Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất tubulysin tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ VĂN HẢI TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC HÀ NỘI, 2020 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Viện Hoá học Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Trần Văn Lộc Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Trần Văn Chiến Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Các hợp chất thiên nhiên xem nguồn cung cấp vô hạn lớp chất có hoạt tính sinh học lý thú, phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng y học Sự phong phú đa dạng lớp khung chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt chế tác dụng lớp khung chất này, thu hút quan tâm nhà nghiên cứu từ trước đến Để phục vụ cho mục đích nghiên cứu phát triển thuốc, hợp chất từ nguồn vi sinh vật thường đạt cách tổng hợp toàn phần biến đổi cấu trúc hóa học nhằm tạo lượng lớn sản phẩm dẫn xuất Tubulysin lớp chất tetrapeptide (Hình 1.8) phân lập lần năm 2000 từ dòng niêm khuẩn Angiococcus disciformis An d48 Archangium gephyra Ar 315 Các nghiên cứu cho thấy tubulysin lớp chất kháng phân bào tốt biết đến Hoạt tính ức chế tế bào ung thư tubulysin thể phạm vi rộng nhiều dòng tế bào ung thư người như: ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ruột kết, phổi ung thư máu Nghiên cứu in vitro in vivo cho thấy tubulysin ức chế phát triển tế bào ung thư vượt trội khoảng 20-1000 lần so với thuốc chống ung thư sử dụng vinblastine, epothilone hay taxol Hình 1.8 Cơng thức hóa học tubulysin Từ quan điểm nhà hóa dược, tubulysin thiên nhiên lớp chất hàng đầu cho nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư Tuy nhiên, hàm lượng chúng niêm khuẩn thấp khơng đủ cho nghiên cứu chun sâu, hướng nghiên cứu tổng hợp toàn phần tubulysin dẫn xuất chúng cần thiết có ý nghĩa khoa học Mục tiêu nghiên cứu luận án Luận án tập trung tổng hợp số dẫn xuất chất tương tự tubulysin với thay nhóm N,O-acetyl nhóm methyl, thay đổi cấu trúc amino acid Methylpipecolic (Mep) đầu N-terminal amino acid tubuphenylalanine (Tup) đầu C-terminal Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào tetrapeptide tổng hợp số dòng tế bào ung thư người nhằm góp phần làm rõ thêm tương quan hoạt tính cấu trúc tubulysin, đồng thời tìm kiếm hợp chất có hoạt tính đáng ý Các nội dung nghiên cứu luận án + Nghiên cứu tổng quan niêm khuẩn.Tổng quan tubulysin: Hoạt tính sinh học, sinh tổng hợp tubulysin, tương quan hoạt tính-cấu trúc + Nghiên cứu tổng quan phương pháp tổng hợp ɤ-amino acid tubuphenylalanine (Tup) tubuvaline (Tuv) + Nghiên cứu tổng hợp ɤ-amino acid Tuv + Nghiên cứu tổng hợp ɤ-amino acid Tup + Tổng hợp dipeptide + Tổng hợp tripeptide + Tổng hợp tetrapeptide ( dẫn xuất chất tương tự tubulysin) + Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào tetrapeptide tổng hợp Bố cục luận án Luận án gồm 133 trang: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (28 trang), Chương 2: Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm (37 trang), Chương 3: Kết thảo luận (55 trang), kết luận (1 trang), danh mục cơng trình cơng bố liên quan luận án (1 trang) Phần tài liệu tham khảo có 97 tài liệu lĩnh vực liên quan đến luận án cập nhật đến năm 2020 Phần phụ lục 81 trang gồm phổ chất tổng hợp CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Niêm khuẩn, hoạt chất hoạt tính sinh học 1.2 Vi ống vai trò nghiên cứu thuốc 1.3 Tubulysin: Phân lập, xác định cấu trúc, hoạt tính sinh học Hình 1.10 Cấu trúc hóa học tubulysin thiên nhiên 1.4 Tổng hợp ɤ-amino acid tubulysin 1.5 Tƣơng quan cấu trúc hoạt tính sinh học dẫn xuất tubulysin Hình 1.17 Tương quan hoạt tính - cấu trúc tubulysin CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1 Phương pháp tổng hợp hữu 2.1.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu 2.1.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 2.2 Thực nghiệm 2.2.1 Hóa chất dung mơi 2.2.2 Sơ đồ tổng quát tổng hợp tetrapeptide Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng quát tổng hợp tetrapeptide 2.2.3 Tổng hợp tubuphenylalanine 2.2.4 Tổng hợp tubuvaline 2.2.5 Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc Tup Tuv 2.2.6 Tổng hợp dipeptide 2.2.7 Tổng hợp tripeptide 2.2.8 Tổng hợp dẫn xuất tubulysin 2.2.9 Tổng hợp chất tương tự tubulysin 2.2.10 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào tetrapeptide CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Định hƣớng tổng hợp dẫn xuất chất tƣơng tự tubulysin Sơ đồ 3.1 Định hướng tổng hợp dẫn xuất chất tương tự tubulysin 3.2 Tổng hợp tubuphenylalanine Phản ứng tổng hơp tubuphenylalanine acid (Tup) 47a L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (68), thơng qua quy trình bước phản ứng mơ tả sơ đồ 3.2 Đầu tiên, nhóm amino chất 68 bảo vệ nhóm tert-butoxycarbonyl qua phản ứng với Boc2O dung môi THF NaHCO3 nhiệt độ phòng 16 h thu sản phẩm 45 (94%) Sự chuyển hóa ester 45 thành aldehyde 52 tiến hành qua hai bước phản ứng liên tục, phản ứng khử hóa với NaBH4 dung mơi MeOH nhiệt độ phịng thời gian 20h thu hợp chất trung gian N-Boc-phenylalaninol (45a) mà không cần tinh chế qua cột sắc ký silica gel, với hiệu suất 96% Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp Tup 47a Sự chuyển hóa nhóm hydroxyl aldehyde tiến hành với tác nhân oxy hóa DMP (Dess Martin Periodinane) điều kiện hồi lưu dung môi DCM, EtOAc dung môi DMSO nhiệt độ phịng Tuy nhiên, q trình oxy hóa với tác nhân DMP khơng có chuyển hóa hồn tồn thành aldehyde Sản phẩm thu đạt hiệu suất khoảng 74% Bằng cách sử dụng tác nhân oxi hóa IBX (2-iodoxybenzoic acid) dung môi DCM EtOAc điều kiện đun hồi lưu, sản phẩm aldehyde 52 thu hiệu suất cao Kết cho thấy phản ứng sử dụng IBX đun hồi lưu EtOAc cho hiệu suất cao (94%) sản phẩm dùng trực tiếp cho phản ứng bước mà không cần tinh chế qua cột sắc ký silica gel Từ sản phẩm aldehyde 52, alkene 42 dễ dàng thu qua phản ứng ngưng tụ theo Horner-Wadsworth-Emmons hợp chất 52 với triethyl-2-phosphonopropionate NaH nhiệt độ từ 0-25 oC thời gian 14h (0 oC phút, nhiệt độ thường 14h) Phản ứng tạo sản phẩm alkene 42 (75%) với cầu hình E ưu tiên (tỷ lệ E/Z  75/25) Cấu hình E sản phẩm 42 xác định dựa phân tích liệu phổ 1H-, 13 C-NMR phổ hai chiều NOESY, kết hợp so sánh với phổ chất công bố Sản phẩm 42 chuyển thành acid 69 gắn mạch ester với menthol qua phản ứng Steglich 69 menthol, sau hydro hóa sản phẩm tạo thành nhận đồng phân lập thể không đối quang với tỷ lệ 47a/47b = 4,5/1, tách sản phẩm mong muốn 47a phương pháp sắc ký cột thông thường Cấu trúc hợp chất 47a khẳng định thông qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR, kết hợp so sánh phổ công bố 3.3 Tổng hợp tubuvaline 3.3.1 Tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy) methyl)thiazole (14) Để tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl) thiazole (14) lựa chọn thiourea làm tác nhân ban đầu theo phản ứng Hantzsch Phản ứng tiến hành thiourea với ethyl bromopyruvate điều kiện hồi lưu h dung môi ethanol thu hợp chất thiazole 70 dạng tinh thể sau sử lý phản ứng, với hiệu suất 75% (Sơ đồ 3.6) Sự chuyển hóa nhóm amine chất 70 thành 2-bromothiazole 71 thông qua phản ứng Sandmeyer cách xử lý với tác nhân NaNO2, CuSO4 KBr môi trường 30% H2SO4 oC h; sau đưa nhiệt độ phịng khuấy thêm 15h, xử lý thu sản phẩm 71 với hiệu suất 65% Ester 71 khử hóa thành hợp chất hydroxyl phản ứng với NaBH4 MeOH NaBH4 CaCl2 hỗn hợp dung môi EtOH/THF (với tỷ lệ 2/1) 16h nhiệt độ phòng Kết cho thấy, sử dụng tác nhân NaBH4 hỗn hợp dung môi EtOH/THF CaCl cho sản phẩm (2-bromothiazol-4-yl)methanol (72) đạt hiệu suất cao (95%) Sơ đồ 3.17: Quy trình tổng hợp dipeptide 84, 85, 86 3.6 Tổng hợp tripeptide 3.6.1 Tổng hợp tripeptide 88 Dipeptide 84 loại bỏ nhóm bảo vệ phản TFA có mặt TIPS/H2O thu muối trifluoroacetic Phản ứng muối trifluoroacetic với N-methylpipecolinic acid (Mep) dung môi DMF, tác dụng tác nhân ghép nối HATU (1.2 eq) DIPEA (10 eq) nhiệt độ phòng 14h (Sơ đồ 3.18) thu sản phẩm 88 với hiệu suất đạt 55% sau tinh chế cột silica gel Sơ đồ 3.18: Phản ứng tổng hợp tripeptide 88 Sản phẩm 88 khẳng định nhờ phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR 3.6.2 Tổng hợp tripeptide 89 Hợp chất 89 tổng hợp phản ứng acyl hóa dipeptide 86 với hợp chất 82 (1 eq) dung môi DMF, tác dụng tác nhân HATU (1.2 eq) DIPEA (10 eq) (Sơ đồ 3.19) Sau 14 h 13 khuấy nhiệt độ phòng, sản phẩm thu cách tinh chế cột sắc ký silica gel nhận chất 89 với hiệu suất 60% Trên phổ 1H-NMR chất 89 vùng trường thấp thể tín hiệu cộng hưởng đặc trưng proton vịng thiazole 8,05 ppm singlet (1H, H-9), tín hiệu cộng hưởng đặc trưng proton vòng phenyl 7,29 -7,21 ppm (5H) Tín hiệu doublet đặc trưng proton E-olefin (H-4) cộng hưởng 6,67 ppm (J = Hz) Tín hiệu singlet CH3-N 3,01 ppm (3H) Tín hiệu singlet cộng hưởng 2,16 ppm proton nhóm acetyl (OAc) Tín hiệu singlet 1,41 ppm cuản nhóm Boc (9H) Sơ đồ 3.19: Phản ứng tổng hợp tripeptide 89 3.6.3 Tổng hợp tripeptide 90, 90b Để tổng hợp dẫn xuất mà thay nhóm Mep đầu N tetrapeptide acid khác, tripeptide 90 90b tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ hợp chất 85/86 với hợp chất 81 dung môi DMF, tác dụng HATU DIPEA nhiệt độ phòng 14 h (Sơ đồ 3.20) Sản phẩm tripeptide 90, 90b thu với hiệu suất phản ứng đạt 60-65% Sản phẩm 90, 90b khẳng định qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR 14 Sơ đồ 4.20: Phản ứng tổng hợp tripeptide 90, 90b 3.6.4 Tổng hợp tripeptide 91, 92 Tương tự, từ dipeptide 85 86 tripeptide 91 92 tổng hợp phản ứng với phenylalanine methyl ester hydrochloride dung mơi DMF, nhiệt độ phịng thời gian 14h (Sơ đồ 3.21) Các sản phẩm tinh chế cột sắc ký silica gel (nHexan/EtOAc; 1/1) thu sản phẩm tương ứng 91 92 với hiệu suất 55- 60% Sơ đồ 3.21: Phản ứng tổng hợp tripeptide 91, 92 Các sản phẩm 91, 92 khẳng định nhờ phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR 3.7 Tổng hợp dẫn xuất tubulysin N-Methyltubulysin U (95) tổng hợp qua phản ứng (Sơ đồ 3.22) Tripeptide 90b, 90 loại bỏ nhóm bảo vệ Boc TFA tiếp sau phản ứng amide hóa với N-methylpipecolinic acid dung mơi DMF HATU có mặt DIPEA thu tetrapeptide 93 93a Sản phẩm ester 93 sau thủy phân nhóm menthyl để tạo dẫn xuất tubulysin Để có sở cho phản ứng thủy phân dẫn xuất ester chứa nhóm menthyl, chúng tơi tiến hành nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân dẫn xuất 93, với tác nhân LiOH KOH hỗn hợp dung mơi THF/H2O Kết cho thấy nhóm menthyl bị thủy phân tác dụng bazơ mạnh KOH nhiệt độ 45-50 oC thời gian từ 48 giờ, sản phẩm 94 (N-Methyltubulysin V) thu với hiệu suất 92 % Cấu trúc 94 xác định dựa phân tích phổ HRMS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân so sánh với phổ chất công bố [11,48] Tetrapeptide 94 tiếp tục acetyl hóa nhóm 15 OH tự phản ứng với acetic anhydride DCM, TEA 1% mol DMAP thu sản phẩm N-Methyltubulysin U (95) với hiệu suất phản ứng đạt 90% Phổ khối lượng HRMS-ESI chất 95 xuất ion giả phân tử m/z = 728.4051 [M+H]+, (Tính cho C38H58N5O7S: 728.4057), kết phù hợp với CTPT C38H57N5O7S Sơ đồ 3.22: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 93a,93,94,95 Trên phổ 1H-NMR chất 95 thể đầy đủ tín hiệu proton tương ứng Ở vùng trường thấp tín hiệu proton vịng thiazole cộng hưởng singlet 8,10 ppm (H-9), tín hiệu proton vịng phenyl 7,26-7,17 ppm (5H) Tín hiệu cộng hưởng doubtlet-doublet 5,73-5,70 ppm đặc trưng proton H-11 liên kết OAc Tín hiệu singlet proton nhóm CH3-N Tuv 3,10 ppm (H-17), CH3-N vịng pipecolinic (H-6’) 2,40 ppm Ngồi ra, tín hiệu singlet đặc trưng nhóm CH3-acetyl 2,15 ppm Phổ 1H-NMR chất 95 có tín hiệu tương đồng với phổ chất cơng bố trước [11,48,49] 3.8 Tổng hợp chất tƣơng tự tubulysin 3.8.1 Tổng hợp chất tương tự tubulysin với thay isoleucine leucine 16 Phản ứng thực từ tripeptide 87 qua phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ Boc TFA hai phản ứng ghép nối liên tiếp với Nmethylpipecolinic muối trifluoroacetic 81, sản phẩm ester tạo thành acetyl hóa nhóm OH tự thu 96 với hiệu suất chung đạt 45% Sản phẩm 96 xác định qua phân tích phổ ESI-MS, 1H, 13CNMR Sơ đồ 3.24: Phản ứng tổng hợp hợp chất 96 3.8.2 Tổng hợp chất tương tự tubulysin với thay amino acid đầu N-terminal Các hợp chất 97, 98 tổng hợp từ tripeptide 90 qua phản ứng liên tiếp (Sơ đồ 3.25) Các phản ứng thực tương tự tổng hợp N-Methyltubulysin U (95) Các sản phẩm 97, 98 khẳng định thông qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-, 13C-NMR 17 Sơ đồ 3.25: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 97, 98 Phổ 1H-NMR chất 97, 98 có tín hiệu cộng hưởng tương tự phổ chất 95 (N-Methyltubulysin U), phổ chất 97, 98 xuất thêm tín hiệu proton dị vòng picolinic isoquinoline vùng trường thấp, đồng thời tín hiệu đặc trưng proton nhóm methyl liên kết nitơ 2,21 ppm tín hiệu proton methylene no vòng pipecolinic 1,2-1,7 ppm Các hợp chất 99, 100, 101 ester menthol tạo thành phản ứng ghép mạch tripeptide 90 90b với 5-methylpyrazine-1carboxylic N- allylpipecolinic acid (Sơ đồ 3.26, 3.27) Sơ đồ 3.26 Phản ứng tổng hợp hợp chất 99 Sơ đồ 3.27 Phản ứng tổng hợp hợp chất 100, 101 Cấu trúc 99, 100, 101 khẳng định dựa vào phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR Trên phổ 1H-NMR chất 100 thể đầy đủ tín hiệu cộng hưởng đặc trưng proton dị vòng thơm, proton vịng thiazole nhóm phenyl Các tín hiệu cộng hưởng vùng trường thấp gồm: tín hiệu proton vòng pyrazine 9,11 ppm (singlet) quy cho proton H-4’, tín hiệu proton H-2’ singlet 8,59 ppm Tín hiệu proton vòng thiazole cộng hưởng 8,10 ppm (H-9) Các tín hiệu proton vịng phenyl cộng hưởng 7,27-7,18 ppm 18 3.8.3 Tổng hợp chất tương tự tubulysin với thay amino acid đầu C-terminal Các tetrapeptide 102, 103 tổng hợp từ muối trifluoroacetic tripeptide 89, qua phản ứng ghép nối với N-Methylpipecolinic acid, ester 102 nhận với hiệu suất đạt 60% Ester 102 tiếp tục xử lý với LiOH hỗn hợp dung môi THF/H2O thu acid 103 với hiệu suất phản ứng 92% (Sơ đồ 3.28) Sơ đồ 3.28: Phản ứng tổng hợp hợp chất 102, 103 Sản phẩm ester 102 acid 103 xác định qua phân tích phổ ESI-MS, 1H, 13C-NMR Phổ 1H-NMR chất 102 có vùng tín hiệu tương tự phổ chất 89, ngồi phổ chất 102 khơng xuất tín hiệu nhóm bảo vệ Boc 1,4 ppm mà xuất tín hiệu singlet 2,21 ppm đặc trưng proton H-6’ vòng pipecolinic Trong hướng tổng hợp khác, hợp chất 104 tổng hợp từ tripeptide 88 qua phản ứng liên tiếp (Sơ đồ 3.29), sản phẩm 104 nhận với hiệu suất chung đạt 43 % sau tinh chế sắc ký cột silica gel Sơ đồ 3.29 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 104 19 3.8.4 Tổng hợp chất tƣơng tự tubulysin với thay amino acid đầu N- C-terminal 3.8.4.1 Tổng hợp các chất tương tự tubulysin từ tripeptide 89 Muối trifluoroacetic 89 phản ứng với 5- methylpyrazin-1-carboxylicvà isoquinoline-1-carboxylic acid dung môi DMF với tác nhân ghép mạch amid HATU, có mặt bazơ DIPEA (Sơ đồ 3.30) Phản ứng thực nhiệt độ phòng 12 h Sản phẩm tinh chế cột sắc ký silica gel với hệ dung môi nHexan/EtOAc (1/1) nhận ester 105, 106 với hiệu suất đạt từ 55-65% Sơ đồ 3.30: Phản ứng tổng hợp hợp chất 105, 106 Các sản phẩm 105, 106 khẳng định thông qua việc phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân ESI-MS, 1H-, 13C-NMR, DEPT90 Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR chất 105 thể đầy đủ tín hiệu cộng hưởng đặc trưng proton Ester 106 xử lý với 10 đương lượng LiOH hỗn hợp dung môi THF/H2O, phản ứng thực nhiệt độ phòng 12h, nhận axit 107 với hiệu suất đạt 93% (Sơ đồ 3.31) Sản phẩm tetrapeptide 107 khẳng định nhờ phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR Sơ đồ 3.31 Phản ứng tổng hợp acid 107 20 Phổ 1H-NMR chất 107 xuất đầy đủ tín hiệu cộng hưởng đặc trưng tương tự phổ chất 105 Ngoài phổ chất 107 tín hiệu singlet đặc trưng ba proton nhóm acetyl 2,19 ppm tín hiệu multiplet proton nhóm ethoxy 4,21-4,16 ppm (2H) 3.8.4.2 Tổng hợp chất tương tự tubulysin từ tripeptide 91 Muối trifluoroacetic 91 phản ứng với 5-methylpyrazin cacboxylic acid (1eq) dung mơi DMF, với có mặt tác nhân HATU DIPEA (Sơ đồ 3.32) Phản ứng thực nhiệt độ phòng khoảng 12h, tinh chế sản phẩm thô cột sắc ký silica gel sản phẩm 108 Ester 108 tiếp tục thủy phân với LiOH hỗn hợp dung môi THF/H2O Phản ứng thực nhiệt độ phòng 24h thu sản phẩm tetrapeptide 109 với hiệu suất 90% Sơ đồ 3.32 Phản ứng tổng hợp hợp chất 108, 109 Trên phổ 1H-NMR chất 108 vùng trường thấp xuất tín hiệu cộng hưởng đặc trưng proton vịng pyrazin 9,21 ppm (1H, s, H-4’), tín hiệu singlet 8.46 ppm tương ứng với proton H-2’ Tín hiệu singlet proton vòng thiazole 8.06 ppm (1H, H-6), tín hiệu cộng hưởng đặc trưng proton vịng phenyl 7.30 -7.16 ppm (5H) Tín hiệu (td) đặc trưng 5.68-5.66 ppm proton H-8 (1H) Tín hiệu công hưởng proton H-2 H-16 5.06-4.99 ppm (2H, m) 21 Trong hướng tổng hợp khác, muối trifluoroacetic 92 phản ứng với 5-methylpyrazin cacboxylic acid (1 eq) điều kiện tương tự (Sơ đồ 3.34) Sản phẩm tetrapeptide 110 thu với hiệu suất 64 % sau tinh chế cột sắc ký silica gel Sơ đồ 3.34 Phản ứng tổng hợp hợp chất 110 Sản phẩm 110 xác định qua phân tích phổ ESI-MS, phổ H-NMR 3.9 Hoạt tính gây độc tế bào dẫn xuất chất tƣơng tự tubulysin Các tetrapeptide tổng hợp được thử nghiệm gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người gồm: tế bào ung thư vú- MCF7 (Human breast carcinoma), tế bào ung thư phổi người-A549 (human lung adenocarcinoma), tế bào ung thư ruột kết người- HT29 (human colorectal adenocarcinoma), tế bào ung thư bạch cầu cấp ngườiHL60 (human acute leukemia), tế bào ung thư đại tràng ngườiSW480 (human colon carcinoma), với chất đối chứng ellipticine Kết thể bảng 3.1 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Bảng 3.1) cho thấy tubulysin nhóm Mep thay dị vòng 3methylpicolinic acid, 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid 2- quinolinecarboxylic acid thể hoạt tính gây độc tế bào yếu so với hợp chất có gắn nhóm Mep từ 20-50 lần; độc tế bào (IC50 > 50 M) Ví dụ thấy chất 100 93a, khác nhóm Mep 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid khác biệt tới 34 lần; hay chất 97 95, hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào 22 ung thư HT29 giảm 50 lần nhóm Mep thay 3methylpicolinic acid Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào dẫn xuất chất tương tự tubulysin STT Hợp chất 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 93a 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 Ellipticine HT29 1.45 4.38 0.56 4.76 32.37 15.12 >50 >50 24.38 0.27 2.60 >50 28.57 >50 >50 >50 7.57 42.91 0.32 A549 1.46 4.61 0.42 6.82 44.75 17.91 >50 >50 25.87 0.30 3.33 >50 39.14 >50 >50 >50 9.38 29.20 0.36 IC50 (µM) MCF-7 SW480 HL-60 3.26 0.91 0.43 4.83 1.99 1.47 0.68 0.25 0.14 9.88 n.d n.d 34.53 33.28 26.54 13.34 13.13 10.57 >50 n.d n.d >50 n.d n.d 29.84 n.d n.d 0.23 0.11 0.08 4.49 2.32 1.21 >50 >50 >50 27.13 19.37 15.98 n.d n.d >50 >50 n.d n.d n.d n.d >50 n.d n.d 12.46 n.d n.d 29.45 0.35 0.31 0.33 * n.d: Không xác định So sánh acid dị vịng, hợp chất gắn 2quinolinecarboxylic acid có hoạt tính mạnh so với hợp chất gắn 3-methylpicolinic acid, 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid (chất 98 so với 97; 99) Kết cho thấy việc thay Mep amino acid methyl-N hóa vị trí α (tạo thành amine bậc 3) so 23 với nhóm carboxylic có vai trị quan trọng việc trì hoạt tính gây độc tế bào tubulysin Kết độc tế bào chất 93a, 94 95 dòng tế bào ung thư cho thấy vai trị quan trọng nhóm OAc mạch tubuvaline Khi khơng có nhóm acetyl, hoạt tính gây độc 94 dòng tế bào ung thư HT29, A549, MCF7, SW480 HL-60 tương ứng IC50: 4.38, 4.61, 4.83, 1.99, 1.47 M, yếu so với dẫn xuất acetyl hóa 95 từ đến 11 lần (IC50 95 dòng tế bào ung thư tương ứng 0.56, 0.42, 0.68, 0.25 0.14 M) Đặc biệt, thay nhóm Tup đầu C hợp chất không no (dẫn xuất 102 103) thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh so với dẫn xuất tubulysin chứa nhóm Tup Điều thể so sánh kết gây độc tế bào với 93a, 94 95 So với chất 94, chất 103 thể hoạt tính gây độc tế bào khơng khác nhiều dịng SW480 MCF7 Tuy nhiên, dòng A549, HT29 HL60, dẫn xuất 103 có hoạt tính mạnh so với 94 Tương tự, sản phẩm ester 102 thể hoạt tính mạnh nhiều so với dẫn xuất ester 93 Một điều ngạc nhiên, hợp chất 102 có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm mạnh so với hợp chất N-Methyltubulysin U (95) Kết gợi ý cho việc nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất tubulysin mà đầu C-terminal thay nhóm đơn giản, dẫn đến đơn giản hóa quy trình tổng hợp tubulysin Ngồi ra, thay nhóm phenylalanine đầu C-terminal nhóm 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid đầu Nterminal cho kết gây độc tế bào trung bình yếu 24 KẾT LUẬN Luận án áp dụng phương pháp tổng hợp hữu đại như: ngưng tụ Horner-Wadsworth-Emmons, phản ứng Arndt-Eistert, Sandmeyer, phản ứng tổng hợp Weinreb amit, phản ứng Dondoni, Hantzsch, Steglich, tổng hợp hai ɤ-amino acid tubulysin tubuvalin tubuphenylalanin Đã tổng hợp thành công 04 dipeptide 06 tripeptide ( gồm hợp chất từ 84-92) 19 tetrapeptide (17 chất mới) dẫn xuất chất tương tự tubulysin, bao gồm: + 04 dẫn xuất tubulysin, gồm hợp chất 93, 93a, 94, 95 ( chất 93 93a) + 01 chất tương tự tubulysin với thay isoleucine leucine (96) + 05 chất tương tự tubulysin với thay amino acid đầu N-terminal, gồm hợp chất 97, 98, 99, 100, 101 + 03 chất tương tự tubulysin với thay amino acid đầu C-terminal, gồm hợp chất 102, 103, 104 + 06 chất tương tự tubulysin với thay amino acid đầu Nvà C-terminal, gồm hợp chất 105, 106, 107, 108, 109, 110 Các sản phẩm trung gian tetrapeptide khẳng định dựa việc phân tích phổ 1D-, 2D-NMR, HR-ESI-MS Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 18 tetrapeptide dẫn xuất chất tương tự tubulysin tổng hợp dòng tế bào ung thư người HT29, A549, MCF-7, HL60 SW480 Kết cho thấy thay Mep acid dị vịng tạo sản phẩm tetrapeptide khơng có hoạt tính hoạt tính gây độc tế bào yếu Các sản phẩm có gắn Mep đầu N-terminal giữ nguyên thay nhóm Tup hợp chất khơng no có hoạt tính gây độc tế bào tốt dòng tế bào ung thư thử nghiệm 25 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án lựa chọn điều kiện đơn giản, dễ dàng thực cho hiệu suất cao tổng hợp hai ɤ-amino acid tubulysin tubuvalin tubuphenylalanin dẫn xuất tubulysin Luận án thiết kế tổng hợp thành công 10 chất trung gian tubulysin (04 dipeptide 06 tripeptide) 17 tetrapeptide dẫn xuất chất tương tự tubulysin Luận án xác định hoạt tính gây độc tế bào 16 tetrapeptide dòng tế bào ung thư người HT29, A549, MCF-7, HL60 SW480, tetrapeptide 93a, 102 103 có hoạt tính gây độc tế bào đáng ý Đặc biệt chất tương tự tubulysin 102 có hoạt tính gây độc tế bào (IC50: 0.27 - 0.08 µM) mạnh dẫn xuất N-Methyltubulysin V (94) N- Methyltubulysin U (95) dịng tế bào thử nghiệm 26 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN LUẬN ÁN ĐÃ CƠNG BỐ Hai Le Van, Loc Tran Van, Anh Tran Tuan, Thao Tran Thi Phuong, Sung Tran Van, Chien Tran Van Biological Activity of Tubulysin Analogues Tetrahedron, 2020 (Bản thảo gửi đăng) Hai Le Van, Loc Tran Van, Anh Tran Tuan, Thao Tran Thi Phuong, Sung Tran Van, Chien Tran Van Total synthesis and cytotoxicity evaluation of tubulysin analogues containing nitrogen heterocyclic acids Natural Product Research, 2020 (Bản thảo gửi đăng) Lê Văn Hải, Trần Tuấn Anh, Trần Văn Lộc, Trần Văn Chiến Tổng hợp số dẫn xuất tubuphenylalanine acid (tup) Tạp chí Hóa học, 2019, 57(4e3,4), 31-34 Lê Văn Hải, Trần Tuấn Anh, Trần Văn Lộc, Trần Văn Chiến Tổng hợp chọn lọc lập thể tubuphenylalanine axit (Tup) tubulysin Tạp chí Hóa học, 2017, 55(3), 384-387 ... 2.2.6 Tổng hợp dipeptide 2.2.7 Tổng hợp tripeptide 2.2.8 Tổng hợp dẫn xuất tubulysin 2.2.9 Tổng hợp chất tương tự tubulysin 2.2.10 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào tetrapeptide CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ... C-terminal Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào tetrapeptide tổng hợp số dòng tế bào ung thư người nhằm góp phần làm rõ thêm tương quan hoạt tính cấu trúc tubulysin, đồng thời tìm kiếm hợp chất có hoạt tính. .. tính đáng ý Các nội dung nghiên cứu luận án + Nghiên cứu tổng quan niêm khuẩn .Tổng quan tubulysin: Hoạt tính sinh học, sinh tổng hợp tubulysin, tương quan hoạt tính- cấu trúc + Nghiên cứu tổng quan