Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ nguồn rong biển đỏ nhằm bổ sung thêm nguồn chất màu tự nhiên cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Chất màu Rphycoerythrin tinh khiết có thể sử dụng trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học. Nghiên cứu của đề tài tập trung vào quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin bằng phương pháp ngâm trong dung môi và phương pháp enzyme thủy phân nhằm mục đích thu nhận R-phycoerythrin đạt năng suất cao với các thông số công nghệ tối ưu.
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHẤT MÀU TỰ NHIÊN R-PHYCOERYTHRIN TỪ RONG BIỂN ĐỎ Mã số: B2018-ĐN06-14 Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN HỮU PHƯỚC TRANG Đà Nẵng, Tháng năm 2020 BÁO CÁO TÓM TẮT i DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI STT Họ tên Vai trò TS Nguyễn Hữu Phƣớc Trang Chủ nhiệm ThS Trần Thị Ngọc Linh Thành viên ThS Huỳnh Ngọc Bích Thành viên TS Lê Thị Diệu Hƣơng Thƣ ký khoa học ii Đơn vị công tác Khoa Công nghệ Hóa học – Mơi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng Khoa Cơng nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng Khoa Cơng nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng Khoa Cơng nghệ Hóa học – Mơi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI i MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU vii INFORMATION ON RESEARCH RESULTS xi TÍNH CẤP THIẾT ĐỀ TÀI CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Rong biển đỏ Gracilaria 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Sự phân bố loài Gracilaria 1.1.3 Thành phần hóa học 1.2 R-Phycoerythrin CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin 2.3 Tinh R-phycoerythrin 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu R-phycoerythrin 3.1.1 Nghiên cứu chiết xuất R-PE phƣơng pháp ngâm 3.1.2 Nghiên cứu chiết xuất R-PE phƣơng pháp thủy phân 3.1.3 Tối ƣu hóa điều kiện chiết xuất phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 3.2 Nghiên cứu tinh R-phycoerythrin phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 11 3.3 Đề xuất quy trình chiết xuất R-phycoerythrin 14 3.3.1 Đề xuất quy trình chiết xuất R-PE phƣơng pháp ngâm 14 3.4.2 Quy trình chiết xuất R-PE phƣơng pháp thủy phân 14 3.5 Đề xuất quy trình tinh R-PE 15 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 16 iii DANH MỤC HÌNH SỐ HIỆU HÌNH 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 TÊN HÌNH Hàm lƣợng protein (A), R-PE (B) từ Gracilaria gracilis Biểu đồ bề mặt đáp ứng suất R-PE (mg/g CK) theo thời gian thủy phân, tỷ lệ E/S nhiệt độ thủy phân A: mặt đáp ứng tƣơng tác thời gian tỷ lệ E/S; B: mặt đáp ứng tƣơng tác nhiệt độ tỷ lệ E/S; C: mặt đáp ứng tƣơng tác nhiệt độ thời gian thủy phân Sắc ký đồ dung dịch chiết thô CE1 từ Gracilaria gracilis cột DEAE Sepharose Các phân đoạn rửa giải: A: AE-150/AE200/AE-1000; B: AE-150/AE-250/AE-1000; C: AE-150/AE-300/AE-1000 Ghi chú: Sắc ký đồ đƣợc theo dõi quang phổ UV-visible 280nm ( -), 565nm ( ), nồng độ NaCl (……) Quang phổ hấp thụ, sắc ký đồ lọc gel phân đoạn AE-200 Điện di đồ phân đoạn nhận đƣợc sau qua cột sắc ký trao đổi ion Sơ đồ quy trình cơng nghệ chiết xuất R-PE phƣơng pháp ngâm Sơ đồ quy trình cơng nghệ chiết xuất R-PE phƣơng pháp thủy phân Sơ đồ quy trình cơng nghệ tinh R-PE iv TRANG 10 12 13 13 14 14 15 DANH MỤC BẢNG BIỂU SỐ HIỆU BẢNG 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 TÊN BẢNG Hàm lƣợng R-PE số độ tinh khiết PI tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nƣớc đƣợc khảo sát Chất lƣợng R-PE thời điểm đƣợc khảo sát Hàm lƣợng R-PE, PI, protein hòa tan Gracilaria gracilis sau đƣợc chiết xuất từ dung môi khác Ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế phức hợp trung tâm CCD (n=3) Bảng tóm tắt kết hàm lƣợng R-PE, số độ tinh khiết R-PE thu đƣợc từ rong biển sấy Gracilaria gracilis Hàm lƣợng R-PE PI dịch chiết thô (CE) Gracilaria gracilis phân đoạn sau tinh v TRANG 6 10 13 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT R-PE: R-phycoerythrin G.gracilis: Gracilaria gracilis G.: Gracilaria RSM: Response surface methodology CE: Crude Extract CEVA: Centre d’Étude et de Valorisation des Algues FAO: Food and Agriculture Organisation PI: Purity Index kDa: Kilo Dalton AE: Anion exchange CK: Chất khô vi ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Đơn vị: Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật - THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên Rphycoerythrin từ rong biển đỏ - Mã số: B2018-ĐN06-14 - Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Hữu Phƣớc Trang - Tổ chức chủ trì: Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật - Thời gian thực hiện: 08/2018 – 07/2020 Mục tiêu: Nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ nguồn rong biển đỏ nhằm bổ sung thêm nguồn chất màu tự nhiên cho ngành công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Chất màu Rphycoerythrin tinh khiết sử dụng lĩnh vực y học công nghệ sinh học Nghiên cứu đề tài tập trung vào quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin phƣơng pháp ngâm dung mơi phƣơng pháp enzyme thủy phân nhằm mục đích thu nhận R-phycoerythrin đạt suất cao với thông số cơng nghệ tối ƣu Ngồi ra, nghiên cứu bƣớc đầu tinh chất màu phƣơng pháp khác nhằm thu nhận sản phẩm R-PE tinh khiết Tình sáng tạo: Nghiên cứu đƣa đƣợc dẫn liệu khoa học ảnh hƣởng phƣơng pháp chiết xuất đến trình chiết xuất rong biển đỏ Đồng thời bƣớc đầu tinh chất màu R-PE đạt đƣợc số độ tinh khiết cao Kết nghiên cứu: - Tiền xử lý nguyên liệu công đoạn quan trọng trình chiết xuất R-phycoerythrin Phƣơng pháp sấy thăng hoa vii nguyên liệu nghiền nitơ lỏng mang lại hiệu chiết xuất RPE cao - Hai phƣơng pháp chiết xuất R-PE đƣợc nghiên cứu: sử dụng dung môi chiết xuất (nƣớc, nƣớc cất dung dịch đệm phosphate 20 mM, pH 7,1) sử dụng enzyme thủy phân polysaccharide (xylanase, cellulase β-glucanase) Năng suất thu nhận R-PE từ phƣơng pháp thủy phân đạt 12.76 mg g-1 dw - Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân phƣơng pháp bề mặt đáp ứng điều kiện (nhiệt độ (32C), thời gian (286 phút), enzyme cellulase/rong biển sấy (47 mg g-1), hàm lƣợng R-phycoerythrin thu nhận đƣợc đạt giá trị 15.75 mg g-1 dw - R-phycoerythrin tinh khiết thu đƣợc với số độ tinh khiết cao (A565/A280) đạt 3.25 (chỉ số độ tinh khiết tiêu chuẩn = 3.2) sau tinh phƣơng pháp sắc ký với cột DEAE Sepharose với phân đoạn thu nhận nồng độ muối NaCl 200 mM Sản phẩm: 5.1 Sản phẩm khoa học + 01 Bài báo Tạp chí Quốc tế thuộc danh mục SCI: Purification of R-phycoerythrin from a marine macroalga Gracilaria gracilis by anion-exchange chromatography (2020) Huu Phuoc Trang Nguyen, Michốle Moranỗais, Paul Dộlộris, Joởl Fleurence, Chau Thanh Nguyen-Le, Khanh Ha Vo, Justine Dumay Journal of Applied Phycology, 32, 553–561 + 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc tế: 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018) Extracting and purifying pigment R-phycoerythrin from the red alga Mastocarpus stellatus” Tác giả: Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Moranỗais, Joởl Fleurence, Thi Ngoc Linh Tran, Justine Dumay 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018), 573-578 + 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc gia: Hội thảo khoa học quốc gia “Ứng dụng cơng nghệ cơng trình Xanh (AtiGB 2018) viii Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện thủy phân đến trính thu nhận R-phycoerythrin từ Gracilaria gracilis Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng 11(132).2018, Quyển 2; Trang: 166170 5.2 Sản phẩm ứng dụng + 100 ml mẫu R-phycoerythrin từ rong biển đỏ + 01 Qui trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ rong biển đỏ Cung cấp đầy đủ công đoạn thông số kỹ thuật đƣợc Hội đồng Khoa chuyên ngành thông qua Phƣơng thức chuyển giao, địa ứng dụng, tác động lợi ìch mang lại kết nghiên cứu: 6.1 Phƣơng thức chuyển giao Khoa Cơng nghệ Hóa học – Mơi trƣờng, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật, Đại học Đà Nẵng 6.2 Địa ứng dụng Có thể chuyển giao cơng nghệ cho sở chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm nƣớc 6.3 Tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu + Đối với lĩnh vực giáo dục đào tạo Đề tài áp dụng công nghệ đại, thiết bị tiên tiến nhƣ công nghệ nghiền nhỏ nguyên liệu nitơ lỏng, thiết bị sấy thăng hoa, tinh chất màu R-phycoerythrin thiết bị sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel… + Đối với lĩnh vực khoa học công nghệ có liên quan - Đề tài đƣợc sử dụng làm tài liệu tham khảo phƣơng pháp nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin theo phƣơng pháp khác nhƣ phƣơng pháp chiết dung môi, thủy phân enzyme - Tăng số lƣợng báo công bố nƣớc quốc tế cho ĐHĐN + Đối với phát triển kinh tế-xã hội - R-PE thu nhận từ rong biển sử dụng thay chất màu tổng hợp, ứng dụng ngành chế biến thực phẩm, mỹ phẩm - Đa dạng hóa sản phẩm thu nhận từ rong biển ix CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Rong biển đỏ Gracilaria 1.1.1 Giới thiệu chung Gracilaria chi lớn rong biển đỏ Rhodophyta, với 150 loài đƣợc cơng bố (Byrne et al 2002), có giá trị kinh tế quan trọng nhƣ nguồn cung cấp agar, nguồn thức ăn cho ngƣời loài động vật giáp xác (Armisen 1995) Chi Gracilaria thuộc ngành rong đỏ, nhiên loài chi lại tồn nhiều màu sắc khác bao gồm: đen, vàng, xanh đỏ Những lồi rong biển thay đổi màu sắc phụ thuộc vào thành phần sắc tố chúng, chịu ảnh hƣởng từ nguồn ảnh sáng (Ramus et al 1983), thời gian năm, vị trí địa lý (Paul et al 2014), phối hợp lồi rong biển có màu sắc khác (Plastino et al 1999) hay màu sắc chúng bị biến tính (Marevita 2013) 1.1.2 Sự phân bố loài Gracilaria Các loài rong biển đỏ Gracilaria hầu nhƣ phân bố tồn giới có khả chịu đƣợc biến đổi sinh thái lớn (Hình 1.8) (Perez et Barbaroux 2016) Chúng đƣợc tìm thấy vùng biển từ vĩ độ 600 bắc, 400 nam vùng nƣớc lạnh (Kling 1978) Theo FAO, tổng thu hoạch loài Gracilaria vào năm 2011 giới đạt khoảng 2.257.919 tấn, đạt 3.538.655 vào năm 2014 Các lồi Gracilaria thƣờng đƣợc ni trồng phổ biến Trung quốc (1.513.590 tấn) Đài Loan (khoảng 4.865 tấn) Các loài 94,2% (khoảng 697.240 tấn) đƣợc thu hoạch từ ni trồng, phần cịn lại (42.224 tấn) từ nguồn tự nhiên Các nƣớc ni trồng lồi Gracilaria châu Mỹ nhƣ Chilê, Peru, Argentine, châu Á bao gồm Trung quốc, Đài loan, Indonesia, Vietnam, Philipin, Hàn quốc 1.1.3 Thành phần hóa học Gracilaria có khoảng 300 lồi, 160 lồi đƣợc định danh (Francavilla et al 2013) Các loài mang lại giá trị kinh tế quan trọng công nghiệp công nghệ sinh học (Capo et al 1999) Qua tài liệu tham khảo cho thấy, hàm lƣợng protein loài Gracilaria dao động từ 5,2% đến 45% tùy theo lồi Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đối tƣợng loài Gracilaria gracilis Hàm lƣợng lipid loài Gracilaria thấp (nhỏ 4%) Đây lí lồi tảo biển đƣợc sử dụng nhƣ thực phẩm lƣợng thấp (Chey et al 2017) Ngồi ra, rong biển đỏ nguồn khống cao Hàm lƣợng tro từ % - 43 % Hàm lƣợng carbohydrate từ loài đạt hàm lƣợng cao (10,2% - 46,6 %) 1.2 R-Phycoerythrin R-phycoerythrin (R-PE) protein oligomaric có khối lƣợng phân tử khoảng 240.000 Da, bao gồm đơn vị α (20 kDa), đơn vị β (20 kDa) đơn vị γ (khoảng 30 kDa) Quang phổ hấp thụ R-PE thể ba đỉnh, đỉnh cao 565 nm (Munier et al 2015) R-phycoerythrin mang màu hồng tím chất màu quan trọng công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm, chẩn đoán miễn dịch, trị liệu, mỹ phẩm, đánh dấu tế bào q trình phân tích (Dumay et al 2014) Do đặc tính quang học nó, phycoerythrin đƣợc sử dụng rộng rãi kỹ thuật sinh hóa chẩn đốn lâm sàng Gần đây, khả chống ung thƣ R-PE ba tiểu đơn vị α, β, γ đƣợc tìm thấy thử nghiệm mơ hình tế bào (các tế bào khối u chuột, tế bào ung thƣ biểu mơ gan ngƣời) R-PE có tác dụng làm tắc mạch máu khối u với cảm ứng tế bào chết đƣợc lập trình dƣờng nhƣ chế chủ yếu tiểu đơn vị R-PE (Denis et al 2009) R-Phycoerythrin mang hai loại phycobilins (phycoerythrobilin phycourobilin) Theo nghiên cứu gần rằng: R-PE mang cấu trúc khác tùy thuộc vào loại rong biển: (αβ)3 γ (αβ) 3γ'(260 kDa) (Glazer 1994 ; Munier et al 2015) γ (αβ) γ'(αβ) γ (Wang et al 2015) CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Rong biển đỏ Gracilaria gracilis Rong biển đƣợc thu hoạch từ vùng biển Batz-sur-Mer, Pháp Rong biển Gracilaria gracilis đƣợc xử lý bảo quản, cấp đông (20OC) 2.1.1 R-phycoerythrin R-phycoerythrin sau đƣợc nghiên cứu chiết xuất từ rong biển Gracilaria gracilis đƣợc tinh phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 2.2 Quy trính chiết xuất R-phycoerythrin 2.2.1 Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin phương pháp ngâm chiết rút Nguyên liệu đƣợc ngâm dung môi 4oC, không ánh sáng Dịch chiết thô đƣợc thu nhận sau tiến hành ly tâm 2.2.2 Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin phương pháp thủy phân enzyme Nguyên liệu đƣợc cho vào phản ứng đệm acetat 50 mM, pH Tiếp đó, enzyme đƣợc bổ sung vào, khuấy với tốc độ khuấy 150 rpm, thời gian giờ, 35°C (Dumay et al 2013) Dịch chiết thô đƣợc thu nhận sau tiến hành ly tâm 2.3 Tinh R-phycoerythrin 2.3.1 Tinh R-phycoerythrin sắc ký trao đổi ion Dịch chiết thô đƣợc nạp vào cột trao đổi ion âm DEAESepharose Fast Flow (26 mm x 100 mm) đƣợc rửa giải gradient Các cƣờng độ ion khác đƣợc nghiên cứu bao gồm: - 150, 150 - 200 200 - 1000 mM; - 150, 150 - 250 250 - 1000 mM 150, 150 - 300 300 - 1000 mM 2.3.2 Phương pháp điện di Dung dịch thu nhận sau tinh phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE đƣợc tiếp tục phân tích phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp hóa sinh 2.4.1.1 Xác định chất lƣợng R-phycoerythrin - Hàm lƣợng R-phycoerythrin [R-PE] (mg/ml) = [(A565-A592) - (A455-A592) × 0.20] × 0.12 - Chỉ số độ tinh khiết R-phycoerythrin (Galland-Irmouli et al 2000): PI= A565/A280 (PI standard = 3,2) 2.4.1.2 Xác định protein hòa tan Protein hòa tan đƣợc xác định phƣơng pháp Bradford (Bradford 1976) 2.4.1.3 Xác định đƣờng hòa tan Hàm lƣợng đƣờng hòa tan đƣợc xác định phƣơng pháp Dubois (Dubois et al 1965) 2.4.2 Phương pháp toán học Thiết kế ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế ma trận phức hợp trung tâm (central composite design, CCD) (Homayoonfal et al 2015) Theo phƣơng pháp này, 19 thí nghiệm đƣợc thực bao gồm thí nghiệm nhân tố, thí nghiệm tâm thí nghiệm xung quanh trục Phần mềm Statgraphics Plus v.5 đƣợc sử dụng nghiên cứu Ngoài ra, phần mềm Minitab 16 phân tích phƣơng sai ANOVA (p