HOÀNG bảo NGỌC TỔNG hợp và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG KHÁNG UNG THƯ của một số dẫn CHẤT n HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG QUINAZOLIN 4(3h) ON HƯỚNG ức CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sỹ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG BẢO NGỌC MÃ SINH VIÊN: 1601552 TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG QUINAZOLIN-4(3H)-ON HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Mai Dung NCS Dương Tiến Anh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa dược HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Những dịng đầu tiên, tơi xin dành để gửi lời cảm ơn chân thành đến với người suốt thời gian qua ln hỗ trợ động viên tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách tốt Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hải Nam, TS Đỗ Thị Mai Dung NCS Dương Tiến Anh Thầy cô anh bảo, hướng dẫn tận tình, động viên tơi lúc khó khăn q trình nghiên cứu, giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn tới giảng viên, nghiên cứu viên anh chị kỹ thuật viên công tác Bộ mơn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Lời cuối, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè thành viên khác tham gia nghiên cứu mơn Hóa dược, đặc biệt anh Bùi Xuân Trường, anh Đào An, bạn Nguyễn Hữu Long, bạn Phan Huy Đức, bạn Dương Văn Hiếu, bạn Nguyễn Ngọc Mai, bạn Vũ Thị Nhung, em Trịnh Thị Minh Ngọc, em Nguyễn Thị Thu Hằng Sự đồng hành, sẻ chia người nguồn động lực to lớn quãng thời gian thực nghiệm Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Hoàng Bảo Ngọc MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm enzym histone deacetylase (HDAC) 1.1.2 Phân loại HDAC 1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym HDAC phụ thuộc Zn2+ 1.1.4 Mơ hình xúc tác enzym HDAC phụ thuộc Zn2+ 1.1.5 HDAC bệnh lý ung thư 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.2.2 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.3 Cơ chế tác dụng chất ức chế HDAC 1.3 CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU VỀ CHẤT ỨC CHẾ HDAC MANG CẤU TRÚC ACID HYDROXAMIC 1.3.1 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt 1.3.2 Thay đổi cầu nối 11 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ PHẢN ỨNG HECK 12 1.4.1 Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 12 1.4.2 Phản ứng Heck 14 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17 2.1.1 Hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị 18 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Tổng hợp hóa học 18 2.2.2 Đánh giá hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1 Tổng hợp hóa học 19 2.3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Hóa học 23 3.1.1 Tổng hợp hóa học 23 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 31 3.1.3 Khẳng định cấu trúc 32 3.2 Hoạt tính sinh học 36 3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế HDAC 36 3.2.2 Đánh giá tính kháng tế bào ung thư in vitro 37 3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào 38 3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng lên chu trình apoptosis 39 3.3 Bàn luận 39 3.3.1 Tổng hợp hóa học 39 3.3.2 Khẳng định cấu trúc 41 3.3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 1.Kết luận 51 1.1 Về tổng hợp khẳng định cấu trúc 51 1.2 Về hoạt tính sinh học 51 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon-13 nuclear magnetic resonance) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) AcOH Acid acetic ADN Acid desoxyribonucleic AR Tinh khiết phân tích (Analytical Reagent) BubR1 Protein kiểm tra phân bào CAL 27 Tế bào ung thư miệng người CAP Nhóm nhận diện bề mặt CC Cyanuric clorid CENP-E Protein tâm động E (Centromere protein E) CENP-F Protein tâm động F (Centromere protein F) CTCL U lympho tế bào T da CWR22 Tế bào ung thư tuyến tiền liệt d Vạch đôi (Doublet) DCM Diclomethan DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DOX Doxorubicin DSB Sự đứt gãy sợi kép (double-strand break) EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid ESI Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization) FAS Thụ thể gây chết kích hoạt apoptosis FBS Huyết bào thai bị (Fetal bovine serum) FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (U.S Food and Drug Administration) H% Hiệu suất HAT Histon acetyltransferase hBUB1 Protein kiểm tra phân bào HDAC Histon deacetylase HDACi Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors) HDLP Histone deacetylase like protein HIF-1α Yếu tố phiên mã thiếu oxy máu 1α HL60 Tế bào bệnh bạch cầu người HPOB N-hydroxy-4-(2-[(2-hydroxyethyl)(phenyl)amino]- 2oxoethyl)benzamid HPB N-hydroxy-4-[(N-(2-hydroxyethyl)-2-phenylacetamido) methyl) benzamid HT29 Tế bào ung thư ruột kết người IC50 Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration) IR Hồng ngoại (Infrared) JA16 Tế bào u lympho tế bào T K562 Tế bào ung thư bạch cầu nguyên bào KRIBB Viện nghiên cứu Sinh học Công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) LBH-589 Panobinostat m Đa vạch (Multiplet) MCL Micheliolid MeOH Methanol MM U đa tủy MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry NAD+ Nicotinamid adenin dinucleotid NCI-H23 Tế bào ung thư phổi người NMP N-methyl-2-pyrrolidon NST Nhiễm sắc thể PBS Dung dịch muối đệm phosphat (Phosphate-buffered saline) PC-3 Tế bào ung thư tiền liệt tuyến người PTCL U lympho tế bào T ngoại biên PXD101 Belinostat s Vạch đơn (Singlet) SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic Skbr3 Tế bào ung thư vú người SRB Sulforhodamin B SW620 Dòng tế bào ung thư đại tràng người TBAB Tetrabutyl amoni bromid TEA Triethylamin THF Tetrahydrofuran TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TMS Tetramethylsilan tonc Nhiệt độ nóng chảy TRAIL Thụ thể gây chết kích hoạt apoptosis TSA Trichostatin A U937 Tế bào ung thư bạch huyết người ZBG Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group) δ Độ dịch chuyển hóa học v Dao động hóa trị DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng tổng hợp 17 Bảng 3.1 Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (tnc) dẫn chất 32 Bảng 3.2 Kết phân tích phổ IR dẫn chất Va-f 32 Bảng 3.3 Kết phân tích phổ MS dẫn chất Va-f 33 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( H-NMR) dẫn chất Va-f 34 13 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR dẫn chất Vaf 35 Bảng 3.6 Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC tổng chọn lọc HDAC6 Va-f 37 Bảng 3.7 Kết đánh giá tính kháng tế bào ung thư dẫn chất Va-f 38 DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể hoạt động enzym HDAC, HAT Hình 1.2 Phân loại enzym HDAC Hình 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym HDAC 2+ Hình 1.4 Mơ hình xúc tác HDAC phụ thuộc Zn Hình 1.5 HDAC bệnh lý ung thư Hình 1.6 Cấu trúc dẫn chất ức chế HDAC Hình 1.7 Phân loại chất ức chế HDAC Hình 1.8 Cấu trúc chất có hoạt tính bật nghiên cứu C Salmi-Smail 10 Hình 1.9 Cấu trúc chất có hoạt tính bật nghiên cứu T.Wang 10 Hình 1.10 Cấu trúc dẫn chất có hoạt tính bật nghiên cứu Jiang 10 Hình 1.11 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Dương Tiến Anh 11 Hình 1.12 Cấu trúc dẫn chất ST8078AA1 11 Hình 1.13 Cấu trúc dẫn chất HPOB 12 Hình 1.14 Cấu trúc dẫn chất HPB 12 Hình 1.15 Các dẫn chất có hoạt tính bật nghiên cứu Ya-Hui Ding 15 Hình 1.16 Dẫn chất có hoạt tính bật nghiên cứu 16 Hình 3.1 Kết đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào dẫn chất Ve Vf 38 Hình 3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng lên chu trình apoptosis Ve Vf 39 Hình 3.3 Cấu trúc chung dẫn chất Va-f 42 Hình 3.4 Phổ hồng ngoại IR dẫn chất Va 42 Hình 3.5 Phổ khối lượng MS dẫn chất Va 43 Hình 3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR dẫn chất 5a 44 13 Hình 3.7 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR dẫn chất Va 45 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế enzym HDAC tổng HDAC6 dẫn chất Va-f với chất chứng dương SAHA 45 Hình 3.9 Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro dẫn chất Va-f với chất chứng dương SAHA 47 Hình 3.10 Kết đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào Ve Vf 48 Hình 3.11 Kết đánh giá ảnh hưởng lên chu trình apoptosis Ve Vf 49 DANH MỤC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1 Phản ứng tạo acid hydroxamic từ dẫn xuất ester Sơ đồ 1.2 Phản ứng tạo acid hydroxamic từ dẫn xuất acid hydroxamic Sơ đồ 1.3 Phản ứng Heck Sơ đồ 1.4 Phản ứng Heck nghiên cứu Ya-Hui Ding Sơ đồ 1.5 Phản ứng Heck nghiên cứu Narsimha R Penthalaa Sơ đồ 1.6 Phản ứng Heck nội phân tử nghiên cứu P Vijaya Babu Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình tổng hợp dẫn chất Va-f Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp chất trung gian II Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IIIa Sơ đồ 3.4 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IVa Sơ đồ 3.5 Phản ứng tổng hợp chất trung gian Va Sơ đồ 3.6 Sơ đồ trình tổng hợp chất Vb Sơ đồ 3.7 Sơ đồ trình tổng hợp chất Vc Sơ đồ 3.8 Sơ đồ trình tổng hợp chất Vd Sơ đồ 3.9 Sơ đồ trình tổng hợp chất Ve Sơ đồ 3.10 Sơ đồ trình tổng hợp chất Vf Sơ đồ 3.11 Cơ chế phản ứng ngưng tụ vòng 7-bromoquinazolin-4(3H)-on Sơ đồ 3.12 Cơ chế phản ứng N-alkyl hóa Sơ đồ 3.13 Cơ chế phản ứng Heck Sơ đồ 3.14 Cơ chế phản ứng tạo acid hydoxamic 13 14 14 15 16 16 23 23 24 24 25 26 27 28 29 30 39 40 40 41 Phụ lục 12: Phổ khối lượng dẫn chất Vf 12 Chú thích: 103A = Va Phụ lục 13: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Va 13 Chú thích: 103C = Vb Phụ lục 14: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vb 14 Chú thích: 103D = Vc Phụ lục 15: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vc 15 Chú thích: 103E = Vd Phụ lục 16: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vd 16 Chú thích: 103G = Ve Phụ lục 17: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Ve 17 Chú thích: 103F = Vf Phụ lục 18: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR dẫn chất Vf 18 Chú thích: 103A = Va Phụ lục 19: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Va 19 Chú thích: 103C = Vb Phụ lục 20: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vb 20 Chú thích: 103D = Vc Phụ lục 21: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vc 21 Chú thích: 103E = Vd Phụ lục 22: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vd 22 Chú thích: 10G = Ve Phụ lục 23: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Ve 23 Chú thích: 103F = Vf Phụ lục 24: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất Vf 24 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG BẢO NGỌC TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG QUINAZOLIN-4(3H)-ON HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2021 ... tính kháng tế bào ung thư tốt [31] [14] Để tiếp n? ??i mở rộng hướng nghi? ?n cứu tr? ?n, ti? ?n hành đề tài ? ?Tổng hợp đánh giá tác dụng kháng ung thư số d? ?n chất N- hydroxypropenamid mang khung quinazolin- 4(3H)- on. .. quinazolin- 4(3H)- on hướng ức chế histon deacetylase? ?? với hai mục tiêu: Tổng hợp d? ?n chất N- hydroxypropenamid mang khung quinazolin- 4(3H)- on (Va-f) Đánh giá hoạt tính sinh học chất tổng hợp, bao gồm: đánh. .. Ứng dụng ph? ?n ứng Heck tổng hợp d? ?n chất kháng ung thư Hi? ?n nay, nhiều d? ?n chất có hoạt tính kháng ung thư tổng hợp thông qua ph? ?n ứng Heck N? ?m 2013, nhóm nghi? ?n cứu Ya-Hui Ding sử dụng ph? ?n ứng