 14 chuỗi xoắn α [11, 65] Đặc điểm nổi bật trong cấu trúc AChE là một lòng kênh

rộng ~ 5 Å và dài ~ 20 Å mở rộng dần từ bề mặt của enzym về phía đáy của nó [11, 57] Vị trí lòng kênh này có đặc điểm đáng chú ý là chứa 14 acid amin thơm được bảo toàn bao gồm Phe120, Phe288, Phe290, Phe330, Phe331, Trp84, Trp233, Trp279, Trp432,

Tyr70, Tyr121, Tyr130, Tyr334 và Tyr442 (TcAChE), trong đó hầu hết các acid amin

này đều mang chức năng riêng của chúng Vùng cấu trúc đặc biệt này có tác dụng liên kết 2 vùng cấu trúc riêng biệt bao gồm trung tâm hoạt động (CAS) nằm phía đáy enzym

và vùng ngoại biên (PAS) nằm ở “miệng” kênh enzym (Hình 1.2) [58, 68]

Hình 1.2 Minh họa cấu trúc của AChE bao gồm: vùng trung tâm hoạt động (CAS),

vùng lòng kênh và vùng ngại biên (PAS) [60]

Vùng trung tâm hoạt động của AChE nằm ở vị trí cách đáy enzym khoảng 4 Å và bao gồm 4 phân vùng quan trọng: phân vùng “esteratic”, phân vùng “anionic”, vùng

oxyanion và túi acyl (Hình 1.3) [11] Phân vùng “esteratic” ở vùng trung tâm hoạt động

có chứa bộ 3 acid amin xúc tác gồm Ser203, His447 và Glu334 (hAChE) hoặc Ser200,

His440 và Glu327 (TcAChE) chịu trách nhiệm chính trong quá trình thủy phân, cụ thể

chuyển nhóm acetyl của ACh sang acid amin Ser203 trong quá trình thủy phân [2] Bên cạnh đó, phân vùng “anionic” chứa các acid amin Trp84, Tyr130, Phe300 và Phe331

(TcAChE), trong đó Trp84 (TcAChE) hay Trp86 (hAChE) được coi là acid amin chìa

khóa đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết với nhóm amoni bậc 4 của cholin thông qua tương tác cation-π từ đó giúp định hướng chính xác ACh trong trung tâm hoạt động của enzym AChE [2, 59] Khi nghiên cứu về chức năng của vùng oxyanion và túi acyl, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vùng oxyanion của AChE có các acid amin Gly121,

Gly122 và Ala204 (hAChE) có vai trò tạo liên kết hyrdo bền vững với nhóm C=O của

ACh từ đó giúp ổn định trạng thái chuyển tiếp của phức hợp ACh-AChE (cơ chất – enzym) trong quá trình thủy phân [19]; trong khi túi acyl chứa các acid amin Phe295,

Phe297 và Phe338 (hAChE) chịu trách nhiệm chọn lọc cơ chất gắn vào trung tâm hoạt

động bằng cách ngăn chặn sự tiếp cận của các cholin este có kích thước lớn hơn và ổn định nhóm acetyl của ACh [42]

Vùng ngoại biên (PAS) (có thể gọi là vùng “anionic” ngoại biên hoặc vùng

“β-anionic”) nằm ở “miệng” enzym AChE và cách trung tâm hoạt động khoảng 14 Å Vùng PAS là vùng chứa nhiều hợp phần thơm giúp hình thành tương tác cation-π với phần choline của ACh bao gồm các acid amin Trp286, Tyr72, Tyr124, Tyr341 và Asp74

(hAChE) [28] Trong quá trình xúc tác thủy phân ACh của AChE, vùng PAS được coi

là bước đầu tiên của quá trình xúc tác thủy phân ACh do nó đóng vai trò liên kết và bắt giữ tạm thời ACh trên bề mặt enzym trong khi vùng CAS đang hoạt động [19]

Hình 1.3 Cấu trúc 3D vùng trung tâm hoạt động của AChE [19]

(A: không có ACh, B: có ACh)

Phân vùng “esteratic”: S203 (Ser203), H447 (His447), E334 (Glu334); Vùng oxyanion: E121 (Glu121), E122

(Glu122), A204 (Ala204); Vùng “anionic”: W86 (Trp86), E202 (Glu202)

Từ các nghiên cứu về cấu trúc trên của AChE, câu hỏi được đặt ra là làm thế nào đặc tính thơm của vùng PAS và lòng kênh có thể góp phần vào khả năng bắt giữ ACh từ đó mang lại hoạt tính xúc tác cao của enzym này? Điều này có thể được giải thích bởi hai nguyên nhân chính: thứ nhất, tính kỵ nước của vùng lòng kênh dẫn một hằng số điện môi cục bộ thấp, từ đó tạo ra khả năng tích điện tại vùng lòng kênh lớn hơn nhiều so với dự kiến từ một lượng nhỏ các nhóm acid; nguyên nhân thứ hai và quan trọng hơn là vùng chứa nhiều hợp phần thơm có thể cho phép sự gắn kết ban đầu của AChE với ACh thông qua tương tác cation-π ở vị trí ái lực thấp sau đó khuếch tán vào vị trí có ái lực cao hơn tại trung tâm hoạt động [16] Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng có một mômen lưỡng cực điện lớn (khoảng 505 Debye) dọc theo lòng kênh hẹp của AChE từ đó kéo ACh mang điện tích dương từ vùng PAS, qua lòng kênh hẹp và đi vào vị trí trung tâm hoạt động [16, 19] Vào năm 1994, nghiên cứu của Shafferman và các cộng sự chỉ ra rằng có một mô típ (motif) gồm 7 acid amin có tính acid bao gồm Glu84, Glu285,

Glu292, Asp349, Glu358, Glu389 và Asp390 (hAChE) ở vị trí miệng lòng kênh hẹp đã

góp phần quan trọng trong việc tạo ra mômen lưỡng cực trên và khi đột biến mô típ 7 acid amin này ở vùng PAS, tốc độ thuỷ phân của AChE giảm đi từ 2-3 lần đối với các cơ chất mang điện tích dương, còn đối với các cơ chất trung hoà về điện tích thì dường như tốc độ thuỷ phân không có thay đổi đáng kể [55] Hơn nữa, các nghiên cứu tiếp theo cũng khẳng định, có một điện thế tăng dần dọc theo chiều dài của lòng kênh được tạo lên chủ yếu bởi các acid amin Asp72 ở vị trí giữa lòng kênh và Glu199 và Glu443 ở gần phía đáy của kênh hẹp Điều này được chứng minh thông qua thí nghiệm đột biến ở vị trí Asp72 của AChE, ái lực của AChE với ACh giảm đáng kể từ 15-20 lần [16]

Tuy nhiên, mômen lưỡng cực điện trên cùng với lòng kênh hẹp cũng làm cản trở việc thoát ra của sản phẩm thủy phân cholin, làm nó bị mắc kẹt trong khe hẹp Các nhà nghiên cứu đã tranh luận trong thời gian dài về sự tồn tại của các “lối thoát” trong trung tâm hoạt động để giải phóng các sản phẩm của quá trình thủy phân như acid acetic, ion acetat, cholin và các phân tử nhỏ như nước và ion kim loại [19, 21, 68] Những “lối

thoát” này bao gồm “cửa sau” và “cửa bên” (Hình 1.4) [17] Mô hình “cửa sau” lần đầu

tiên được đề xuất bởi Sussman vào năm 1993, sau đó mô hình này được ủng hộ thông qua mô phỏng động lực học phân tử (MD) bởi McCammon và cộng sự vào năm 1994 Theo các nghiên cứu này, “cửa sau” được hình thành tại vị trí thành mỏng tại Trp86 (tương tác với nhóm amin bậc 4 của ACh) cùng với các phần dư Glu448, Tyr449 và Ile451 Trong mô phỏng MD, “cửa sau” được mở ra do sự dịch chuyển của Trp86 từ vị trí ban đầu của nó, đặc biệt là sự dịch chuyển của vòng Ω (Ω-loop) [17, 21] Cấu trúc vòng Ω của AChE được hình thành từ cầu nối disulfid giữa 2 cystein (Cys69-Cys96) là một cấu trúc tương đối linh động Trong quá trình mở “cửa sau”, toàn bộ vòng Ω di chuyển ra khỏi trục chính của lòng kênh, phần dư ở phía ngoài của vòng Ω cuộn xoắn

lại tạo hình xoắn ốc và di chuyển về phía Trp86 Sau đó, vòng Ω tương tác với Tyr449 thông qua tương tác xếp chồng thơm-thơm và “cửa sau” được mở ra dẫn các sản phẩm ra ngoài [5] Vào năm 1997, McCammon cùng cộng sự tiếp tục tìm ra sự xuất hiện của “cửa bên” thông qua mô phỏng MD “Cửa bên” chủ yếu được hình thành bởi 6 hợp phần Asp74, Thr75, Leu76, Thr83, Glu84 và Asn87 và cơ chế mở “cửa bên” cũng tương tự như mở “cửa sau” do chủ yếu dựa trên sự thay đổi vị trí của các hợp phần trên [17]

Hình 1.4 Minh họa “cửa sau” và “cửa bên” của AChE [31]

Lòng kênh hẹp: khối màu xanh lá; “Cửa sau”: khối màu xanh lam; “Cửa bên”: khối màu hồng; Ω-loop: đường màu cam Như vậy, AChE là một cấu trúc vô cùng phức tạp với các vùng CAS, PAS và đặc biệt là lòng kênh hẹp, tuy nhiên, AChE vẫn cho thấy hiệu quả trong việc thủy phân ACh qua 2 giai đoạn liên tiếp acyl hóa và deacyl hóa thông qua nghiên cứu mô phỏng động lực học phân tử QM/MM [69] Cụ thể, trong giai đoạn acyl hóa, sự chuyển proton (H) từ nhóm OH của Ser203 sang N của His447 giúp hình thành tác nhân ái nhân mạnh O-

trên Ser203, tác nhân ái nhân này tấn công vào nhóm C=O của ACh từ đó tạo thành

phức tứ diện trung gian (Tl1) Ở trạng thái phức tứ diện trung gian, proton được chuyển

sang nhóm rời đi của ACh và liên kết dạng kéo bị phá vỡ tạo thành phức hợp acyl-enzym

(EA1) với sự giải phóng choline Ở giai đoạn deacetyl hóa, phân tử nước tấn công vào carbonyl của nhóm acetyl dẫn tới hình thành phức tứ diện trung gian thứ hai (Tl2) Sau

đó, proton được chuyển từ His447 sang nguyên tử O của phức acetyl-serin và liên kết

dạng kéo bị phá vỡ, tạo acid acetic và hoàn nguyên AChE (Hình 1.5) [69]

Hình 1.5 Cơ chế phản ứng thủy phân ACh bởi enzym AChE [69]

1.3 Các chất ức chế acetylcholinesterase

1.3.1 Phân loại các chất ức chế AChE

Các chất ức chế AChE (AChEI) làm ngăn quá trình thủy phân ACh từ đó tăng nồng độ và thời gian tác dụng của chất dẫn truyền thần kinh ACh Ngoài ra, chúng cũng có thể giúp cải thiện một số chức năng về nhận thức và hành vi của bệnh nhân Alzheimer ở trong giai đoạn nhẹ của bệnh [11, 66] Dựa trên cơ chế hoạt động, các AChEI có thể được chia thành 2 nhóm: chất ức chế thuận nghịch và chất ức chế không thuận nghịch

(Bảng 1.1) Các chất ức chế AChE thuận nghịch liên kết với AChE qua tương tác không

cộng hóa trị (liên kết hydro, tương tác cation-π, tương tác π-π, ) dễ dàng bị phá vỡ và trả lại chức năng của enzym Ngược lại, các chất ức chế AChE không thuận nghịch tạo liên kết cộng hóa trị bền vững với AChE Các liên kết này không thể bị phá vỡ khiến enzym bị bất hoạt vĩnh viễn từ đó dẫn đến kích thích quá mức các thụ thể cholinergic từ đó gây độc và ảnh hưởng nghiêm trọng hệ thần kinh trung ương Do đó, các chất ức chế thuận nghịch AChE thường được ứng dụng trong lâm sàng để điều trị AD, trong khi các chất ức chế không thuận nghịch thường sử dụng làm thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và chất độc hóa học trong chiến tranh [59]

Bảng 1.1 Một số chất ức chế AChE

Chất ức chế AChE thuận nghịch Chất ức chế AChE không thuận nghịch

1.3.2 Cấu trúc chung của các chất ức chế acetylcholinesterase

Như đã trình bày trong phần 1.2.2, cấu trúc của AChE được chia làm ba hợp phần quan trọng: vùng trung tâm hoạt động (CAS), lòng kênh hẹp và vùng ngoại biên (PAS) Từ đó, việc thiết kế các dẫn chất có khả năng tương tác với AChE dựa trên ba hợp phần trên là một cách tiếp cận hiệu quả để tìm kiếm các hợp chất tiềm năng ức chế AChE

Năm 2022, Xinnan Li cùng cộng sự công bố 35 dẫn chất mới tổng hợp theo hướng ức chế AChE với cấu trúc đi từ chất dẫn đường donepezil Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thay thế dị vòng indanon của donepezil thành dị vòng isochromanon, đồng thời thay thế vòng piperidin thành dị vòng thơm pyridin có gắn thêm nhóm acetyl hoặc aminocarbonyl với mục đích làm tăng khả năng tương tác của chất ức chế với AChE Kết quả thu được 14 dẫn chất có khả năng ức chế AChE tốt hơn chất chứng dương là donepezil (IC50 = 12,06 + 0,01 nM), trong đó dẫn chất KL1 (Hình 1.6) có khả năng ức

chế AChE tốt nhất với IC50 = 1,61 + 0,02 nM Qua nghiên cứu mô phỏng docking, dẫn

chất KL1 cho thấy kết quả tương tác với các vị trí quan trọng trong cấu trúc của AChE (Hình 1.7) Cụ thể, dị vòng isochromanon hình thành tương tác π-π với Trp286 tại trung

tâm vùng PAS, đồng thời hai vòng thơm pyridin và benzen cũng cho thấy tương tác xếp chồng π-π lần lượt với Tyr337 và Trp86 tại vùng CAS của AChE Ngoài ra, nhóm acetyl và nguyên tử N trên vòng pyridin cũng cho thấy các tương tác hydro và tương tác π-π với các acid amin Tyr124, Tyr337 và Trp86 của AChE, từ đó tăng khả năng gắn và ức

chế AChE của KL1 [35] Một nghiên cứu khác vào năm 2020 của Yao Guo và cộng sự

cho thấy dẫn chất KL2 (Hình 1.6) có hoạt tính ức chế AChE tốt (IC50 = 0,39 + 0,04

µM đối với eeAChE) cũng cho thấy các tương tác π-π của hợp phần N-benzylpiperidin

với Trp86 tại vùng CAS và tương tác π-π của dị vòng indolin-2-on với Trp286 và Tyr341 tại vùng PAS [23]

Hình 1.6 Cấu trúc của hai dẫn chất KL1 và KL2

Hình 1.7 Các tương tác giữa KL1 với AChE qua mô phỏng docking phân tử

Liên kết hydro: màu đen; tương tác π-π: màu nâu; tương tác cation-π: đường màu xanh dương Năm 2019, S.T Tanoli đã công bố kết quả tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế

AChE của một số dẫn chất bis-carbazol Kết quả mô phỏng docking chỉ ra hợp phần

carbazol có khả năng hình thành liên kết xếp chồng π-π với Trp84 (ở vùng CAS) và

Trp279 (ở vùng PAS) của eeAChE Bên cạnh đó, kết quả thử hoạt tính ức chế AChE

cho thấy việc thay đổi độ dài và cấu trúc cầu nối giữa hai dị vòng carbazol của các hợp

chất KL3-7 (Hình 1.8) cũng làm thay đổi đáng kể khả năng ức chế AChE Cụ thể, khi tăng độ dài cầu nối alkyl giữa hai dị vòng carbazol từ một (KL3) lên hai (KL4) và sáu (KL5) nhóm -CH2 , hoạt tính ức chế AChE tăng mạnh lần lượt gấp 5 lần và 17 lần Đồng thời, thay thế một nhóm -CH2 của dẫn chất KL4 bằng nhóm C=O (KL6) hay thay thế vùng cầu nối alkyl (KL4) bằng dị vòng triazin (KL7) đều giảm mạnh hoạt tính ức chế

AChE Điều này có thể do lòng kênh AChE có độ dài xác định và tương đối hẹp, nên cấu trúc vùng cầu nối gồm sáu nhóm CH2 có thể tối ưu hóa vị trí gắn của carbazol lên

hai vùng CAS và PAS, từ đó làm tăng khả năng ức chế AChE Thêm vào đó, việc thay các cấu trúc cồng kềnh như triazin trên vùng cầu nối làm giảm khả năng chất ức chế vào được vị trí trung tâm hoạt động dẫn đến làm giảm hoạt tính ức chế AChE [64]

Hình 1.8 Cấu trúc của dẫn chất KL3-7 và hoạt tính ức chế AChE (eeAChE) trong kết

quả nghiên cứu của S.T Tanoli Như vậy từ những nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các đặc điểm cấu trúc quan trọng của một chất ức chế AChE cần bao gồm:

- Phần liên kết với vùng CAS và vùng PAS: thường là vòng thơm vòng thơm hay dị vòng thơm tạo liên kết với vùng CAS và vùng PAS qua các tương tác thích hợp như liên kết π- π, liên kết hyrdo,

- Cầu nối liên kết với độ dài và cấu trúc thích hợp nối giữa hai phần cấu trúc tương tác với vùng CAS và vùng PAS ở trên

1.4 Khung tetrazol và hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất mang khung tetrazol

Tetrazol là một dị vòng thơm năm cạnh chứa một nguyên tử carbon và bốn nguyên tử nitơ Từ những năm 1950, các dẫn chất chứa khung tetrazol được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, hóa sinh, y học, dược lý và nhiều lĩnh vực quan trọng khác [67] Về mặt hóa học, khung tetrazol có tính acid nhờ sự có mặt của bốn nguyên tử nitơ và được coi là cấu đẳng sinh học của các nhóm acid carboxylic [30] Bên cạnh đó, các dẫn chất mang khung tetrazol dành được nhiều sự chú ý của các nhà khoa học vì có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, kháng

ung thư, kháng lao, chống đái tháo đường và chống đông máu [30] Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các dẫn chất tetrazol có khả năng tương tác với một số đích phân tử tiềm năng trong điều trị AD, trong đó có nghiên cứu về các dẫn chất tetrazol hướng ức chế AChE đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm [24, 32, 70].

Năm 2017, Ali Dişli đã tổng hợp được các dẫn chất mang khung tetrazol hướng ức chế AChE và thu được hai dẫn chất có khả năng ức chế AChE ở nồng độ micromol

là KL8 (IC50 = 1,75 µM) và KL9 (IC50 = 1,84 µM) (Hình 1.9), tuy nhiên hoạt tính ức

chế này vẫn thấp hơn so với chất chứng dương là donepezil.HCl (IC50 = 7,78x10-3 µM) [15] Vào đầu năm 2024, Niels V Heise cùng cộng sự công bố kết quả tổng hợp và đánh giá hoạt tính ức chế AChE của 5 dẫn chất mang khung tetrazol mới, kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy cả 5 dẫn chất tổng hợp được đều cho hoạt tính ức chế AChE ở

khoảng nồng độ 10 µM; trong đó có dẫn chất KL10 (Hình 1.9) có khả năng ức chế

AChE tốt nhất là 96,8%, cao hơn chất chứng dương là galantamin (88,9% ở nồng độ 10

µM) Qua kết quả mô phỏng docking cho thấy vòng tetrazol của KL10 có thể làm tăng

khả năng tương tác của chất ức chế với AChE thông qua liên kết hydro với Gly118 tại vùng CAS [27]

Hình 1.9 Một số dẫn chất ức chế AChE mang khung tetrazol 1.5 Phản ứng tổng hợp khung tetrazol

Phương pháp hiệu quả nhất trong tổng hợp khung tetrazol là đi từ dẫn xuất azid

thông qua phản ứng cộng đóng vòng [3+2] giữa azid và nitril được trình bày theo Sơ đồ 1.1 [34, 45]

Sơ đồ 1.1 Phản ứng tổng hợp tetrazol từ azid và nitril

Một số nghiên cứu về tổng hợp các dẫn chất tetrazol chỉ ra rằng có thể rút ngắn thời gian phản ứng và nâng cao hiệu suất tổng hợp tetrazole khi sử dụng các xúc tác kim loại hay lò vi sóng Phản ứng của natri azid với nitril tạo dẫn chất tetrazol diễn ra dễ dàng trong nước với xúc tác là muối kẽm Phản ứng này có thể sử dụng nitril thơm, alkyl

nitril hay vinyl nitril (Sơ đồ 1.2) [14]

Sơ đồ 1.2 Phản ứng tổng hợp tetrazol với xúc tác muối kẽm

Các tetrazol được điều chế với hiệu suất tốt và thời gian phản ứng ngắn bằng cách cho nitril phản ứng với natri azid và triethylamin trong nitrobenzen sử dụng lò vi sóng Với phương pháp này, ngay cả các tetrazol bị cản trở không gian và các tetrazol bị ảnh

hưởng bởi các nhóm cho điện tử đều có thể tổng hợp được (Sơ đồ 1.3) [53]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

Các dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ một số quốc gia như Đức, Ấn Độ, Mỹ, Nhật Bản và Trung Quốc Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp mà không cần qua tinh chế thêm và được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc

13 N,N-dimethylformamid (DMF) Trung Quốc

18 Bản mỏng silica gel 60 F254 Đức

20

ethylcarbodiimid hydroclorid

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-(EDC.HCl)

Trung Quốc

21 Hydroxybenzotriazol (HOBt) Trung Quốc

24 Natri sulfat khan (Na2SO4) Trung Quốc

25 Natri bicarbonat (NaHCO3) Trung Quốc 26 eeAChE (acetylcholinesterase từ

27 5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic

28 Acetylthiocholin iodid (ATCI) Mỹ

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 - 100 ml, bình chiết, sinh hàn hồi lưu, ống nghiệm, ống đong, pipet, phễu thủy tinh, phễu lọc Buchner, chất trợ lọc Celite, cốc có mỏ các loại, lọ thủy tinh penicilin

- Bình sắc ký Camag, đèn tử ngoại Camag bước sóng 254 nm và 366 nm, bản mỏng silica gel 60 F254

- Cân phân tích Shimadzu, cân kĩ thuật Shimadzu - Tủ lạnh Memmert, tủ sấy Memmert

- Máy cất quay Buchi R-210, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RCT, máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

- Máy đo phổ hồng ngoại: FTIR Affinity-1S-Shimadzu (Nhật Bản) - Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối: Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz - Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Tủ giữ mẫu -18oC (DIOS) - Máy đọc đĩa đa chức năng VarioskanLux

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất tổng hợp được bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng

2.2.1.3 Khẳng định cấu trúc

- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng tử hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

2.2.2 Đánh giá hoạt tính ức chế AChE

Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được đánh giá khả năng ức chế AChE bằng phương pháp Ellman với một số điều chỉnh để phù hợp với điều kiện thực nghiệm tại trường Đại học Dược Hà Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Hóa học

2.3.1.1 Tổng hợp hóa học

Dựa trên những phản ứng và điều kiện đã được khảo sát từ trước để tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc như dự kiến Các phản ứng đã sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Phản ứng cộng đóng vòng [3+2] từ aryl nitril và azid vô cơ tạo vòng tetrazol

- Phản ứng N-alkyl hóa giữa muối tetrazol và alkyl halid

- Phản ứng thủy phân ester tạo acid carboxylic - Phản ứng amid hóa giữa acid carboxylic và amin thơm Các phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh là bản mỏng silica gel 60 F254, quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm

Hỗn hợp sau phản ứng được tinh chế bằng các kỹ thuật phù hợp với từng giai đoạn, bao gồm các kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng và sắc ký cột

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các sản phẩm sau khi tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng hai phương pháp: - Sắc ký lớp mỏng:

+ Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút

+ Pha động: hệ dung môi EA:n-hexan (1:1 và 1:2) và DCM:MeOH (24:1)

+ Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm - Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

2.3.1.3 Khẳng định cấu trúc

Các chất sau khi được tổng hợp, tinh chế và đánh giá là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon (1H-NMR và 13C-NMR):

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity-1S-Shimadzu (Nhật Bản), khoa Hóa học –Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Phổ được ghi ở độ phân giải 4 cm-1

- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hoạt động theo phương pháp ion hóa phun mù điện tử ESI (+), dung môi hòa tan là MeOH hoặc MeCN

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AC - 500 MHz tại Khoa Hóa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz

với dung môi là DMSO-d6 và CDCl3 Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng

đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K

2.3.2 Đánh giá hoạt tính ức chế AChE

Nguyên tắc: đánh giá hoạt tính ức chế AChE của các chất tổng hợp được e) bằng phương pháp Ellman Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất acetylthiocholin

(IVa-iodid (ATCI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin Sau đó thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic (thuốc thử Ellman, DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitrobenzoic có màu vàng Chất tham chiếu được sử dụng là galantamin hydrobromid được mua từ TCI (Nhật Bản) Đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm với máy đọc đĩa VarioskanLux

Quy trình thực hiện: 20 𝜇L ở các nồng độ khác nhau của các dung dịch thử nghiệm trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0, 20 𝜇L dung dịch DTNB 19,2 mM, 20 𝜇L dung dịch ATCI 19,2 mM và 20 𝜇L dung dịch AChE 0,25 IU/ml, được thêm dung dịch đệm phosphat pH 8,0 đến khi tổng thể tích là 100 𝜇L Ủ hỗn hợp ở 25oC trong 30 phút, sau đó đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 412 nm Mỗi chất được thử khả năng ức chế AChE ở nồng độ 75 𝜇M và 256 𝜇M, phép thử được tiến hành lặp lại ba lần Phần trăm (%) ức chế AChE của các chất ở nồng độ thử nghiệm được tính theo công thức:

% ức chế = 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử−𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘

𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘 𝑥 100%

Trong đó: - Blank: ATCI, DTNB trong dung dịch đệm pH 8,0

- Control: ATCI, DTNB và enzym trong dung dịch đệm pH 8,0 - Mẫu thử: chất thử (hoặc chứng galantamin hydrobromid), ATCI, DTNB và enzym trong dung dịch đệm pH 8,0

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Hóa học

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Sơ đồ sử dụng để tổng hợp 5 dẫn chất mục tiêu được trình bày dưới đây:

(a) i) NaN3, ZnCl2, DMF, 120oC, 3h; ii) ethyl 2-cloroacetat, 60oC, 3h; (b) i) NaOH, MeOH, nhiệt độ phòng, 30

phút; ii) HCl đặc, pH=1-2;(c) Dẫn chất của anilin/ pyridin-2-amin, HOBt, EDC.HCl, TEA, DCM, DMF, nhiệt độ

phòng, 4h.

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát tổng hợp các chất IVa-e

3.1.1.1 Tổng hợp ethyl 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetat (II)

Hợp chất trung gian ethyl 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetat (II) được

tổng hợp thông qua hai phản ứng liên tiếp trong một bình phản ứng, bao gồm: phản ứng cộng đóng vòng [3+2] từ aryl nitril và natri azid tạo vòng tetrazol, sau đó là phản ứng

N-alkyl hóa giữa muối tetrazoat trung gian với tác nhân là 2-cloroethyl acetat Phản ứng

được minh họa theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II  Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 521 mg pyridin-2-carbonitril (I) (5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng)

vào bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml trong khoảng 5 ml DMF

- Thêm tiếp 488 mg NaN3 (7,5 mmol, tương ứng 1,5 đương lượng) và 68,15 mg ZnCl2 (0,5 mmol, tương ứng 0,1 đương lượng) vào bình phản ứng, gia nhiệt cho phản ứng và đun hồi lưu ở 120oC trong 3 giờ

- Sau 3 giờ, hạ nhiệt độ của phản ứng xuống 60oC, thêm vào hỗn hợp phản ứng 800 µl ethyl 2-cloroacetat (7,5 mmol, tương ứng 1,5 đương lượng), duy trì phản ứng ở 60oC trong 3 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan (1:1)

 Xử lý phản ứng

- Hỗn hợp sau khi phản ứng xong được làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 25 ml Na2CO3 cho kết tủa hoàn toàn rồi lọc qua phễu lọc Buchner có chất trợ lọc là Celite, thu lấy dịch lọc

- Dịch lọc được chiết với EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA - Dịch chiết EA được chiết lại 2 lần với nước cất lạnh (2 lần, mỗi lần 30 ml) - Pha EA được làm khan bằng Na2SO4 khan, cô quay loại dung môi

- Tách 2 đồng phân bằng sắc ký cột silica gel với pha động là EA:n-hexan (1:1)

thu được chất II – đồng phân N1 (phân cực hơn) và đồng phân N2 (kém phân cực hơn)

Sử dụng đồng phân N1 để tiếp tục các phản ứng sau

 Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 60% (699 mg) - Rf = 0,4 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

3.1.1.2 Tổng hợp acid 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetic (III)

Hợp chất trung gian acid 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetic (III) được

tổng hợp từ este II thông qua hai giai đoạn: thủy phân este II trong môi trường kiềm

bằng NaOH được tiến hành trong dung môi MeOH, sau đó, acid hóa hỗn hợp sau phản ứng bằng dung dịch HCl đặc theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III  Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 2,33 g chất rắn II (10 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) hoàn toàn

trong 20 ml methanol (MeOH) trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml

- Cân 800 mg NaOH (20 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) trong lọ thủy tinh penicilin, thêm lượng nước tối thiểu để hòa tan hoàn toàn NaOH, thêm từ từ dung dịch NaOH vừa pha vào bình phản ứng

- Khuấy trên bếp từ khoảng 30 phút Theo dõi phản ứng bằng TLC hệ pha động

EA:n-hexan (1:1)

 Xử lý phản ứng

- Sau khi phản ứng kết thúc, thêm từ từ HCl đặc vào bình phản ứng, lắc đều và theo dõi đến pH khoảng 1-2

- Hỗn hợp phản ứng được cô quay dưới áp suất giảm để loại MeOH thu được

khối cắn bao gồm muối NaCl và acid III

- Thêm hỗn hợp MeOH:DCM (2:1) vào khối cắn, lọc loại muối NaCl trên phễu lọc và thu lấy dịch lọc Rửa muối nhiều lần bằng hỗn hợp MeOH:DCM (2:1) để thu được tối đa lượng acid

- Toàn bộ dịch lọc được cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi, sấy cắn

trong tủ sấy chân không thu được acid III  Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

- Hiệu suất: 90% (1,85 g) - Rf = 0,3 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) - Khẳng định cấu trúc bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

3.1.1.2 Tổng hợp các chất mục tiêu IVa-e

Các chất mục tiêu IVa-e được tổng hợp từ acid III bằng phản ứng amid hóa với

các amin khác nhau trong dung môi DCM có mặt DMF với xúc tác là HOBt, EDC.HCl và triethylamin (TEA) ở nhiệt độ phòng theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.4 Quy trình chung tổng hợp các chất IVa-e

a) Tổng hợp N-(4-bromophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVa)

Chất IVa được tổng hợp thông qua phản ứng amid hóa giữa chất trung gian III

và 4-bromoanilin với xúc tác HOBt, EDC.HCl trong dung môi DMF và DCM được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVa  Tiến hành phản ứng

- Cân khoảng 103 mg (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) acid III vào bình

cầu đáy tròn dung tích 50 ml, hòa tan bằng lượng DMF vừa đủ

- Thêm lần lượt vào bình phản ứng 68 mg HOBt (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng), 96 mg EDC.HCl (1,0 đương lượng), 103 mg 4-bromoanilin (0,6 mmol, tương ứng 1,2 đương lượng), 140 µl TEA (1,0 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) vào bình phản ứng

- Thêm 15 ml DCM vào hỗn hợp phản ứng và để khuấy trộn trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng

- Theo dõi phản ứng bằng TLC trong hệ dung môi EA:n-hexan (1:1)

 Xử lý phản ứng

- Hỗn hợp phản ứng sau phản ứng hoàn toàn được cô quay loại dung môi - Thêm 25 ml NaHCO3 10% vào bình phản ứng, chiết với dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được làm khan bằng Na2SO4 khan - Cô quay loại dung môi thu lấy cắn

- Tinh chế bằng sắc ký cột với pha động là EA:n-hexan (6:4), cô quay dưới áp

suất giảm, sấy cắn đến khô trong tủ sấy chân không thu được chất IVa  Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 63% (113 mg) - Rf = 0,31 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

b) Tổng hợp N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid

(IVb)

Chất IVb được tổng hợp thông qua phản ứng amid hóa giữa chất trung gian III

và 2-fluoro-4-iodoanilin với xúc tác HOBt, EDC.HCl trong dung môi DMF và DCM được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất IVb  Tiến hành phản ứng

- Cân khoảng 103 mg (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) acid III vào bình

cầu đáy tròn dung tích 50 ml, hòa tan bằng lượng DMF vừa đủ

- Thêm lần lượt vào bình phản ứng 68 mg HOBt (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng), 96 mg EDC.HCl (1,0 đương lượng), 143 mg 2-fluoro-4-iodoanilin (0,6 mmol, tương ứng 1,2 đương lượng), 140 µl TEA (1,0 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) vào bình phản ứng

- Thêm 15 ml DCM vào hỗn hợp phản ứng và để khuấy trộn trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng

- Theo dõi phản ứng bằng TLC trong hệ dung môi EA:n-hexan (1:1)

 Xử lý phản ứng

- Hỗn hợp phản ứng sau phản ứng hoàn toàn được cô quay loại dung môi - Thêm 25 ml NaHCO3 10% vào bình phản ứng, chiết với dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được làm khan bằng Na2SO4 khan - Cô quay loại dung môi thu lấy cắn

- Tinh chế bằng sắc ký cột với pha động là EA:n-hexan (6:4), cô quay dưới áp

suất giảm, sấy cắn đến khô trong tủ sấy chân không thu được chất IVb

 Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 60% (127 mg) - Rf = 0,36 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

c) Tổng hợp N-(4-methoxyphenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid

(IVc)

Chất IVc được tổng hợp thông qua phản ứng amid hóa giữa chất trung gian III

và 4-methoxyanilin với xúc tác HOBt, EDC.HCl trong dung môi DMF và DCM được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất IVc  Tiến hành phản ứng

- Cân khoảng 103 mg (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) acid III vào bình

cầu đáy tròn dung tích 50 ml, hòa tan bằng lượng DMF vừa đủ

- Thêm lần lượt vào bình phản ứng 68 mg HOBt (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng), 96 mg EDC.HCl (1,0 đương lượng), 74 mg 4-methoxyanilin (0,6 mmol, tương ứng 1,2 đương lượng), 140 µl TEA (1,0 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) vào bình phản ứng

- Thêm 15 ml DCM vào hỗn hợp phản ứng và để khuấy trộn trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng

- Theo dõi phản ứng bằng TLC trong hệ dung môi EA:n-hexan (1:1)

 Xử lý phản ứng

- Hỗn hợp phản ứng sau phản ứng hoàn toàn được cô quay loại dung môi - Thêm 25 ml NaHCO3 10% vào bình phản ứng, chiết với dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được làm khan bằng Na2SO4 khan - Cô quay loại dung môi thu lấy cắn

- Tinh chế bằng sắc ký cột với pha động là EA:n-hexan (6:4), cô quay dưới áp

suất giảm, sấy cắn đến khô trong tủ sấy chân không thu được chất IVc

 Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 66% (102 mg) - Rf = 0,31 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

d) Tổng hợp N-(2,4-dimethoxyphenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid

(IVd)

Chất IVd được tổng hợp thông qua phản ứng amid hóa giữa chất trung gian III

và 2,4-dimethoxyanilin với xúc tác HOBt, EDC.HCl trong dung môi DMF và DCM được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp chất IVd  Tiến hành phản ứng

- Cân khoảng 103 mg (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) acid III vào bình

cầu đáy tròn dung tích 50 ml, hòa tan bằng lượng DMF vừa đủ

- Thêm lần lượt vào bình phản ứng 68 mg HOBt (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng), 96 mg EDC.HCl (1,0 đương lượng), 92 mg 2,4-dimethoxyanilin (0,6 mmol, tương ứng 1,2 đương lượng), 140 µl TEA (1,0 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) vào bình phản ứng

- Thêm 15 ml DCM vào hỗn hợp phản ứng và để khuấy trộn trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng

- Theo dõi phản ứng bằng TLC trong hệ dung môi EA:n-hexan (1:1)

 Xử lý phản ứng

- Hỗn hợp phản ứng sau phản ứng hoàn toàn được cô quay loại dung môi - Thêm 25 ml NaHCO3 10% vào bình phản ứng, chiết với dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được làm khan bằng Na2SO4 khan - Cô quay loại dung môi thu lấy cắn

- Tinh chế bằng sắc ký cột với pha động là EA:n-hexan (6:4), cô quay dưới áp

suất giảm, sấy cắn đến khô trong tủ sấy chân không thu được chất IVd

 Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 56% (96 mg) - Rf = 0,26 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

e) Tổng hợp N-(pyridin-2-yl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVe)

Chất IVe được tổng hợp thông qua phản ứng amid hóa giữa chất trung gian III

và pyridin-2-amin với xúc tác HOBt, EDC.HCl trong dung môi DMF và DCM được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp chất IVe  Tiến hành phản ứng

- Cân khoảng 103 mg (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) acid III vào bình

cầu đáy tròn dung tích 50 ml, hòa tan bằng lượng DMF vừa đủ

- Thêm lần lượt vào bình phản ứng 68 mg HOBt (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng), 96 mg EDC.HCl (1,0 đương lượng), 57 mg pyridin-2-amin (0,6 mmol, tương ứng 1,2 đương lượng), 140 µl TEA ( 1,0 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) vào bình phản ứng

- Thêm 15 ml DCM vào hỗn hợp phản ứng và để khuấy trộn trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng

- Theo dõi phản ứng bằng TLC trong hệ dung môi EA:n-hexan (1:1)

 Xử lý phản ứng

- Hỗn hợp phản ứng sau phản ứng hoàn toàn được cô quay loại dung môi - Thêm 25 ml NaHCO3 10% vào bình phản ứng, chiết với dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được làm khan bằng Na2SO4 khan - Cô quay loại dung môi thu lấy cắn

- Tinh chế bằng sắc ký cột với pha động là EA:n-hexan (6:4), cô quay dưới áp

suất giảm, sấy cắn đến khô trong tủ sấy chân không thu được chất IVe

 Kết quả

- Cảm quan: chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 68% (96 mg) - Rf = 0,22 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

 Hiệu suất tổng hợp và chỉ số hóa lý của các chất IVa-e được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3.1 Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp của các chất IVa-e

3.1.2.2 Đo nhiệt độ nóng chảy

Các chất IVa-e đều ở thể rắn, được tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy bằng

máy đo chuyên dụng

Kết quả nhiệt độ nóng chảy được trình bày ở Bảng 3.2, cho thấy các chất IVa-e

đều có nhiệt độ nóng chảy xác định có khoảng dao động nhiệt độ hẹp từ 1-2oC

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (To

Dựa trên kết quả xác định Rf và nhiệt độ nóng chảy trên có thể sơ bộ khẳng định

tất cả các chất IVa-e đều tinh khiết và đủ điều kiện để thực hiện các bước khẳng định

cấu trúc bằng các phương pháp phổ

3.1.3 Khẳng định cấu trúc

Các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) được

sử dụng để khẳng định cấu trúc của các chất IVa-e đã được tổng hợp Kết quả ghi phổ

và phân tích phổ được trình bày trong bảng dưới đây và phần phụ lục

Chất

Số sóng ứng với các dao động (cm-1)

N-H (amid)

C-H (aromatic) C=O C=N

C=C (aromatic)

C-X (aromatic)

Ghi chú:  là các dao động hóa trị, X là các halogen

Nhận xét: Dựa trên Bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1-5) có thể sơ bộ nhận ra sự

hiện diện của các nhóm chức thông qua vị trí, cường độ và hình dạng pic như dao động của liên kết N-H amid, C=O amid, C=C thơm và C=N Tuy nhiên, dữ liệu phổ IR này

chưa thể cung cấp đầy đủ cơ sở để khẳng định cấu trúc chất IVa-e Do đó, các chất được

tiếp tục tiến hành đo phổ HRMS và NMR

IVb C14H10FIN6O 424,18 425,0018 425,0021

IVc C15H14N6O2 310,32 311,1251 311,1256

IVd C16H16N6O3 340,34 341,1357 341,1360