lê thiên bảo long tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất thơm mới mang khung 2 5 pyridin2 yl 1h tetrazol 1 ylacetamid

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, các dẫn chất mang khung tetrazol có khả năng tương tác với một số đích phân tử tiềm năng trong điều trị Alzheimer, trong đó hướng ức chế enzym ac

TỔNG QUAN

Bệnh Alzheimer và giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer

1.1.1 Giới thiệu về bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer (AD) là nguyên nhân phổ biến nhất gây chứng mất trí nhớ, đặc biệt ở người già trên 65 tuổi và cho đến nay chưa có phương pháp điều trị hiệu quả cho căn bệnh này [43] AD được tổ chức Y tế Thế giới định nghĩa là bệnh thoái hóa thần kinh không rõ nguyên căn, đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và nhận thức [29, 43] AD được Alois Alzheimer mô tả lần đầu tiên vào năm 1906 sau khi ông gặp một phụ nữ 51 tuổi tên Auguste Deter có các triệu chứng như rối loạn nhận thức, phương hướng, ảo tưởng và thay đổi hành vi [48] Alois Alzheimer tập trung vào các giai đoạn suy giảm chức năng của Auguste bao gồm: đầu tiên là suy giảm trí nhớ; sau đó là ảo tưởng và rối loạn giấc ngủ; và cuối cùng là suy giảm nhận thức và ý thức Qua kết quả đánh giá bệnh học thần kinh, Alois nhận thấy bệnh nhân có tình trạng teo não lan tỏa cùng với những mảng bám bất thường ở tế bào vỏ não [37, 48] Mặc dù đã được mô tả định tính vào năm

1906 bởi Alois, tận tới giữa những năm 1980, các nhà khoa học mới xác định được hai dấu ấn sinh học quan trọng của AD bao gồm sự tích lũy của peptid amyloid beta (Aβ) trong các mảng bám và sự tăng phosphoryl hóa của protein tau trong đám rối sợi thần kinh (NFTs) [37] Từ những phát hiện ban đầu này, các nghiên cứu bệnh lý thần kinh của AD đã tiếp tục phát triển và đóng góp vào việc phát hiện các triệu chứng lâm sàng của AD cũng như bệnh sa sút trí tuệ [37, 39]

Bên cạnh hai dấu ấn sinh học bao gồm sự tích lũy peptid Aβ và sự tăng phosphoryl hóa của protein tau trong đám rối thần kinh ở não bệnh nhân, AD còn đặc trưng bởi nồng độ thấp các chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin (ACh), sự mất các sợi cholinergic, nhiễm độc thần kinh, giảm dẫn truyền thần kinh, tăng các yếu tố stress oxy hóa, viêm thần kinh mãn tính, rối loạn cân bằng kim loại và các rối loạn liên quan khác [51] Từ đó, nhiều giả thuyết về cơ chế bệnh sinh của AD đã được tìm hiểu và phát triển nhằm tìm kiếm các phương pháp tiềm năng để can thiệp, ngăn chặn và điều trị hiệu quả

AD Các giả thuyết bao gồm: giả thuyết cholinergic, giả thuyết mảng bám amyloid, giả thuyết ion kim loại, giả thuyết tau, giả thuyết lysosome,… [39, 47]

1.1.2 Giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer

1.1.2.1 Acetylcholin và hệ dẫn truyền cholinergic

Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh được sử dụng bởi tất cả các tế bào thần kinh cholinergic và đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thần kinh trung ương và ngoại biên Trong hệ thần kinh trung ương, các tế bào thần kinh cholinergic cùng chất dẫn truyền thần kinh ACh chịu trách nhiệm chủ chốt trong việc điều hòa các chức năng và hoạt động sinh lý của hệ thống thần kinh bao gồm: sự tập trung, ghi nhớ, đáp ứng với stress, chu kỳ giấc ngủ và tiếp nhận thông tin từ các giác quan [13, 25]

4 ACh được tổng hợp ở trong các nơron tiền synap từ cholin và acetyl-coenzym A (acetyl-CoA) bởi enzym cholin acetyltransferase (ChAT), sau đó ACh được chuyển vào trong túi dự trữ của synap (synaptic vesicle) qua kênh vận chuyển acetylcholin Quá trình khử cực ở tiền synap thúc đẩy quá trình giải phóng acetylcholin từ bọc synap vào khe synap Tại đây, ACh có thể gắn với các thụ thể nicotinic hoặc muscarinic dẫn đến phản ứng kích thích hay ức chế dẫn truyền thần kinh Bên cạnh đó, ACh có thể nhanh chóng bị thủy phân và bất hoạt bởi AChE tạo acetat và cholin Cuối cùng, choline được thu hồi trở lại tiền synap thông qua kênh vận chuyển cholin (CHT1) và tiếp tục quay lại quá trình tổng hợp ACh (Hình 1.1) [25, 61]

Hình 1.1 Dẫn truyền thần kinh acetylcholin [22]

(1): Tổng hợp acetylcholin; (2): Thủy phân acetylcholin; (3) Thu hồi choline

*Chú thích: mitochondrion: ty thể, synaptic vesicle: túi dự trữ của synap

1.1.2.2 Giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer

Giả thuyết cholinergic là một trong những giả thuyết lâu đời nhất trong quá trình nghiên cứu về AD [3] Những nghiên cứu đầu tiên đặt nền tảng cho giả thuyết cholinergic trong AD bắt đầu từ giữa những năm 1970 Những nghiên cứu này cho thấy bệnh nhân Alzheimer có tình trạng giảm sút đáng kể cholin acetyl transferase (ChAT) - enzym tổng hợp ACh ở vùng vỏ não [3, 4, 12] Hai dấu ấn quan trọng khác của AD theo giả thuyết cholinergic là sự giảm khử cực dẫn đến giảm giải phóng ACh vào khe synap và giảm thu hồi cholin ở khe synap cần thiết cho quá trình tổng hợp ACh [61] Từ đó dẫn tới suy giảm của chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong quá trình bệnh sinh của

AD là ACh Những hệ quả này cho thấy sự thoái hóa của các tế bào thần kinh và sự mất dẫn truyền thần kinh cholinergic ở vỏ não và thần kinh trung ương đã góp phần gây ra bệnh, làm suy giảm đáng kể chức năng nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer [3]

5 Ngoài ra, các thụ thể cholinergic bao gồm thụ thể nicotinic và muscarinic cũng cho thấy sự thay đổi trong AD Việc thiếu hụt ACh làm giảm hoạt hóa của thụ thể muscarinic M1 dẫn tới bất hoạt protein kinase C và enzym α-secretase, từ đó dẫn tới hoạt hóa enzym glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) và enzym BACE-1 trong não bệnh nhân Alzheimer [18] Việc giảm hoạt động α-secretase và tăng hoạt tính của

BACE-1 làm thay đổi con đường chuyển hóa Aβ protein dẫn tới hình thành mảng bám amyloid beta Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc hoạt hóa quá mức glycogen synthase kinase (GSK) có nhiệm vụ phosphoryl hoá protein tau dẫn tới hình thành đám rối sợi thần kinh và nồng độ cao các oligome Aβ gây độc [18, 26] Đối với thụ thể nicotinic, tiểu đơn vị α7 của thụ thể nicotinic sẽ bị giảm sút đáng kể gây rối loạn chức năng các tế bào thần kinh đệm – các tế bào có chức năng quan trọng trong việc điều hòa sự dẫn truyền thần kinh, tạo môi trường đủ chất dinh dưỡng và oxy cho nơron và dọn sạch các nơron chết [38] Từ đó, các tế bào thần kinh đệm giải phóng một số cytokin như TNF-α, IL-1β, IL-6… gây viêm lan rộng và tổn thương các khớp nối thần kinh, đồng thời gây hoạt hoá receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA) làm mở kênh Ca 2+ ở màng sau synap, từ đó gây khử cực và gây độc tế bào thần kinh [56, 63] Như vậy, từ những nghiên cứu trên đã cho thấy mối quan hệ phức tạp giữa giả thuyết cholinergic và các giả thuyết khác cũng như các đặc điểm bệnh lý đa dạng trong AD [26].

Tổng quan về acetylcholinesterase (AChE)

Sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ trong AD chủ yếu do giảm chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin và rối loạn dẫn truyền hệ cholinergic Do đó, nhiều chiến lược điều trị đã được nghiên cứu nhằm làm chậm sự tiến triển các triệu chứng của AD đồng thời khôi phục nồng độ ACh trong khe synap và dẫn truyền cholinergic [8, 66] Trong đó, AChE thường được chọn làm mục tiêu của các phương pháp trị liệu với mục đích ức chế hoạt động của AChE Cơ chế hoạt động của các chất ức chế AChE đặc biệt hiệu quả do chúng làm tăng nồng độ ACh và cải thiện dẫn truyền cholinergic, từ đó góp phần phục hồi chức năng nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer [41, 66] Như vậy, AChE đã trở thành đích tác động quan trọng và tiềm năng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới trong điều trị và làm chậm quá trình tiến triển của AD [20]

AChE là một esterase thuộc họ enzym carboxylesterase AChE đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân chất dẫn truyền thần kinh ACh và được tìm thấy với nồng độ cao ở trong các tế bào hồng cầu và đặc biệt là trong hệ thần kinh trung ương tại các synap thần kinh cơ và synap cholinergic [41, 44] Mặt khác, ở trong cơ thể, ACh cũng được thủy phân bởi butyrylcholinesterase (BuChE) còn được gọi là “giả” cholinesterase BuChE là enzym cholinesterase không đặc hiệu, có tác dụng thủy phân các cholin ester khác nhau và được tìm thấy ở khắp vị trí trong cơ thể, chủ yếu ở gan, huyết tương, tuyến

6 tụy và hệ thần kinh trung ương của con người [33, 41, 44] Ở hệ thần kinh trung ương, AChE được coi là enzym chủ chốt trong việc thủy phân ACh trong khi BuChE chỉ đóng vai trò thứ yếu và đóng góp khoảng 10% hoạt động thủy phân acetylcholin [20, 44] Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng AChE có khả năng tương tác với các sợi amyloid đang phát triển và hình thành phức hợp AChE-Amyloid từ đó làm tăng tổng hợp các peptid Aβ và các mảng bám Aβ hiện diện trong não bệnh nhân AD, đồng thời các phức hợp AChE-Amyloid cũng được chứng minh là có độc tính gây tổn thương não cao hơn so với các sợi Aβ riêng lẻ [6, 8, 19, 52] Do đó, AChE và các chất ức chế AChE dành được nhiều sự quan tâm hơn của nhà khoa học trong các phương pháp ngăn chặn và điều trị AD [20]

Cấu trúc tinh thể của AChE lần đầu tiên được mô tả Joel Sussman và cộng sự vào năm 1991 từ loài cá đuối điện Torpedo californica [62, 65] Cấu trúc vùng xúc tác của AChE của Torpedo californica, chuột và con người khá tương đồng với nhau và đều có hình dạng tương tự hình elip có kích thước không gian khoảng 45x60x65 Å Bên cạnh đó, AChE thuộc lớp α/β protein chứa 12 sợi gấp nếp β ở trung tâm và được bao quanh bởi 14 chuỗi xoắn α [11, 65] Đặc điểm nổi bật trong cấu trúc AChE là một lòng kênh rộng ~ 5 Å và dài ~ 20 Å mở rộng dần từ bề mặt của enzym về phía đáy của nó [11, 57]

Vị trí lòng kênh này có đặc điểm đáng chú ý là chứa 14 acid amin thơm được bảo toàn bao gồm Phe120, Phe288, Phe290, Phe330, Phe331, Trp84, Trp233, Trp279, Trp432, Tyr70, Tyr121, Tyr130, Tyr334 và Tyr442 (TcAChE), trong đó hầu hết các acid amin này đều mang chức năng riêng của chúng Vùng cấu trúc đặc biệt này có tác dụng liên kết 2 vùng cấu trúc riêng biệt bao gồm trung tâm hoạt động (CAS) nằm phía đáy enzym và vùng ngoại biên (PAS) nằm ở “miệng” kênh enzym (Hình 1.2) [58, 68]

Hình 1.2 Minh họa cấu trúc của AChE bao gồm: vùng trung tâm hoạt động (CAS), vùng lòng kênh và vùng ngại biên (PAS) [60]

7 Vùng trung tâm hoạt động của AChE nằm ở vị trí cách đáy enzym khoảng 4 Å và bao gồm 4 phân vùng quan trọng: phân vùng “esteratic”, phân vùng “anionic”, vùng oxyanion và túi acyl (Hình 1.3) [11] Phân vùng “esteratic” ở vùng trung tâm hoạt động có chứa bộ 3 acid amin xúc tác gồm Ser203, His447 và Glu334 (hAChE) hoặc Ser200, His440 và Glu327 (TcAChE) chịu trách nhiệm chính trong quá trình thủy phân, cụ thể chuyển nhóm acetyl của ACh sang acid amin Ser203 trong quá trình thủy phân [2] Bên cạnh đó, phân vùng “anionic” chứa các acid amin Trp84, Tyr130, Phe300 và Phe331 (TcAChE), trong đó Trp84 (TcAChE) hay Trp86 (hAChE) được coi là acid amin chìa khóa đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết với nhóm amoni bậc 4 của cholin thông qua tương tác cation-π từ đó giúp định hướng chính xác ACh trong trung tâm hoạt động của enzym AChE [2, 59] Khi nghiên cứu về chức năng của vùng oxyanion và túi acyl, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vùng oxyanion của AChE có các acid amin Gly121, Gly122 và Ala204 (hAChE) có vai trò tạo liên kết hyrdo bền vững với nhóm C=O của ACh từ đó giúp ổn định trạng thái chuyển tiếp của phức hợp ACh-AChE (cơ chất – enzym) trong quá trình thủy phân [19]; trong khi túi acyl chứa các acid amin Phe295, Phe297 và Phe338 (hAChE) chịu trách nhiệm chọn lọc cơ chất gắn vào trung tâm hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tiếp cận của các cholin este có kích thước lớn hơn và ổn định nhóm acetyl của ACh [42]

Vùng ngoại biên (PAS) (có thể gọi là vùng “anionic” ngoại biên hoặc vùng “β- anionic”) nằm ở “miệng” enzym AChE và cách trung tâm hoạt động khoảng 14 Å Vùng PAS là vùng chứa nhiều hợp phần thơm giúp hình thành tương tác cation-π với phần choline của ACh bao gồm các acid amin Trp286, Tyr72, Tyr124, Tyr341 và Asp74 (hAChE) [28] Trong quá trình xúc tác thủy phân ACh của AChE, vùng PAS được coi là bước đầu tiên của quá trình xúc tác thủy phân ACh do nó đóng vai trò liên kết và bắt giữ tạm thời ACh trên bề mặt enzym trong khi vùng CAS đang hoạt động [19]

Hình 1.3 Cấu trúc 3D vùng trung tâm hoạt động của AChE [19]

(A: không có ACh, B: có ACh)

Phân vùng “esteratic”: S203 (Ser203), H447 (His447), E334 (Glu334); Vùng oxyanion: E121 (Glu121), E122

(Glu122), A204 (Ala204); Vùng “anionic”: W86 (Trp86), E202 (Glu202)

Từ các nghiên cứu về cấu trúc trên của AChE, câu hỏi được đặt ra là làm thế nào đặc tính thơm của vùng PAS và lòng kênh có thể góp phần vào khả năng bắt giữ ACh từ đó mang lại hoạt tính xúc tác cao của enzym này? Điều này có thể được giải thích bởi hai nguyên nhân chính: thứ nhất, tính kỵ nước của vùng lòng kênh dẫn một hằng số điện môi cục bộ thấp, từ đó tạo ra khả năng tích điện tại vùng lòng kênh lớn hơn nhiều so với dự kiến từ một lượng nhỏ các nhóm acid; nguyên nhân thứ hai và quan trọng hơn là vùng chứa nhiều hợp phần thơm có thể cho phép sự gắn kết ban đầu của AChE với ACh thông qua tương tác cation-π ở vị trí ái lực thấp sau đó khuếch tán vào vị trí có ái lực cao hơn tại trung tâm hoạt động [16] Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng có một mômen lưỡng cực điện lớn (khoảng 505 Debye) dọc theo lòng kênh hẹp của AChE từ đó kéo ACh mang điện tích dương từ vùng PAS, qua lòng kênh hẹp và đi vào vị trí trung tâm hoạt động [16, 19] Vào năm 1994, nghiên cứu của Shafferman và các cộng sự chỉ ra rằng có một mô típ (motif) gồm 7 acid amin có tính acid bao gồm Glu84, Glu285, Glu292, Asp349, Glu358, Glu389 và Asp390 (hAChE) ở vị trí miệng lòng kênh hẹp đã góp phần quan trọng trong việc tạo ra mômen lưỡng cực trên và khi đột biến mô típ 7 acid amin này ở vùng PAS, tốc độ thuỷ phân của AChE giảm đi từ 2-3 lần đối với các cơ chất mang điện tích dương, còn đối với các cơ chất trung hoà về điện tích thì dường như tốc độ thuỷ phân không có thay đổi đáng kể [55] Hơn nữa, các nghiên cứu tiếp theo cũng khẳng định, có một điện thế tăng dần dọc theo chiều dài của lòng kênh được tạo lên chủ yếu bởi các acid amin Asp72 ở vị trí giữa lòng kênh và Glu199 và Glu443 ở gần phía đáy của kênh hẹp Điều này được chứng minh thông qua thí nghiệm đột biến ở vị trí Asp72 của AChE, ái lực của AChE với ACh giảm đáng kể từ 15-20 lần [16]

Tuy nhiên, mômen lưỡng cực điện trên cùng với lòng kênh hẹp cũng làm cản trở việc thoát ra của sản phẩm thủy phân cholin, làm nó bị mắc kẹt trong khe hẹp Các nhà nghiên cứu đã tranh luận trong thời gian dài về sự tồn tại của các “lối thoát” trong trung tâm hoạt động để giải phóng các sản phẩm của quá trình thủy phân như acid acetic, ion acetat, cholin và các phân tử nhỏ như nước và ion kim loại [19, 21, 68] Những “lối thoát” này bao gồm “cửa sau” và “cửa bên” (Hình 1.4) [17] Mô hình “cửa sau” lần đầu tiên được đề xuất bởi Sussman vào năm 1993, sau đó mô hình này được ủng hộ thông qua mô phỏng động lực học phân tử (MD) bởi McCammon và cộng sự vào năm 1994 Theo các nghiên cứu này, “cửa sau” được hình thành tại vị trí thành mỏng tại Trp86 (tương tác với nhóm amin bậc 4 của ACh) cùng với các phần dư Glu448, Tyr449 và Ile451 Trong mô phỏng MD, “cửa sau” được mở ra do sự dịch chuyển của Trp86 từ vị trí ban đầu của nó, đặc biệt là sự dịch chuyển của vòng Ω (Ω-loop) [17, 21] Cấu trúc vòng Ω của AChE được hình thành từ cầu nối disulfid giữa 2 cystein (Cys69-Cys96) là một cấu trúc tương đối linh động Trong quá trình mở “cửa sau”, toàn bộ vòng Ω di chuyển ra khỏi trục chính của lòng kênh, phần dư ở phía ngoài của vòng Ω cuộn xoắn

9 lại tạo hình xoắn ốc và di chuyển về phía Trp86 Sau đó, vòng Ω tương tác với Tyr449 thông qua tương tác xếp chồng thơm-thơm và “cửa sau” được mở ra dẫn các sản phẩm ra ngoài [5] Vào năm 1997, McCammon cùng cộng sự tiếp tục tìm ra sự xuất hiện của

“cửa bên” thông qua mô phỏng MD “Cửa bên” chủ yếu được hình thành bởi 6 hợp phần Asp74, Thr75, Leu76, Thr83, Glu84 và Asn87 và cơ chế mở “cửa bên” cũng tương tự như mở “cửa sau” do chủ yếu dựa trên sự thay đổi vị trí của các hợp phần trên [17]

Hình 1.4 Minh họa “cửa sau” và “cửa bên” của AChE [31]

Lòng kênh hẹp: khối màu xanh lá; “Cửa sau”: khối màu xanh lam;

“Cửa bên”: khối màu hồng; Ω-loop: đường màu cam

Như vậy, AChE là một cấu trúc vô cùng phức tạp với các vùng CAS, PAS và đặc biệt là lòng kênh hẹp, tuy nhiên, AChE vẫn cho thấy hiệu quả trong việc thủy phân ACh qua 2 giai đoạn liên tiếp acyl hóa và deacyl hóa thông qua nghiên cứu mô phỏng động lực học phân tử QM/MM [69] Cụ thể, trong giai đoạn acyl hóa, sự chuyển proton (H) từ nhóm OH của Ser203 sang N của His447 giúp hình thành tác nhân ái nhân mạnh O - trên Ser203, tác nhân ái nhân này tấn công vào nhóm C=O của ACh từ đó tạo thành phức tứ diện trung gian (Tl1) Ở trạng thái phức tứ diện trung gian, proton được chuyển sang nhóm rời đi của ACh và liên kết dạng kéo bị phá vỡ tạo thành phức hợp acyl-enzym

10 (EA1) với sự giải phóng choline Ở giai đoạn deacetyl hóa, phân tử nước tấn công vào carbonyl của nhóm acetyl dẫn tới hình thành phức tứ diện trung gian thứ hai (Tl2) Sau đó, proton được chuyển từ His447 sang nguyên tử O của phức acetyl-serin và liên kết dạng kéo bị phá vỡ, tạo acid acetic và hoàn nguyên AChE (Hình 1.5) [69]

Hình 1.5 Cơ chế phản ứng thủy phân ACh bởi enzym AChE [69]

Các chất ức chế acetylcholinesterase

1.3.1 Phân loại các chất ức chế AChE

Các chất ức chế AChE (AChEI) làm ngăn quá trình thủy phân ACh từ đó tăng nồng độ và thời gian tác dụng của chất dẫn truyền thần kinh ACh Ngoài ra, chúng cũng có thể giúp cải thiện một số chức năng về nhận thức và hành vi của bệnh nhân Alzheimer ở trong giai đoạn nhẹ của bệnh [11, 66] Dựa trên cơ chế hoạt động, các AChEI có thể được chia thành 2 nhóm: chất ức chế thuận nghịch và chất ức chế không thuận nghịch (Bảng 1.1) Các chất ức chế AChE thuận nghịch liên kết với AChE qua tương tác không cộng hóa trị (liên kết hydro, tương tác cation-π, tương tác π-π, ) dễ dàng bị phá vỡ và trả lại chức năng của enzym Ngược lại, các chất ức chế AChE không thuận nghịch tạo liên kết cộng hóa trị bền vững với AChE Các liên kết này không thể bị phá vỡ khiến enzym bị bất hoạt vĩnh viễn từ đó dẫn đến kích thích quá mức các thụ thể cholinergic từ đó gây độc và ảnh hưởng nghiêm trọng hệ thần kinh trung ương Do đó, các chất ức chế thuận nghịch AChE thường được ứng dụng trong lâm sàng để điều trị AD, trong khi các chất ức chế không thuận nghịch thường sử dụng làm thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và chất độc hóa học trong chiến tranh [59]

Bảng 1.1 Một số chất ức chế AChE

Chất ức chế AChE thuận nghịch Chất ức chế AChE không thuận nghịch

1.3.2 Cấu trúc chung của các chất ức chế acetylcholinesterase

Như đã trình bày trong phần 1.2.2, cấu trúc của AChE được chia làm ba hợp phần quan trọng: vùng trung tâm hoạt động (CAS), lòng kênh hẹp và vùng ngoại biên (PAS)

Từ đó, việc thiết kế các dẫn chất có khả năng tương tác với AChE dựa trên ba hợp phần trên là một cách tiếp cận hiệu quả để tìm kiếm các hợp chất tiềm năng ức chế AChE

Năm 2022, Xinnan Li cùng cộng sự công bố 35 dẫn chất mới tổng hợp theo hướng ức chế AChE với cấu trúc đi từ chất dẫn đường donepezil Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thay thế dị vòng indanon của donepezil thành dị vòng isochromanon, đồng thời thay thế vòng piperidin thành dị vòng thơm pyridin có gắn thêm nhóm acetyl hoặc aminocarbonyl với mục đích làm tăng khả năng tương tác của chất ức chế với AChE Kết quả thu được 14 dẫn chất có khả năng ức chế AChE tốt hơn chất chứng dương là donepezil (IC50 = 12,06 + 0,01 nM), trong đó dẫn chất KL1 (Hình 1.6) có khả năng ức chế AChE tốt nhất với IC50 = 1,61 + 0,02 nM Qua nghiên cứu mô phỏng docking, dẫn chất KL1 cho thấy kết quả tương tác với các vị trí quan trọng trong cấu trúc của AChE (Hình 1.7) Cụ thể, dị vòng isochromanon hình thành tương tác π-π với Trp286 tại trung tâm vùng PAS, đồng thời hai vòng thơm pyridin và benzen cũng cho thấy tương tác xếp chồng π-π lần lượt với Tyr337 và Trp86 tại vùng CAS của AChE Ngoài ra, nhóm acetyl và nguyên tử N trên vòng pyridin cũng cho thấy các tương tác hydro và tương tác π-π với các acid amin Tyr124, Tyr337 và Trp86 của AChE, từ đó tăng khả năng gắn và ức chế AChE của KL1 [35] Một nghiên cứu khác vào năm 2020 của Yao Guo và cộng sự

12 cho thấy dẫn chất KL2 (Hình 1.6) có hoạt tính ức chế AChE tốt (IC50 = 0,39 + 0,04 àM đối với eeAChE) cũng cho thấy cỏc tương tỏc π-π của hợp phần N-benzylpiperidin với Trp86 tại vùng CAS và tương tác π-π của dị vòng indolin-2-on với Trp286 và Tyr341 tại vùng PAS [23]

Hình 1.6 Cấu trúc của hai dẫn chất KL1 và KL2

Hình 1.7 Các tương tác giữa KL1 với AChE qua mô phỏng docking phân tử

Liên kết hydro: màu đen; tương tác π-π: màu nâu; tương tác cation-π: đường màu xanh dương

Năm 2019, S.T Tanoli đã công bố kết quả tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế AChE của một số dẫn chất bis-carbazol Kết quả mô phỏng docking chỉ ra hợp phần carbazol có khả năng hình thành liên kết xếp chồng π-π với Trp84 (ở vùng CAS) và Trp279 (ở vùng PAS) của eeAChE Bên cạnh đó, kết quả thử hoạt tính ức chế AChE cho thấy việc thay đổi độ dài và cấu trúc cầu nối giữa hai dị vòng carbazol của các hợp chất KL3-7 (Hình 1.8) cũng làm thay đổi đáng kể khả năng ức chế AChE Cụ thể, khi tăng độ dài cầu nối alkyl giữa hai dị vòng carbazol từ một (KL3) lên hai (KL4) và sáu (KL5) nhóm -CH2 , hoạt tính ức chế AChE tăng mạnh lần lượt gấp 5 lần và 17 lần Đồng thời, thay thế một nhóm -CH2 của dẫn chất KL4 bằng nhóm C=O (KL6) hay thay thế vùng cầu nối alkyl (KL4) bằng dị vòng triazin (KL7) đều giảm mạnh hoạt tính ức chế AChE Điều này có thể do lòng kênh AChE có độ dài xác định và tương đối hẹp, nên cấu trúc vùng cầu nối gồm sáu nhóm CH2 có thể tối ưu hóa vị trí gắn của carbazol lên

13 hai vùng CAS và PAS, từ đó làm tăng khả năng ức chế AChE Thêm vào đó, việc thay các cấu trúc cồng kềnh như triazin trên vùng cầu nối làm giảm khả năng chất ức chế vào được vị trí trung tâm hoạt động dẫn đến làm giảm hoạt tính ức chế AChE [64]

Hình 1.8 Cấu trúc của dẫn chất KL3-7 và hoạt tính ức chế AChE (eeAChE) trong kết quả nghiên cứu của S.T Tanoli Như vậy từ những nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các đặc điểm cấu trúc quan trọng của một chất ức chế AChE cần bao gồm:

- Phần liên kết với vùng CAS và vùng PAS: thường là vòng thơm vòng thơm hay dị vòng thơm tạo liên kết với vùng CAS và vùng PAS qua các tương tác thích hợp như liên kết π- π, liên kết hyrdo,

- Cầu nối liên kết với độ dài và cấu trúc thích hợp nối giữa hai phần cấu trúc tương tác với vùng CAS và vùng PAS ở trên.

Khung tetrazol và hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất

Tetrazol là một dị vòng thơm năm cạnh chứa một nguyên tử carbon và bốn nguyên tử nitơ Từ những năm 1950, các dẫn chất chứa khung tetrazol được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, hóa sinh, y học, dược lý và nhiều lĩnh vực quan trọng khác [67] Về mặt hóa học, khung tetrazol có tính acid nhờ sự có mặt của bốn nguyên tử nitơ và được coi là cấu đẳng sinh học của các nhóm acid carboxylic [30] Bên cạnh đó, các dẫn chất mang khung tetrazol dành được nhiều sự chú ý của các nhà khoa học vì có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, kháng

14 ung thư, kháng lao, chống đái tháo đường và chống đông máu [30] Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các dẫn chất tetrazol có khả năng tương tác với một số đích phân tử tiềm năng trong điều trị AD, trong đó có nghiên cứu về các dẫn chất tetrazol hướng ức chế AChE đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm [24, 32, 70]

Năm 2017, Ali Dişli đã tổng hợp được các dẫn chất mang khung tetrazol hướng ức chế AChE và thu được hai dẫn chất có khả năng ức chế AChE ở nồng độ micromol là KL8 (IC50 = 1,75 àM) và KL9 (IC50 = 1,84 àM) (Hỡnh 1.9), tuy nhiờn hoạt tớnh ức chế này vẫn thấp hơn so với chất chứng dương là donepezil.HCl (IC50 = 7,78x10 -3 àM) [15] Vào đầu năm 2024, Niels V Heise cùng cộng sự công bố kết quả tổng hợp và đánh giá hoạt tính ức chế AChE của 5 dẫn chất mang khung tetrazol mới, kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy cả 5 dẫn chất tổng hợp được đều cho hoạt tính ức chế AChE ở khoảng nồng độ 10 àM; trong đú cú dẫn chất KL10 (Hỡnh 1.9) cú khả năng ức chế AChE tốt nhất là 96,8%, cao hơn chất chứng dương là galantamin (88,9% ở nồng độ 10 àM) Qua kết quả mụ phỏng docking cho thấy vũng tetrazol của KL10 cú thể làm tăng khả năng tương tác của chất ức chế với AChE thông qua liên kết hydro với Gly118 tại vùng CAS [27]

Hình 1.9 Một số dẫn chất ức chế AChE mang khung tetrazol

Phản ứng tổng hợp khung tetrazol

Phương pháp hiệu quả nhất trong tổng hợp khung tetrazol là đi từ dẫn xuất azid thông qua phản ứng cộng đóng vòng [3+2] giữa azid và nitril được trình bày theo Sơ đồ

Sơ đồ 1.1 Phản ứng tổng hợp tetrazol từ azid và nitril

15 Một số nghiên cứu về tổng hợp các dẫn chất tetrazol chỉ ra rằng có thể rút ngắn thời gian phản ứng và nâng cao hiệu suất tổng hợp tetrazole khi sử dụng các xúc tác kim loại hay lò vi sóng Phản ứng của natri azid với nitril tạo dẫn chất tetrazol diễn ra dễ dàng trong nước với xúc tác là muối kẽm Phản ứng này có thể sử dụng nitril thơm, alkyl nitril hay vinyl nitril (Sơ đồ 1.2) [14]

Sơ đồ 1.2 Phản ứng tổng hợp tetrazol với xúc tác muối kẽm

Các tetrazol được điều chế với hiệu suất tốt và thời gian phản ứng ngắn bằng cách cho nitril phản ứng với natri azid và triethylamin trong nitrobenzen sử dụng lò vi sóng Với phương pháp này, ngay cả các tetrazol bị cản trở không gian và các tetrazol bị ảnh hưởng bởi các nhóm cho điện tử đều có thể tổng hợp được (Sơ đồ 1.3) [53]

Sơ đồ 1.3 Phản ứng tổng hợp tetrazol bằng lò vi sóng

Như vậy, từ những thông tin về cấu trúc của AChE, cấu trúc của các chất ức chế AChE, tiềm năng của khung tetrazol với khả năng ức chế AChE và các phương pháp tổng hợp tetrazol, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase của một số dẫn chất thơm mới mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1 H -tetrazol-1-yl)acetamid”

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

Các dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ một số quốc gia như Đức, Ấn Độ, Mỹ, Nhật Bản và Trung Quốc Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp mà không cần qua tinh chế thêm và được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc

16 Ethyl acetat (EA) Trung Quốc

18 Bản mỏng silica gel 60 F254 Đức

22 Natri azid (NaN3) Ấn Độ

24 Natri sulfat khan (Na2SO4) Trung Quốc

25 Natri bicarbonat (NaHCO3) Trung Quốc

26 eeAChE (acetylcholinesterase từ loài lươn điện) Mỹ

27 5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Nhật Bản

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 - 100 ml, bình chiết, sinh hàn hồi lưu, ống nghiệm, ống đong, pipet, phễu thủy tinh, phễu lọc Buchner, chất trợ lọc Celite, cốc có mỏ các loại, lọ thủy tinh penicilin

- Bình sắc ký Camag, đèn tử ngoại Camag bước sóng 254 nm và 366 nm, bản mỏng silica gel 60 F254

- Cân phân tích Shimadzu, cân kĩ thuật Shimadzu

- Tủ lạnh Memmert, tủ sấy Memmert

- Máy cất quay Buchi R-210, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RCT, máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

- Máy đo phổ hồng ngoại: FTIR Affinity-1S-Shimadzu (Nhật Bản) - Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối: Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States)

- Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz - Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đọc đĩa đa chức năng VarioskanLux.

Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp 5 dẫn chất thơm mang khung thơm mới mang khung 2-(5-(pyridin- 2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid gồm:

+ N-(4-bromophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVa)

+ N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVb) + N-(4-methoxyphenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVc) + N-(2,4-dimethoxyphenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVd) + N-(pyridin-2-yl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVe)

2.2.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất tổng hợp được bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng

- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng tử hạt nhân ( 1 H- NMR, 13 C-NMR)

2.2.2 Đánh giá hoạt tính ức chế AChE

Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được đánh giá khả năng ức chế AChE bằng phương pháp Ellman với một số điều chỉnh để phù hợp với điều kiện thực nghiệm tại trường Đại học Dược Hà Nội.

Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên những phản ứng và điều kiện đã được khảo sát từ trước để tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc như dự kiến Các phản ứng đã sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Phản ứng cộng đóng vòng [3+2] từ aryl nitril và azid vô cơ tạo vòng tetrazol

- Phản ứng N-alkyl hóa giữa muối tetrazol và alkyl halid

- Phản ứng thủy phân ester tạo acid carboxylic

- Phản ứng amid hóa giữa acid carboxylic và amin thơm

Các phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh là bản mỏng silica gel 60 F254, quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm

Hỗn hợp sau phản ứng được tinh chế bằng các kỹ thuật phù hợp với từng giai đoạn, bao gồm các kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng và sắc ký cột

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các sản phẩm sau khi tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng hai phương pháp:

+ Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 được hoạt hóa ở 110 o C trong 30 phút + Pha động: hệ dung môi EA:n-hexan (1:1 và 1:2) và DCM:MeOH (24:1) + Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm

- Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

Các chất sau khi được tổng hợp, tinh chế và đánh giá là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon ( 1 H-NMR và 13 C-NMR):

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity-1S-Shimadzu (Nhật Bản), khoa Hóa học –Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm -1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Phổ được ghi ở độ phân giải 4 cm -1

- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hoạt động theo phương pháp ion hóa phun mù điện tử ESI (+), dung môi hòa tan là MeOH hoặc MeCN

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AC - 500 MHz tại Khoa Hóa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1 H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13 C-NMR đo ở tần số 125 MHz với dung môi là DMSO-d6 và CDCl3 Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K

2.3.2 Đánh giá hoạt tính ức chế AChE

Nguyên tắc: đánh giá hoạt tính ức chế AChE của các chất tổng hợp được (IVa- e) bằng phương pháp Ellman Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin Sau đó thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic (thuốc thử Ellman, DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitrobenzoic có màu vàng Chất tham chiếu được sử dụng là galantamin hydrobromid được mua từ TCI (Nhật Bản) Đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm với máy đọc đĩa VarioskanLux

Quy trình thực hiện: 20 𝜇L ở các nồng độ khác nhau của các dung dịch thử nghiệm trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0, 20 𝜇L dung dịch DTNB 19,2 mM, 20 𝜇L dung dịch ATCI 19,2 mM và 20 𝜇L dung dịch AChE 0,25 IU/ml, được thêm dung dịch đệm phosphat pH 8,0 đến khi tổng thể tích là 100 𝜇L Ủ hỗn hợp ở 25 o C trong 30 phút, sau đó đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 412 nm Mỗi chất được thử khả năng ức chế AChE ở nồng độ 75 𝜇M và 256 𝜇M, phép thử được tiến hành lặp lại ba lần Phần trăm (%) ức chế AChE của các chất ở nồng độ thử nghiệm được tính theo công thức:

Trong đó: - Blank: ATCI, DTNB trong dung dịch đệm pH 8,0

- Control: ATCI, DTNB và enzym trong dung dịch đệm pH 8,0

- Mẫu thử: chất thử (hoặc chứng galantamin hydrobromid), ATCI, DTNB và enzym trong dung dịch đệm pH 8,0

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Hóa học

Sơ đồ sử dụng để tổng hợp 5 dẫn chất mục tiêu được trình bày dưới đây:

(a) i) NaN 3 , ZnCl 2 , DMF, 120 o C, 3h; ii) ethyl 2-cloroacetat, 60 o C, 3h; (b) i) NaOH, MeOH, nhiệt độ phòng, 30 phút; ii) HCl đặc, pH=1-2; (c) Dẫn chất của anilin/ pyridin-2-amin, HOBt, EDC.HCl, TEA, DCM, DMF, nhiệt độ phòng, 4h.

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát tổng hợp các chất IVa-e

3.1.1.1 Tổng hợp ethyl 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetat (II)

Hợp chất trung gian ethyl 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetat (II) được tổng hợp thông qua hai phản ứng liên tiếp trong một bình phản ứng, bao gồm: phản ứng cộng đóng vòng [3+2] từ aryl nitril và natri azid tạo vòng tetrazol, sau đó là phản ứng

N-alkyl hóa giữa muối tetrazoat trung gian với tác nhân là 2-cloroethyl acetat Phản ứng được minh họa theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II

- Hòa tan 521 mg pyridin-2-carbonitril (I) (5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) vào bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml trong khoảng 5 ml DMF

- Thêm tiếp 488 mg NaN3 (7,5 mmol, tương ứng 1,5 đương lượng) và 68,15 mg ZnCl2 (0,5 mmol, tương ứng 0,1 đương lượng) vào bình phản ứng, gia nhiệt cho phản ứng và đun hồi lưu ở 120 o C trong 3 giờ

- Sau 3 giờ, hạ nhiệt độ của phản ứng xuống 60 o C, thêm vào hỗn hợp phản ứng

800 àl ethyl 2-cloroacetat (7,5 mmol, tương ứng 1,5 đương lượng), duy trỡ phản ứng ở

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan (1:1)

- Hỗn hợp sau khi phản ứng xong được làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 25 ml Na2CO3 cho kết tủa hoàn toàn rồi lọc qua phễu lọc Buchner có chất trợ lọc là Celite, thu lấy dịch lọc

- Dịch lọc được chiết với EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được chiết lại 2 lần với nước cất lạnh (2 lần, mỗi lần 30 ml)

- Pha EA được làm khan bằng Na2SO4 khan, cô quay loại dung môi

- Tách 2 đồng phân bằng sắc ký cột silica gel với pha động là EA:n-hexan (1:1) thu được chất II – đồng phân N1 (phân cực hơn) và đồng phân N2 (kém phân cực hơn)

Sử dụng đồng phân N1 để tiếp tục các phản ứng sau

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

- Rf = 0,4 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

3.1.1.2 Tổng hợp acid 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetic (III)

Hợp chất trung gian acid 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetic (III) được tổng hợp từ este II thông qua hai giai đoạn: thủy phân este II trong môi trường kiềm bằng NaOH được tiến hành trong dung môi MeOH, sau đó, acid hóa hỗn hợp sau phản ứng bằng dung dịch HCl đặc theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III

- Hòa tan 2,33 g chất rắn II (10 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) hoàn toàn trong 20 ml methanol (MeOH) trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml

- Cân 800 mg NaOH (20 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) trong lọ thủy tinh penicilin, thêm lượng nước tối thiểu để hòa tan hoàn toàn NaOH, thêm từ từ dung dịch NaOH vừa pha vào bình phản ứng

- Khuấy trên bếp từ khoảng 30 phút Theo dõi phản ứng bằng TLC hệ pha động EA:n-hexan (1:1)

- Sau khi phản ứng kết thúc, thêm từ từ HCl đặc vào bình phản ứng, lắc đều và theo dõi đến pH khoảng 1-2

- Hỗn hợp phản ứng được cô quay dưới áp suất giảm để loại MeOH thu được khối cắn bao gồm muối NaCl và acid III

- Thêm hỗn hợp MeOH:DCM (2:1) vào khối cắn, lọc loại muối NaCl trên phễu lọc và thu lấy dịch lọc Rửa muối nhiều lần bằng hỗn hợp MeOH:DCM (2:1) để thu được tối đa lượng acid

- Toàn bộ dịch lọc được cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi, sấy cắn trong tủ sấy chân không thu được acid III

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

- Rf = 0,3 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

3.1.1.2 Tổng hợp các chất mục tiêu IVa-e

Các chất mục tiêu IVa-e được tổng hợp từ acid III bằng phản ứng amid hóa với các amin khác nhau trong dung môi DCM có mặt DMF với xúc tác là HOBt, EDC.HCl và triethylamin (TEA) ở nhiệt độ phòng theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.4 Quy trình chung tổng hợp các chất IVa-e

23 a) Tổng hợp N-(4-bromophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVa)

Chất IVa được tổng hợp thông qua phản ứng amid hóa giữa chất trung gian III và 4-bromoanilin với xúc tác HOBt, EDC.HCl trong dung môi DMF và DCM được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVa

- Cân khoảng 103 mg (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) acid III vào bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, hòa tan bằng lượng DMF vừa đủ

- Thêm lần lượt vào bình phản ứng 68 mg HOBt (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng), 96 mg EDC.HCl (1,0 đương lượng), 103 mg 4-bromoanilin (0,6 mmol, tương ứng 1,2 đương lượng), 140 àl TEA (1,0 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) vào bỡnh phản ứng

- Thêm 15 ml DCM vào hỗn hợp phản ứng và để khuấy trộn trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng

- Theo dõi phản ứng bằng TLC trong hệ dung môi EA:n-hexan (1:1)

- Hỗn hợp phản ứng sau phản ứng hoàn toàn được cô quay loại dung môi

- Thêm 25 ml NaHCO3 10% vào bình phản ứng, chiết với dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được làm khan bằng Na2SO4 khan

- Cô quay loại dung môi thu lấy cắn

- Tinh chế bằng sắc ký cột với pha động là EA:n-hexan (6:4), cô quay dưới áp suất giảm, sấy cắn đến khô trong tủ sấy chân không thu được chất IVa

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

- Rf = 0,31 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HRMS, 1 H-NMR và 13 C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

24 b) Tổng hợp N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid

Chất IVb được tổng hợp thông qua phản ứng amid hóa giữa chất trung gian III và 2-fluoro-4-iodoanilin với xúc tác HOBt, EDC.HCl trong dung môi DMF và DCM được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất IVb

- Cân khoảng 103 mg (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng) acid III vào bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, hòa tan bằng lượng DMF vừa đủ

- Thêm lần lượt vào bình phản ứng 68 mg HOBt (0,5 mmol, tương ứng 1,0 đương lượng), 96 mg EDC.HCl (1,0 đương lượng), 143 mg 2-fluoro-4-iodoanilin (0,6 mmol, tương ứng 1,2 đương lượng), 140 àl TEA (1,0 mmol, tương ứng 2,0 đương lượng) vào bình phản ứng

- Thêm 15 ml DCM vào hỗn hợp phản ứng và để khuấy trộn trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng

- Theo dõi phản ứng bằng TLC trong hệ dung môi EA:n-hexan (1:1)

- Hỗn hợp phản ứng sau phản ứng hoàn toàn được cô quay loại dung môi

- Thêm 25 ml NaHCO3 10% vào bình phản ứng, chiết với dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 ml), thu lấy pha EA

- Dịch chiết EA được làm khan bằng Na2SO4 khan

- Cô quay loại dung môi thu lấy cắn

- Tinh chế bằng sắc ký cột với pha động là EA:n-hexan (6:4), cô quay dưới áp suất giảm, sấy cắn đến khô trong tủ sấy chân không thu được chất IVb

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

- Rf = 0,36 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HRMS, 1 H-NMR và 13 C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày ở phần phụ lục

25 c) Tổng hợp N-(4-methoxyphenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVc)

Hoạt tính sinh học

Kết quả phân tích phổ trên đã khẳng định: các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến ban đầu Trên cơ sở đó, các chất này đã được sử dụng để thử tác dụng ức chế AChE

Cỏc chất IVa-e được đỏnh giỏ tỏc dụng ức chế AChE ở nồng độ 75 àM và 256 àM, so sỏnh với chất đối chứng dương là galantamin hydrobromid Kết quả được thể hiện bằng phần trăm ức chế AChE được trình bày ở Bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính ức chế AChE của các chất IVa-e

Chứng dương (galantamin hydrobromid): IC50 = 2,5 + 0,2 àM

*N/E: non effective – không có tác dụng ức chế AChE Nhận xét: Ở nồng độ 75 àM cú 3 chất khụng thể hiện hoạt tớnh ức chế AChE là IVa, IVc,

IVd và 2 chất thể hiện hoạt tính ức chế AChE là IVb và IVe với giá trị lần lượt là 15,2% và 15,6% Ở nồng độ 256 àM cả 5 chất đều thể hiện hoạt tớnh ức chế AChE từ 20,0% đến

50,8% trong đó có chất IVe có hoạt tính ức chế AChE cao nhất là 50,8%

BÀN LUẬN

Tổng hợp hóa học

Quy trình tổng hợp 5 chất IVa-e mục tiêu cần sử dụng các phản ứng là: phản ứng cộng đóng vòng [3+2], N-alkyl hóa, thủy phân este và amid hóa

4.1.1 Phản ứng cộng đóng vòng [3+2]

Dẫn chất trung gian tetrazol được tổng hợp qua phản ứng cộng đóng vòng của pyridin-2-carbonitril với tác nhân là NaN3, chất xúc tác là ZnCl2 trong dung môi là DMF, tiến hành ở 120 o C Cơ chế phản ứng được đề xuất như sau:

Sơ đồ 4.1 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tạo muối tetrazol trung gian

Trong phản ứng cộng đóng vòng [3+2], đương lượng của NaN3 ảnh hưởng lớn tới thời gian và tốc độ phản ứng Chúng tôi đã khảo sát NaN3 ở 1,1 đương lượng, 1,3

35 đương lượng và 1,5 đương lượng so với pyridin-2-carbonitril và kết quả cho thấy ở 1,5 đương lượng (NaN3) cho phản ứng diễn ra hoàn toàn và nhanh nhất

Chất II được tổng hợp từ muối tetrazol trung gian với tác nhân là ethyl 2- cloroacetat, tiến hành ở 60 o C Cơ chế phản ứng được đề xuất như sau:

Sơ đồ 4.2 Cơ chế đề xuất cho phản ứng N-alkyl hóa

Việc thực hiện phản ứng theo hướng one-pot của 2 phản ứng cộng đóng vòng [3+2] và phản ứng alkyl hóa giúp phản ứng được tiến hành đơn giản hơn và dễ xử lý hơn do muối tetrazoat dễ tan trong nước, gây khó khăn trong quá trình chiết xuất riêng để thực hiện phản ứng alkyl hóa sau đó Tuy nhiên, lượng NaN3 dư để tăng tốc độ phản ứng cộng đóng vòng có khả năng phản ứng với tác nhân alkyl hóa là ethyl 2-cloroacetat làm giảm hiệu suất của phản ứng N-alkyl hóa Do đó, lượng ethyl 2-cloroacetat cần được tăng lên 1,5 đương lượng để phản ứng hoàn toàn với NaN3 dư và muối tetrazoat để thu được lượng sản phẩm N-alkyl hóa là nhiều nhất

Muối tetrazoat trung gian có 2 dạng hỗ biến nên khi thực hiện phản ứng N-alkyl hóa thu được 2 đồng phân thế ở vị trí N1 và N2 Tiến hành tách 2 đồng phân bằng sắc ký cột sử dụng pha động là hệ dung môi EA:n-hexan thu được đồng phân N2 và đồng phân N1 (II); sau đó đồng phân N1 được sử dụng để tiếp tục tổng hợp các chất mục tiêu

4.1.3 Phản ứng thủy phân este

Acid III được tổng hợp từ este II thông qua hai giai đoạn, thứ nhất là thủy phân este II trong môi trường kiềm với tác nhân là NaOH đặc với dung môi MeOH xảy ra hoàn toàn sau khoảng 30 phút, giai đoạn thứ hai là acid hóa muối natri bằng HCl đặc để thu được dạng acid III

Phản ứng thủy phân ester trong môi trường kiềm là phản ứng một chiều và không thuận nghịch như trong môi trường acid Quá trình phản ứng diễn ra êm dịu, nhanh và hoàn toàn Tác nhân được sử dụng là NaOH dễ chảy trong điều kiện nhiệt độ thường nên quá trình cân nên tiến hành nhanh trong tủ hood Lượng NaOH sử dụng khoảng 2

36 đương lượng so với ester II để giảm lượng dung dịch HCl đặc trung hòa muối natri Đồng thời, việc sử dụng HCl đặc thay vì HCl loãng cũng giúp làm giảm lượng nước sau phản ứng, giúp thuận lợi cho quá trình sấy acid III sau quá trình lọc loại muối NaCl Dung môi được sử dụng là MeOH có khả năng hòa tan tốt este và một phần NaOH, do đó chỉ cần sử dụng một lượng tối thiểu nước hòa tan hoàn toàn NaOH sử dụng trong phản ứng Việc chọn dung môi thủy phân là MeOH thay cho việc sử dụng nước vừa giúp hòa tan este tốt hơn đồng thời quá trình loại bỏ dung môi cũng dễ dàng hơn Có thể tăng tốc độ phản ứng bằng cách tăng nhiệt độ phản ứng khoảng 40-45 o C Cơ chế phản ứng thủy phân este được đề xuất như sau:

Sơ đồ 4.3 Cơ chế đề xuất phản ứng thủy phân este

Trong phản ứng amid hóa, acid III được hoạt hóa bởi xúc tác HOBt và EDC.HCl là phản ứng êm dịu, thực hiện ở nhiệt độ phòng và an toàn hơn so với tác nhân thionyl clorid (SOCl2) Trước tiên, acid III phản ứng với EDC tạo dẫn chất trung gian O - acylurea (Sơ đồ 4.4) Dẫn chất O -acylurea dễ dàng chuyển thành sản phẩm phụ N - acylurea thông qua phản ứng chuyển vị, tuy nhiên, sự có mặt của HOBt giúp hạn chế sản phẩm phụ N -acylurea này đồng thời tạo este trung gian E1 dễ dàng bị tấn công bởi tác nhân ái nhân là các anilin/ pyridin-2-amin tạo các chất mục tiêu IVa-e

Phản ứng amid hóa có sự có mặt của HCl (từ EDC.HCl) và HCl có thể phản ứng với các anilin/ pyridin-2-amin tạo muối không còn khả năng phản ứng với este E1 để tạo amid, do đó, cần thêm 1 lượng base hữu cơ (TEA) để trung hòa lượng HCl này Trong quá trình tiến hành phản ứng, TEA là chất lỏng dễ bay hơi và có mùi khó chịu nên cần được tiến hành trong tủ hood

Cơ chế phản ứng amid hóa được đề xuất như sau:

Sơ đồ 4.4 Cơ chế đề xuất cho phản ứng amid hóa tạo các chất IVa-e

Khẳng định cấu trúc

Cấu trúc của các chất tổng hợp được đã được khẳng định thông qua các phương pháp phổ bao gồm: phổ hồng ngoại IR, phổ khối lượng MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR và phổ cộng hưởng từ carbon 13 C-NMR

Dựa trên phổ IR của 5 chất đã tổng hợp được trình bày ở phụ lục 1-5 và Bảng

3.5 ta có thể nhận thấy:

- Dao động hóa trị liên kết N-H amid xuất hiện ở tần số thấp hơn trong khoảng 3333-3232 cm -1

- Dao động hóa trị liên kết C-H vòng thơm nằm trong khoảng 3067-3004 cm -1

- Dao động hóa trị của liên kết của C=O nằm trong khoảng 1754-1673 cm -1

- Dao động hóa trị của liên kết của C=N nằm trong khoảng 1677-1577 cm -1

- Dao động hóa trị của liên kết của C=C vòng thơm trong khoảng 1551-1416 cm -1

- Dao động hóa trị của liên kết C-X thơm của các chất IVa, IVb xuất hiện dải hấp thụ mạnh lần lượt ở từ 736-734 cm -1

38 Dưới đây là hình ảnh phổ hồng ngoại của chất IVa

Hình 4.1 Phổ IR của chất IVa

Trên khối phổ phân giải cao của 5 chất IVa-e được tổng hợp trong Bảng 3.4 đều thấy xuất hiện các pic ion có cường độ mạnh tương ứng với giá trị [M+H] + Từ đó có thể khẳng định sơ bộ được cấu trúc của các chất đã tổng hợp được

Dưới đây là ví dụ phổ khối của chất IVb

Hình 4.2 Phổ MS của chất IVb

39 Chất IVb có CTPT dự kiến là C14H10FIN6O có pic ion phân tử m/z [M+H]+ dự kiến là 425,0018 Trên phổ đồ xuất hiện pic ion [M+H]+ cường độ mạnh nhất là 425,0021 Từ đó cho thấy chất IVb có số khối đúng như số khối dự kiến

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)

Dựa trên phổ 1 H-NMR của 5 chất đã tổng hợp được trình bày ở phụ lục và Bảng

3.5 ta có thể nhận thấy:

- Các proton NH có độ dịch chuyển cao nhất và nằm trong khoảng 11,19-9,82 ppm

- Các proton trong vòng thơm có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 8,76-6,49 ppm

- Các proton nhóm CH2 có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 5,89-5,76 ppm

Dưới đây là phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của chất IVc

Hình 4.3 Phổ 1 H-NMR của chất IVc

4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

Dựa trên phổ 13 C-NMR của 5 chất đã tổng hợp được trình bày ở phụ lục và Bảng

3.6 ta có thể nhận thấy:

- Carbon C=O có độ dịch chuyển cao nhất và đều có giá trị 164,7 ppm

- Các carbon N=C-N có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 164,3 - 162,8 ppm

- Các carbon vòng thơm có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 157,7 - 99,4 ppm

- Các carbon nhóm CH2 có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 56,3 - 55,6 ppm

40 Dưới đây là phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon của chất IVc

Hình 4.4 Phổ 13 C-NMR của chất IVc

Hoạt tính sinh học

Cỏc chất mục tiờu được thử tỏc dụng ức chế AChE ở 2 nồng độ 75 àM và 256 àM so sỏnh với chất chứng dương là galantamin hydrobromid được thể hiện ở Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tớnh cho thấy ở nồng độ 75 àM cú 3 chất IVa, IVc và IVd chưa thể hiện hoạt tính ức chế AChE trong khi các chất IVb và IVe thể hiện hoạt tính ức chế AChE gần tương tự nhau với giá trị lần lượt là 15,2% và 15,6% Khi tăng nồng độ thử hoạt tớnh từ 75 àM lờn 256 àM cả 5 chất đều thể hiện khả năng ức chế AChE trong khoảng từ 20,0% đến 50,8%; trong đó chất IVe cho khả năng ức chế AChE tốt nhất ở 50,8%

Từ kết quả thử hoạt tính, có thể nhận thấy các nhóm thế khác nhau trên vòng benzen cho hoạt tính ức chế AChE khác nhau Cụ thể, trong kết quả nghiên cứu, nhóm thế halogen (2F-4I) (IVb) trên vòng benzen cho tác dụng ức chế AChE tốt hơn so với nhúm thế halogen 4-Br (IVa) Bờn cạnh đú, ở cả hai nồng độ 75 àM và 256 àM, việc thêm lần lượt nhóm thế đẩy điện tử 4-OCH3 (IVc) hay 2,4-(OCH3)2 (IVd) trên vòng benzen không cho thấy tác dụng ức chế AChE hoặc làm giảm hoạt tính ức chế AChE Ngoài ra, việc sử dụng vòng thơm pyridin (IVe) cho thấy khả năng ức chế tốt nhất trong

5 chất IVa-e ở cả 2 nồng độ thử hoạt tính

Từ kết quả nghiên cứu trên, kết hợp với kết quả thử hoạt tính ức chế AChE của nhóm nghiên cứu đã thực hiện được trình bày trong luận văn thạc sĩ của dược sĩ Bùi Thị

41 Hồng Nhung [1] (Hình 4.5) Kết quả nghiên cứu trong khóa luận càng khẳng định tầm quan trọng của nhóm thế halogen trên vòng benzen tới hoạt tính ức chế AChE của các chất, đặc biệt là nhóm thế F (nhóm hút điện tử mạnh) và nhóm halogen ở vị trí số 4, trong khi nhóm đẩy điện tử trên vòng thơm (OCH3) làm giảm tác dụng cho hoạt tính ức chế AChE Đồng thời, việc thay thế vòng benzen (IXa) bằng phòng pyridin (IVe) [1] cho thấy khả năng ức chế AChE lần lượt tăng gần gấp 5 lần ở nồng độ 75 àM và tăng gấp 2 lần ở nồng độ 256 àM, từ đú cho thấy tiềm năng của việc sử dụng vũng pyridin cho hoạt tính ức chế AChE trong các nghiên cứu tiếp theo của nhóm nghiên cứu

Hình 4.5 Biểu đồ sánh hoạt tính ức chế của các chất đã tổng hợp được

IVa IVb IVc IVd IVe IXa

Nồng độ75 àM Nồng độ 256 àM

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ kết quả nghiên cứu có thể đưa ra một số kết luận như sau:

1.1 Tổng hợp hóa học Đã tổng hợp được 5 chất acetamid thơm mang khung 2-(5-(pyridin-2-yl)-1H- tetrazol-1-yl)acetamid như dự kiến bao gồm:

+ N-(4-bromophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVa)

+ N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVb) + N-(4-methoxyphenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVc) + N-(2,4-dimethoxyphenyl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVd) + N-(pyridin-2-yl)-2-(5-(pyridin-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)acetamid (IVe)

1.2 Khẳng định cấu trúc Đã khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp được thông qua phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon ( 1 H- NMR và 13 C-NMR)

1.3 Đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase

Các chất mục tiêu IVa-e sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trỳc đó được thử tỏc dụng ức chế acetylcholinesterase tại nồng độ 75 àM và 256 àM so sánh với chất chứng dương là galantamin hydrobromid Kết quả thử hoạt tính cho thấy:

- Ở nồng độ 75 àM cỏc chất IVa, IVc và IVd chưa thể hiện hoạt tớnh ức chế

AChE, 2 chất IVb và IVe thể hiện hoạt tính ức chế AChE gần tương tự nhau với giá trị lần lượt là 15,2% và 15,6%

- Ở nồng độ 256 àM cả 5 chất đều thể hiện hoạt tớnh ức chế AChE trong khoảng 20,0% đến 50,8%, trong đó dẫn chấ IVe thể hiện hoạt tính ức chế AChE tốt nhất là 50,8%

Tiếp tục tổng hợp và thử hoạt tính ức chế AChE của các chất mới mang khung tetrazol với các thay đổi:

- Thay các nhóm halogen bằng các nhóm hút điện tử (-NO2, -CF3) vào vòng phenyl đặc biệt là ở vị trí số 4

- Thay thế vòng pyridin hay vòng phenyl của các chất IVa-e bằng các vòng thơm khác như benzothiazol, naphthalen, indazol,…

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1 Bùi Thị Hồng Nhung (2024), "Tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế

Acetylcholinesterase của một số dẫn chất acetamid mới mang khung (pyridin-2- yl)tetrazol", Luận văn thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 63.66

2 Bajda M., Więckowska A., Hebda M., et al (2013), "Structure-based search for new inhibitors of cholinesterases", International Journal of Molecular Sciences, 14(3), pp 5608-5632

3 Barage S.H., Sonawane K.D (2015), "Amyloid cascade hypothesis:

Pathogenesis and therapeutic strategies in Alzheimer's disease", Neuropeptides,

4 Bowen D.M., Smith C.B., White P., et al (1976), "Neurotransmitter-related enzymes and indices of hypoxia in senile dementia and other abiotrophies",

Brain: a journal of neurology, 99(3), pp 459-496

5 Bui J.M., Tai K., McCammon J.A (2004), "Acetylcholinesterase: enhanced fluctuations and alternative routes to the active site in the complex with fasciculin-2", Journal of the American Chemical Society, 126(23), pp 7198-

6 Campanari M.L., Garcia-Ayllon M.S., Belbin O., et al (2014),

"Acetylcholinesterase modulates presenilin-1 levels and γ-secretase activity",

Journal of Alzheimer's Disease, 41(3), pp 911-924

7 Chen Y.G (2018), "Research progress in the pathogenesis of Alzheimer’s disease", Chinese medicinal journal, 131(13), pp 1618-1624

8 Chen Z.R., Huang J.B., Yang S.L., et al (2022), "Role of cholinergic signaling in Alzheimer’s disease", Molecules, 27(6), pp 1816

9 Chin E., Jaqua E., Safaeipour M., et al (2022), "Conventional Versus New

Treatment: Comparing the Effects of Acetylcholinesterase Inhibitors and N- Methyl-D-Aspartate Receptor Antagonist With Aducanumab", Cureus, 14(11)

10 Chowdhury S (2023), "Monoclonal Antibody Treatments for Alzheimer’s

Disease: Aducanumab and Lecanemab", Discoveries, 11(3)

11 Colovic M.B., Krstic D.Z., Lazarevic-Pasti T.D., et al (2013),

"Acetylcholinesterase inhibitors: pharmacology and toxicology", Current neuropharmacology, 11(3), pp 315-335

12 Davies P., Maloney A (1976), "Selective loss of central cholinergic neurons in

Alzheimer's disease", The Lancet, 308(8000), pp 1403

13 Decker A.L., Duncan K (2020), "Acetylcholine and the complex interdependence of memory and attention", Current Opinion in Behavioral Sciences, 32, pp 21-28

14 Demko Z.P., Sharpless K.B (2001), "Preparation of 5-substituted 1 H-tetrazoles from nitriles in water", The Journal of organic chemistry, 66(24), pp 7945-7950

15 Dişli A., Gỹmỹş M., ệnal K., et al (2018), "New multifunctional agents and their inhibitory effects on the acetyl cholinesterase enzyme", Macedonian Journal of

Chemistry and Chemical Engineering, 37(1), pp 21-34

16 Dvir H., Silman I., Harel M., et al (2010), "Acetylcholinesterase: from 3D structure to function", Chemico-biological interactions, 187(1-3), pp 10-22

17 Fang L., Pan Y., Muzyka J.L., et al (2011), "Active site gating and substrate specificity of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase: Insights from molecular dynamics simulations", The journal of physical chemistry B, 115(27), pp 8797-8805

18 Fisher A (2007), "M1 muscarinic agonists target major hallmarks of Alzheimer's disease-an update", Current Alzheimer Research, 4(5), pp 577-580

19 Franjesevic A.J., Sillart S.B., Beck J.M., et al (2019), "Resurrection and reactivation of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase", Chemistry–A European Journal, 25(21), pp 5337-5371

20 García-Ayllón M.S., Small D.H., Avila J., et al (2011), "Revisiting the role of acetylcholinesterase in Alzheimer’s disease: cross-talk with P-tau and β- amyloid", Frontiers in molecular neuroscience, 4, pp 22

21 Gilson M., Straatsma T., McCammon J., et al (1994), "Open" back door" in a molecular dynamics simulation of acetylcholinesterase", Science, 263(5151), pp 1276-1278

22 Gokani R (2014), "Serum cholinesterase as diagnostic marker of liver disease",

23 Guo Y., Yang H., Huang Z., et al (2020), "Design, synthesis, and evaluation of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase dual-target inhibitors against Alzheimer’s diseases", Molecules, 25(3), pp 489

24 Gupta P., Sharma A (2022), "Pharmacological Significance of Triazoles and

Tetrazoles in Neurodegenerative Disease: An Overview", N-Heterocycles: Synthesis Biological Evaluation, pp 355-393

25 H Ferreira-Vieira T., M Guimaraes I., R Silva F., et al (2016), "Alzheimer's disease: targeting the cholinergic system", Current neuropharmacology, 14(1), pp 101-115

26 Hampel H., Mesulam M.M., Cuello A.C., et al (2018), "The cholinergic system in the pathophysiology and treatment of Alzheimer’s disease", Brain, 141(7), pp 1917-1933

27 Heise N.V., Schmidt A., Schüler J.A., et al (2024), "Dehydroabietylamine derived bistetrazoles from ultrasound-assisted pseudo-seven-component Ugi reactions act as efficient and selective inhibitors of cholinesterases", European

Journal of Medicinal Chemistry Reports, 10, p 100124

28 Johnson G., Moore S (2006), "The peripheral anionic site of acetylcholinesterase: structure, functions and potential role in rational drug design", Current pharmaceutical design, 12(2), pp 217-225

29 Kaur S., Bansal Y (2022), "Design, molecular Docking, synthesis and evaluation of xanthoxylin hybrids as dual inhibitors of IL-6 and acetylcholinesterase for Alzheimer's disease", Bioorganic Chemistry, 121, pp 105670

30 Kaushik N., Kumar N., Kumar A., et al (2018), "Tetrazoles: Synthesis and biological activity", Immunology, Endocrine & Metabolic Agents in Medicinal Chemistry, 18(1), pp 3-21

31 Kumawat A., Raheem S., Ali F., et al (2021), "Organoselenium compounds as acetylcholinesterase inhibitors: Evidence and mechanism of mixed inhibition",

The journal of physical chemistry B, 125(6), pp 1531-1541

32 Kushwaha P., Fatima S., Upadhyay A., et al (2019), "Synthesis, biological evaluation and molecular dynamic simulations of novel Benzofuran-tetrazole derivatives as potential agents against Alzheimer’s disease", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 29(1), pp 66-72

33 Lane R.M., Potkin S.G., Enz A (2006), "Targeting acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in dementia", International Journal of Neuropsychopharmacology, 9(1), pp 101-124

34 Leyva-Ramos S., Cardoso-Ortiz J (2021), "Recent developments in the synthesis of tetrazoles and their pharmacological relevance", Current Organic Chemistry 25(3), pp 388-403

35 Li X., Jia Y., Li J., et al (2022), "Novel and Potent Acetylcholinesterase

Inhibitors for the Treatment of Alzheimer’s Disease from Natural (±)-7, 8- Dihydroxy-3-methyl-isochroman-4-one", Molecules, 27(10), pp 3090

36 Long S., Benoist, C., Weidner, W (2023), "Reducing dementia risk: never too early, never too late", World Alzheimer Report 2023

37 Lopez J.A.S., González H.M., Léger G.C (2019), "Alzheimer's disease",

Handbook of clinical neurology, 167, pp 231-255

38 Ma K.G., Qian Y.H (2019), "Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor and its effects on Alzheimer's disease", Neuropeptides, 73, pp 96-106

39 Martins M.M., Branco P.S., Ferreira L.M (2023), "Enhancing the Therapeutic

Effect in Alzheimer's Disease Drugs: The role of Polypharmacology and Cholinesterase inhibitors", ChemistrySelect, 8(10), pp e202300461

40 Marucci G., Buccioni M., Dal Ben D., et al (2021), "Efficacy of acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer's disease", Neuropharmacology,

41 Mehta M., Adem A., Sabbagh M (2012), "New acetylcholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease", International Journal of Alzheimer’s disease, pp 2012

42 Moghadam B., Ashouri M., Roohi H., et al (2021), "Computational evidence of new putative allosteric sites in the acetylcholinesterase receptor", Journal of Molecular Graphics and Modelling, 107, pp 107981

43 Moreta M.P.G., Burgos-Alonso N., Torrecilla M., et al (2021), "Efficacy of acetylcholinesterase inhibitors on cognitive function in Alzheimer’s disease Review of reviews", Biomedicines, 9(11), pp 1689

44 Mushtaq G., H Greig N., A Khan J., et al (2014), "Status of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease and type 2 diabetes mellitus",

CNS & Neurological Disorders-Drug Targets, 13(8), pp 1432-1439

45 Neochoritis C.G., Zhao T., Domling A (2019), "Tetrazoles via multicomponent reactions", Chemical reviews, 119(3), pp 1970-2042

46 Nguyen T.A., Pham T., Dang T.H., et al (2020), "Towards the development of

Vietnam’s national dementia plan—the first step of action", Australasian journal on ageing, 39(2), pp 137-141

47 Peitzika S.C., Pontiki E (2023), "A Review on Recent Approaches on Molecular

Docking Studies of Novel Compounds Targeting Acetylcholinesterase in Alzheimer Disease", Molecules, 28(3), pp 1084

48 Petretto D.R., Carrogu G.P., Gaviano L., et al (2021), "Dementia and Major

Neurocognitive Disorders: Some Lessons Learned One Century after the First Alois Alzheimer’s Clinical Notes", Geriatrics, 6(1), pp 5

49 Pires M., Rego A.C (2023), "Apoe4 and Alzheimer’s disease pathogenesis— mitochondrial deregulation and targeted therapeutic strategies", International Journal of Molecular Sciences, 24(1), pp 778

50 Qin P., Ran Y., Xie F., et al (2023), "Design, synthesis, and biological evaluation of novel N-Benzyl piperidine derivatives as potent HDAC/AChE inhibitors for Alzheimer’s disease", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 80, pp 117178

51 Querfurth H.W., LaFerla F.M (2010), "Alzheimer's disease", New England

52 Ramos-Rodriguez J.J., Pacheco-Herrero M., Thyssen D., et al (2013), "Rapid β- amyloid deposition and cognitive impairment after cholinergic denervation in APP/PS1 mice", Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 72(4), pp 272-285

53 Roh J., Artamonova T.V., Vávrová K., et al (2009), "Practical synthesis of 5- substituted tetrazoles under microwave irradiation", Synthesis, 2009(13), pp

54 Ross E.L., Weinberg M.S., Arnold S.E (2022), "Cost-effectiveness of aducanumab and donanemab for early Alzheimer disease in the US", JAMA neurology, 79(5), pp 478-487

55 Shafferman A., Ordentlich A., Barak D., et al (1994), "Electrostatic attraction by surface charge does not contribute to the catalytic efficiency of acetylcholinesterase", The EMBO Journal, 13(15), pp 3448-3455

56 Sharma K., Pradhan S., Duffy L.K., et al (2021), "Role of receptors in relation to plaques and tangles in Alzheimer’s disease pathology", International Journal of Molecular Sciences, 22(23), pp 12987

57 Silman I., Sussman J.L (2008), "Acetylcholinesterase: how is structure related to function?", Chemico-biological interactions, 175(1-3), pp 3-10

58 Silman I., Sussman J.L (2017), "Recent developments in structural studies on acetylcholinesterase", Journal of Neurochemistry, 142, pp 19-25

59 Singh M., Kaur M., Kukreja H., et al (2013), "Acetylcholinesterase inhibitors as

Alzheimer therapy: from nerve toxins to neuroprotection", European journal of medicinal chemistry, 70, pp 165-188

60 Soreq H., Seidman S (2001), "Acetylcholinesterase—new roles for an old actor",

61 Stanciu G.D., Luca A., Rusu R.N., et al (2019), "Alzheimer’s disease pharmacotherapy in relation to cholinergic system involvement", Biomolecules, 10(1), pp 40

62 Sussman J.L., Harel M., Frolow F., et al (1991), "Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine- binding protein", Science, 253(5022), pp 872-879

63 Takata K., Kimura H., Yanagisawa D., et al (2022), "Nicotinic acetylcholine receptors and microglia as therapeutic and imaging targets in Alzheimer’s disease", Molecules, 27(9), pp 2780

64 Tanoli S.T., Ramzan M., Hassan A., et al (2019), "Design, synthesis and bioevaluation of tricyclic fused ring system as dual binding site acetylcholinesterase inhibitors", Bioorganic Chemistry, 83, pp 336-347

65 Tripathi A., Srivastava U (2010), "Acetylcholinesterase: a versatile enzyme of nervous system", Annals of Neurosciences, 15(4), pp 106-111

66 Vecchio I., Sorrentino L., Paoletti A., et al (2021), "The state of the art on acetylcholinesterase inhibitors in the treatment of Alzheimer’s disease", Journal of Central nervous system disease, 13, pp 11795735211029113

67 Wei C.X., Bian M., Gong G.H (2015), "Tetrazolium compounds: synthesis and applications in medicine", Molecules, 20(4), pp 5528-5553

68 Xu Y., Cheng S., Sussman J.L., et al (2017), "Computational studies on acetylcholinesterases", Molecules, 22(8), pp 1324

69 Zhou Y., Wang S., Zhang Y (2010), "Catalytic reaction mechanism of acetylcholinesterase determined by Born− Oppenheimer ab initio QM/MM molecular dynamics simulations", The journal of physical chemistry B, 114(26), pp 8817-8825

70 Zou Y., Liu L., Liu J., et al (2020), "Bioisosteres in drug discovery: focus on tetrazole", Future Medicinal Chemistry, pp 91-93.