Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xác định được cấu trúc các hoạt chất sinh học từ hoa đu đủ đực có khả năng cơ chế tế bào ung thư. Tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của hoa đu đủ đực là cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam trong thực tiễn.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP BỘ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC Mã số: B2017.DNA.04 (KYTH-56) Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Giang Thị Kim Liên Đà Nẵng, 2019 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Đơn vị công tác lĩnh vực chuyên môn Họ tên TT S TS i ng Thị i iên Đ i học Đà ng H h u TS Trần Thị hương Thảo Viện Hoá học – Viện Hàn lâ KH&CNVN, Hoá học TS Viện Hoá sinh biển – Viện Hàn lâ KH&CNVN h Hải S TS n guyễn Bá Trung Trường Đ i học Sư ph Đà ng Hoá sinh – Đ i học ThS Trần Th nh Hải Bệnh viện Quân y 17 – Dược học TS h Bệnh viện Quân y 17 – Dược học TS guyễn Minh Hiền ThS h ThS h n Quốc Vinh Văn Vượng Thị hương Dung Trường Đ i học Sư ph – Đ i học Đà ng Sinh hoá h u Trường TH T Chun Đơn T Đà ng Hố Giáo viên Hố DANH SÁCH CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Bệnh viện C17 Đà ng Công ty C phần Dược D n ph Đà ng ê Quý MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu h vi nghiên cứu hương pháp nghiên cứu ội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1 iới thiệu đu đủ 1.2 ghiên cứu thành phần h học củ đu đủ nước ghiên cứu thành phần h học củ đu đủ nước h ng nghiên cứu ho t tính sinh học củ đu đủ h ng vấn đề cần nghiên cứu ti p theo CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU guyên liệu h chất thi t bị 1 guyên liệu 2 H chất dụng cụ thi t bị 2 Sơ đồ nghiên cứu t ng thể 2.3 Các phương pháp nghiên cứu hương pháp chi t ẫu thực vật phân lập chất h học Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc hợp chất 3 Các phương pháp thử ho t tính sinh học Xây dựng tiêu chuẩn sở cho c o dược liệu 2.4 Các bước thực nghiệ 2.4 hảo sát sàng lọc ho t tính gây độc t bào ung thư củ phân đo n c o chi t 2.4 Định tính số lớp chất hóa học ho đu đủ đực 2.4.3 Chi t ẫu phân lập chất h học 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 2.4.4 Thử nghiệ ho t tính gây độc t bào ung thư củ hợp chất phân lập từ ho đu đủ đực Chi t xuất c o dược liệu từ ho đu đủ đực CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 t thử ho t tính gây độc t bào ung thư củ c n chi t 311 t thử ho t tính gây độc t bào ung c n chi t nước t ng phân đo n từ dịch chi t nước 312 t thử ho t tính gây độc t bào ung củ c n chi t eth nol t ng phân đo n từ dịch chi t eth nol 313 t thử ho t tính gây độc t bào ung thư củ c n chi t eth nol t ng phân đo n từ dịch chi t eth nol 32 t định tính sơ lớp chất h học 3 Xác định cấu trúc h học ho t tính gây độc t bào ung thư củ hợp chất phân lập 3 Các hợp chất phân lập từ phân đo n dịch chi t chloroform 3 Các hợp chất phân lập từ phân đo n dịch chi t dichloromethane 3 Các hợp chất phân lập từ phân đo n dịch chi t ethyl acetate 3.3 Ho t tính gây độc t bào ung thư củ ột số chất phân lập 3.4 t bào ch xây dựng tiêu cuẩn sở cho c o dược liệu từ ho đu đủ đực C o dược liệu với dung ôi chi t xuất nước C o dược liệu với dung KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ôi chi t xuất cồn 5 6 7 9 11 12 13 14 14 15 15 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.12 Tên bảng t thử ho t tính gây độc t bào c n chi t nước t ng phân đo n t thử ho t tính gây độc t bào c n chi t methanol t ng phân đo n t thử ho t tính gây độc t bào củ c n chi t eth nol t ng phân đo n Định tính lớp chất ho đu đủ đực Số liệu ph 1H 13C-NMR hợp chất C1 hợp chất tham khảo Ho t tính gây độc t bào ung thư củ hợp chất phân lập Trang 8 10 13 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu hình 2.2 2.3 2.4 2.5 Tên hình Sơ đồ nghiên cứu t ng thể Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đo n c n chi t chlorofor ho đu đủ đực Sơ đồ phân lập chất từ c n dicholoro eth ne củ ho đu đủ đực Sơ đồ phân lập chất từ c n ethyl cet te củ ho đu đủ đực 3.2 h H- MR củ chất C1 3.3 h 13 C- MR củ chất C1 Trang 10 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT d: J(Hz): Rf: s: ppm: δ: BuOH: CD3OD: CHCl3: D: DMSO: EtOAc: IR: MS: LC-MS: DEPT: EtOH: HMBC: HSQC: MeOH: Me: NMR: NOESY: UV: Doublet (NMR) Hằng số tương tác ( MR) Retention factor Singlet (NMR) Parts per million Độ chuyển dịch h học ( MR) Butanol Methanol - D chloroform Dichlomethane Dimethyl sunfoxide Ethyl acetate Infrared Mass spectroscopy Liquid Chromatography - Mass spectroscopy Distortionless enhancement by polarisation transfer Ethanol Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Single Quantum Corelation Methanol Methyl Nuclear magnetic resonance Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Ultraviolet BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung Tên đề tài: Xác định thành phần hóa học thử nghiệm số hoạt chất sinh học có khả ức chế tế bào ung thư từ hoa đu đủ đực Mã số: B2017.DNA.04 (KYTH-56) Tổ chức chủ trì đề tài: Đại học Đà Nẵng Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Giang Thị Kim Liên Thời gian thực hiện: từ 01/2017 đến 12/2018 Mục tiêu: Xác định cấu trúc hoạt chất sinh học từ hoa đu đủ đực có khả ức chế tế bào ung thư Tính sáng tạo: - Phân lập 24 hợp chất từ hoa đu đủ dực, có hợp chất phenol hợp chất lần đầu phân lập từ thiên nhiên Công bố hoạt tính ức chế tế bào ung thư số hợp chất phân lập - Bào chế cao dược liệu từ hoa đu đủ đực xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao dược liệu Kết nghiên cứu: 4.1ịch chiế ớc, methanol, ethanol 80% hoa Đu đủ đự đ h hđ h đoạ h ng lọ hoạ h đ ế ou h ết thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư phổi, ung thư gan ung thư vú 11 phân đoạn từ dịch chiết tổng nói cho thấy: - Các phân đoạn N/ET, N/N; M/ET, M/M; E/H, E/ET, E/E khơng thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm - Phân đoạn M/H thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư phổi với phần trăm tế bào sống sót 29,69 ± 1,73 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn E/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dịng tế bào ung thư gan với phần trăm tế bào sống sót 49,91 ± 2,22 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn N/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư phổi tế bào ung thư vú với phần trăm tế bào sống sót 39,73 ± 0,33 48,03 ± 1,24 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn M/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư gan tế bào ung thư vú với phần trăm tế bào sống sót 35,76 ± 0,50; 46,81 ± 3,75 38,24 ± 1,60 nồng độ 100 µg/mL 4.2- Phân lậ x đị h đ c cấu trúc 24 h p chất hóa học t cặn chiết chọn lọc t hoa đu đủ đực a chất từ cặn chiết chloroform; b 15 chất từ cặn chiết dichloromethane (một chất trùng với chất từ cặn chiết chloroform), theo tra cứu tài liệu đến thời điêm này, chất CP12A có cấu trúc hợp chất phenolic mới, lần đầu phân lập từ thiên nhiên từ hoa đu đủ đực, đặt tên caricapapayin; c chất từ cặn chiết ethyl acetate 4.3- Kế h hoạ h đ ế ou h hấ h ậ hoa đu đủ đự ết cho thấy chất CP17A, 19, 21 CPE1,2 khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu Nhóm chất CP cịn lại có hoạt tính với IC50 từ 30,70-86,03 g/ml Nhóm chất CPE cịn lại có hoạt tính với IC50 từ 26,72-91,37 g/ml 4.4- Đ o hế xây dự đ c tiêu chuẩ cho loại ao c liệu t u môi ớc dung môi cồn Kết cho thấy cao đặc hoa đu đủ đực thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng tế bào ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B, ung thư vú MCF-7 nồng độ 30 µg/mL 100 µg/mL với mức độ khác Kết sở khoa học cho việc định hướng bào chế cao dược liệu thử nghiệm invitro hướng đến ứng dụng thực tế Sản phẩm: - 01 báo đăng tạp chí ISI - 02 báo đăng tạp chí chuyên ngành nước - Hướng dẫn 01 thạc sĩ bảo vệ luận văn thành công nhận thạc sĩ - Hỗ trợ hướng dẫn 01 NCS bảo vệ thành công chuyên đề tiến sĩ - Quy trình phân lập chất từ hoa đu đủ đực - Bộ số liệu phổ xác định cấu trúc hợp chất - Báo cáo kết thử nghiệm hoạt chất sinh học ức chế tế bào ung thư hoa đu đủ đực - Hai loại cao chế phẩm từ hoa đu đủ đực với hai loại dung môi khác cồn nước (mỗi loại 120 g) Thử độc tính ức chế tế bào ung thư Thử tác dụng c chế tế bào ung thư in vitro cao chiết chất tinh khiết phân l p 5.4 Chiết xuất c o có khả ức chế tế bào ung thư từ ho đu đủ đực - Nghiên c u xây dựng quy trình chiết xuất cao dược liệu với hai loại dung môi khác nước cồn - Chiết xuất tối thiểu 100g cao theo quy trình ây dựng CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu đu đủ Đu đủ (Carica Papaya Linn), thuộc họ đu đủ (Caricaceae), nguồn gốc Châu Mỹ trồng khắp nơi nước ta Họ đu đủ giới gồm có chi 45 loài Ở Việt Nam, số giống đu đủ trồng bao gồm: đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan đu đủ Đài Loan 1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học đu đủ nƣớc Năm 1983, Nguyễn Tường Vân cộng chiết uất ác định alkaloid carpaine đu đủ Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc sử dụng kỹ thu t HPLC phân tích chất carotenoid đu đủ Năm 2012, Trần Thanh Hà phân l p chất từ phân đoạn chiết n-he an đu đủ Năm 2014, Hồ Thị Hà từ cặn chiết CH2Cl2 phân l p hợp chất Năm 2015, Giang Thị Kim Liên cộng khảo sát sơ thành phần hóa học hoa đu đủ đực 1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học đu đu ngồi nƣớc Các kết nghiên c u cơng bố hợp chất alcaloid, phenol có đu đủ Một số nghiên c u cho thấy hoa đu đủ đực có ch a số triterpenoids/steroid, flavonoid, tannin, glycosides, saponin 1.4 Những nghiên cứu hoạt tính sinh học đu đủ Các công bố hoạt tính đu đủ gồm: Tác dụng trị giun sán, hạ huyết áp; kháng sinh, kháng nấm; trị u bướu, ung thư; chống o i hóa 1.5 Những vấn đề cần nghiên cứu Xác định cấu tr c hoạt chất sinh học từ hoa đu đủ đực có khả c chế tế bào ung thư CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị guyên liệu Hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái Quảng Nam – Đà Nẵng khoảng từ tháng 12 năm 2016 đến tháng năm 2017, rửa sấy khô, bảo quản để sử dụng cho nhiều q trình thực nghiệm 2 Hó chất, dụng cụ thiết bị Dung môi dùng để chiết mẫu triển khai sắc kí: n-hexan, CH3Cl, CH2Cl2, EtOAc, MeOH BuOH Sắc ký lớp mỏng sử dụng mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày 0,2mm Cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck; cột sắc ký silicagel pha đảo RP-18, cột sắc kí Sephadex Các thiết bị ác định cấu tr c chất: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, khối phổ MS,… 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng thể Bột hoa đu đủ đực Khảo sát, sàng lọc hoạt tính sinh học Chiết tổng (CH3OH-H2O)/chiết với dung môi: n-hexane, CH3Cl/CH2Cl2, ethyl acetate, n-butanol; Cất loại dung môi Lựa chọn cao chiết để phân l p chất; Xác định cấu trúc hợp chất Thử hoạt tính sinh học, khả c chế ung thư hợp chất Định tính số lớp chất hóa học Bào chế cao dược liệu dung môi nước dung môi cồn Xây dựng tiêu chuẩn sở cao dược liệu – chế phẩm Thử hoạt tính sinh học, khả c chế ung thư chế phẩm Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng thể 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp chiết mẫu thực vật phân lập chất hó học Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc hợp chất 3 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học Xây dựng tiêu chuẩn sở cho c o dược liệu 2.4 Các bƣớc thực nghiệm 2.4 Khảo sát sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư củ phân đoạn c o chiết a Điều chế dịch chiết phân đoạn từ hoa đu đủ đực: Lấy mẫu, mẫu 100 gam hoa đu đủ đực khô, chiết với dung môi khác nước (N), methanol (M), ethanol 80% (E) cất loại dung môi thu cao chiết Phân bố cao chiết vào nước chiết phân đoạn với n-hexane (H), chloroform (C), ethyl acetate (ET) thu 11 phân đoạn dịch chiết cao chiết tương ng b Khảo sát sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư cặn chiết: Các d ng tế bào ung thư người cung cấp ATCC gồm: tế bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư gan (Hep3B) tế bào ung thư vú (MCF-7) Quá trình thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư phương pháp thử MTT, thực Ph ng thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.4.2 Định tính số lớp chất hóa học ho đu đủ đực: Các hợp chất: alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin, đường khử, polyphenol, steroid, a it hữu cơ, chất béo, carotene, polysaccairid, iridoid 2.4.3 Chiết mẫu phân lập chất hó học a Chiết mẫu lự chọn c o chiết để phân lập chất b Phân lập hợp chất từ cặn chiết chloroform Sơ đồ phân l p hợp chất từ cao chiết chloroform trình bày hình 2.3 Hình 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn cặn chiết chloroform hoa Đu đủ đực c Phân lập hợp chất từ cặn chiết dichloromethane Sơ đồ phân l p hợp chất từ cao chiết dichloromethane trình bày hình 2.4 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập chất từ cặn dicholoromethane hoa đu đủ đực d Phân lập hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate Sơ đồ phân l p hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate trình bày hình 2.5 e Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ ho đu đủ đực 2.4.4 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ hợp chất phân lập đƣợc từ hoa đu đủ đực Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân l p từ hoa đu đủ đực phương pháp thử SRB, thực Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn làm KH&CN Việt Nam 2.4.5 Chiết xuất cao dƣợc liệu từ hoa đu đủ đực Chiết uất cao dược liệu loại dung môi nước cồn, ây dựng tiêu chuẩn sở theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam Hình 2.5 Sơ đồ phân lập chất từ cặn ethyl acetate hoa đu đủ đực CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ cặn chiết 3.1.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung cặn chiết nước t ng phân đoạn từ dịch chiết nước Kết thử hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết nước tổng phân đoạn trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết nƣớc tổng phân đoạn Mẫu N/T N/C N/ET N độ (µg/mL) 30 100 30 100 30 TB sống sót (%) A549 % TB Sai sống số 100,00 2,40 78,50 2,18 95,71 3,24 57,26 1,25 0,33 39,73 98,02 2,21 Hep3B % TB Sai sống số 100,00 1,89 75,28 1,40 57,12 1,75 86,89 0,30 77,53 2,67 65,10 1,54 MCF-7 % TB Sai sống số 100,00 3,76 70,25 1,77 60,28 2,87 54,68 2,11 1,24 48,03 70,13 0,65 N/N Camp 100 30 100 0,5 µM 10 µM 68,59 70,25 59,25 76,00 41,77 1,84 2,14 2,98 2,27 1,25 61,35 58,42 57,14 48,73 28,27 1,78 1,83 1,36 1,35 2,64 64,13 67,39 57,40 62,82 42,66 1,06 3,55 2,45 2,10 2,08 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung củ cặn chiết meth nol t ng phân đoạn từ dịch chiết meth nol Kết thử hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết methanol tổng phân đoạn trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết methanol tổng phân đoạn Mẫu M/T M/H M/C M/ET M/M Camp N độ (µg/mL) 30 100 30 100 30 100 30 100 30 100 0,5 µM 10 µM TB sống sót (%) A549 % TB Sai sống số 100,00 2,40 68,91 0,51 61,48 0,48 58,67 2,56 1,73 29,69 56,30 0,62 2,50 35,76 89,57 3,65 69,80 0,59 96,03 3,44 96,10 3,08 76,00 2,27 41,77 1,25 Hep3B % TB Sai sống số 100,00 1,89 58,99 1,71 55,76 1,79 59,70 2,24 50,53 0,70 59,70 1,50 3,75 46,81 90,21 3,91 63,47 2,28 97,52 3,62 74,27 1,34 48,73 1,35 28,27 2,64 MCF-7 % TB Sai sống số 100,00 3,76 67,93 1,89 58,20 2,32 56,11 2,06 54,11 1,92 70,42 1,49 1,60 38,24 57,60 1,56 55,88 0,18 72,47 2,16 60,88 2,07 62,82 2,10 42,66 2,08 Kết Bảng 3.2 cho thấy: Phân đoạn n-he ane (M/H) thể hoạt tính gây độc tế bào d ng tế bào A549 với phần trăm tế bào sống sót 29,69 ± 1,73 nồng độ 100 µg/mL Phân đoạn chloroform (M/C) thể hoạt tính gây độc tế bào tốt d ng tế bào A549, Hep3B MCF-7 với phần trăm tế bào sống sót 35,76 ± 2,50; 46,81 ± 3,75 38,24 ± 1,60 nồng độ 100 µg/mL 3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư củ cặn chiết eth nol t ng phân đoạn từ dịch chiết ethanol Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết ethanol tổng phân đoạn từ dịch chiết ethanol tổng trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết ethanol tổng phân đoạn Mẫu E/T E/C E/ET E/E Camp N độ (µg/mL) 30 100 30 100 30 100 30 100 0,5 µM 10 µM TB sống sót (%) A549 % TB Sai sống số Hep3B % TB Sai sống số MCF-7 % TB Sai sống số 100,00 2,40 100,00 1,89 100,00 3,76 58.67 66.47 64.94 50.67 96.29 77.42 98.21 75.11 76,00 41,77 3.12 2.05 2.40 1.00 2.11 3.74 2.22 2.45 2,27 1,25 88.31 63.27 57.29 49.91 64.79 64.50 98.02 82.41 48,73 28,27 2.53 1.71 1.91 2.22 3.00 2.62 2.90 3.25 1,35 2,64 74.04 57.25 71.59 69.22 71.22 69.27 69.99 63.62 62,82 42,66 1.25 3.12 0.63 0.31 1.76 2.36 0.37 3.54 2,10 2,08 3.2 Kết định tính sơ lớp chất hóa học Kết định tính sơ lớp chất hóa học hoa đu đủ đực trình bày bảng 3.4 STT Bảng 3.4 Định tính lớp chất hoa đu đủ đực Nhóm hợp Kết Thuốc thử phản ứng chất Mayer +++ Alkaloid Wagner ++ H2SO4 đ m đặc + Flavonoid NaOH 1%: + Phản ng mở đóng v ng Coumarin + lacton Saponin Hiện tượng tạo bọt + Thuốc thử Fehling A thuốc Đường khử + thử Fehling B Polyphenol Dung dịch FeCl3 1% + Steroid Phản ng Libermann+ Nhận xét Có Có Có Có Có Có Có 9 10 11 12 A it hữu Chất béo Carotene Polysaccarid Iridoid Burchard Phản ứng Salkowski Phản ng với Na2CO3 tinh thể Để lại vết mờ tờ giấy lọc Phản ng với H2SO4 Thuốc thử Lugol Thuốc thử Trim-Hill + _ ++ + + - Khơng Có Có Có Khơng 3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 3.3.1 Các hợp chất phân lập từ phân đoạn dịch chiết chloroform - Hợp chất C1 Hợp chất C1 thu dạng bột màu vàng sẫm Phổ khối lượng ESI-MS uất píc m/z 287,14 [M+H]+, cho thấy giá trị M = 286, 14 Phổ 1H-NMR C1 cho tín hiệu 10 proton, Phổ 13C-NMR cho tín hiệu 15 C Hình 3.2 Phổ 1H-NMR chất C1 Các đặc trưng phổ C1 cho phép dự đoán C1 flavonoid, công th c phân tử (CTPT) C15H10O6 phù hợp với công th c phân tử kaempferol Cấu tr c chất C1 khẳng định kaempferol nhờ phân tích liệu phổ so sánh với tài liệu tham khảo - Hợp chất C2 (β-sitosterol glucoside) Cấu tr c chất C2 ác định β-sitosterol glucoside, CTPT: C35H60O6 nhờ phân tích dự liệu phổ IR, phổ1H-NMR (MeOH, 500MHz) 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) so sánh với tài liệu tham khảo 10 Hình 3.3 Phổ 13C-NMR chất C1 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất C1 hợp chất tham khảo Vị trí Chất C1 Chất tham khảo a, c H Mult Ha, c Mult ≠ DEPT C Ca,b (J= Hz) (J= Hz) 148,1 C 146,8 137,1 C 135,6 177,3 C 175,9 162,4 C 160,7 99,3 6,23 CH 98,2 6,20 (s) 165,5 C 163,9 94,5 6,42 CH 93,5 6,40 (s) 158,2 C 156,2 10 104,5 C 103,1 1′ 123,7 C 121,7 2′ 130,7 8,07 CH 129,5 8,08 (d, 8,5) 3′ 116,3 6,91 CH 115,4 6,92 (d, 8,5) 4′ 160,5 C 159,2 5′ 116,3 6,91 CH 115,4 6,92 (d, 8,5) 6′ 130,7 8.07 CH 129,5 8,08 (d, 8,5) 11 Đo methanol-d4; b125 MHz, c500 MHz; ≠C kaempferol Tương tự việc ác định cấu tr c chất C1 C2, cấu tr c hợp chất phân l p từ hai loại cặn chiết chọn lọc dichloromethanevà ethyl acetate ác định có cấu tr c 3.3.2 Các hợp chất phân lập từ phân đoạn dịch chiết dichloromethane Hợp chất CP1: 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2carbaldehyde Chất CP1 phân l p dạng nhựa (gum), không màu, liệu phổ HR-ESI-MS: m/z 238,2159 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR cho tín hiệu 13 proton, phổ 13C-NMR cho tín hiệu 13 C Kết hợp số liệu phổ ESIMS phổ 1H-NMR, 13C-NMR cho CTPT C13H13NO2, M = 215 - Hợp chất CP3: Vitexoid Chất CP3 phân l p dạng nhựa (gum), không màu Phổ 1HNMR cho tín hiệu 16 proton, phổ 13C-NMR cho tín hiệu 10 C Kết hợp số liệu phổ ESI-MS phổ 1H-NMR, 13C-NMR cho dự đoán CTPT C10H16O3, M = 184 - Hợp chất CP4: Lariciresinol Hợp chất CP4 thu dạng bột vơ định hình, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 165-168oC Từ ESI-MS: m/z 383,1 [M+Na]+, 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) CTPT C20H24O6, M = 360 - Hợp chất CP5: Dehydrodiconiferyl alcohol Chất bột, không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 141-142oC; CTPT C20H22O6, M = 358, HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+, Tính tốn lý thuyết cho cơng th c C20H22O6Na: 207,0997 - Hợp chất CP6: Benzyl-O--D-glucopyranoside Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 121-122oC; CTPT C13H18O6, M = 270; HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+; Tính tốn lý thuyết cho công th c C13H18O6Na: 207,0997 - Hợp chất (CP9): 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid Chất dầu, không màu; CTPT C10H16O3, M = 184; HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+ - Hợp chất CP 0: 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid Chất dầu, không màu; CTPT C10H18O3, M = 186; HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+ a 12 - Hợp chất CP11: Hỗn hợp chất 3-Hydroxy-3-methyl-5-hexanolide Leucine + Hợp chất CP11-1: 3-Hydroxy-3-methyl-5-hexanolid CTPT C6H10O3, M = 130; HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+ + Hợp chất CP11-2: Leucine CTPT C6H13NO2, M = 131; HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+ - Hợp chất CP 2A: Caricapapayin (Chất mới) Chất bột, màu vàng; CTPT C29H34O4, M = 446; HR-ESI-MS: m/z 447,2526 [M+H]+; m/z 447,2526 [M+Na]+ Hợp chất CP12A phân l p dạng bột màu vàng vơ định hình CTPT dự đốn C29H34O4 nhờ phân tích peak ion phân tử m/z 447,2526 [M+H]+ phổ HR-ESI-MS kết hợp phổ 13C-NMR Dựa vào phân tích liệu phổ so sánh với tài liệu tham khảo ch ng minh CP12A có cấu tr c hợp chất phenolic mới, lần đầu phân l p từ thiên nhiên từ hoa đu đủ đực, đặt tên caricapapayin - Hợp chất CP 4: 2,6-Dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol Chất dầu, không màu; CTPT C10H18O2, M = 170; HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+ - Hợp chất CP17A: (Chất mới) Chất bột, màu trắng; Công th c phân tử C20H38O5, M = 358; HR-ESIMS: m/z 207,1004 [M+Na]+ - Hợp chất CP19: Indole-3-aldehyde Tinh thể hình kim, màu vàng; CTPT C9H7NO, M = 145; HR-ESI-MS: m/z 207,1004 [M+Na]+ - Hợp chất CP20: 3β,7α-Dihydroxycholest-5-ene Chất bột, màu trắngl; Nhiệt độ nóng chảy: 188-189oC; CTPT C27H46O2, M = 402 - Hợp chất CP2 : Cholest-5-ene-3β,7β-diol Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 178-179oC; CTPT C27H46O2, M = 402; APCI-MS: m/z 367 [M+H-2H2O]+ - Hợp chất CP22A: Saringosterol Tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 160-161oC; CTPT C28H48O2, M = 428; ESI-MS: m/z 411,1 [M-H2O+H]+ 3.3.3 Các hợp chất phân lập từ cặn ethyl acetate - Hợp chất CPE : Kaempferol (Hợp chất C ) - Hợp chất CPE2: Quercetin 13 Chất bột, màu vàng sẫm; Nhiệt độ nóng chảy: 314-316oC; CTPT C15H10O7, M = 302; ESI-MS: m/z 303,24 [M+H]+ - Hợp chất CPE3: Quercitrin Chất bột, màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 174-177oC; CTPT C21H20O11, M = 448; ESI-MS: m/z 449,38 [M+H]+ - Hợp chất CPE4: Kaempferol-3-O-glucopyranoside Chất bột, màu vàng sẫm; Nhiệt độ nóng chảy: 223-229oC; CTPT C21H20O11, M = 448; ESI-MS: m/z 449,38 [M+H]+ - Hợp chất CPE5: K empferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside Chất bột, màu vàng sẫm; Nhiệt độ nóng chảy: 180-185oC; CTPT C21H20O10, M = 432; ESI-MS: m/z 433,38 [M+H]+ - Hợp chất CPE6: Quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside Chất bột, màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 232-238oC; CTPT C21H20O12, M = 464; ESI-MS: m/z 465,38 [M+H]+ - Hợp chất CPE7: Kaempferol-3-O-arabinopyranoside Chất bột, màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 204-209oC; CTPT C20H18O10, M = 418; ESI-MS: m/z 419,35 [M+H]+ - Hợp chất CPE8: Myricitrin Chất bột, màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 205-207oC; CTPT C21H20O12, M = 464; ESI-MS: m/z 464,38 [M+H]+ 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư củ số chất phân lập Bảng 3.6 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ hợp chất phân lập IC50 (µg/mL) STT Hợp chất A549 MCF7 Hep3B 44,58±4,04 55,91±3,08 49,87±3,80 CP1 54,63±3,67 34,73±1,55 60,37±3,71 CP3 50,80±5,93 66,12±5,60 62,62±5,49 CP4 70,99±7,26 60,85±4,43 62,32±5,03 CP5 32,52±2,41 30,70±2,72 36,71±1,93 CP6 78,98±4,64 54,15±5,89 72,25±3,13 CP9 86,03±7,57 67,49±2,41 77,77±5,52 CP10 55,71±2,61 43,31±1,05 66,77±4,54 CP11 CP12A 10 49,06±2,82 38,28±1,53 54,07±2,85 CP14 11 >100 >100 >100 CP17A 12 >100 >100 >100 CP19 14 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 CP20 CP21 CP22A CPE1 CPE2 CPE3 CPE4 CPE5 CPE6 CPE7 CPE8 Ellipticine 77,37±3,50 >100 76,02±4,61 >100 >100 91,37±3,40 71,52±3,27 61,72±3,00 71,70±3,87 34,67±2,21 36,02±1,69 0,43±0,04 56,33±2,67 >100 63,80±2,79 >100 >100 75,27±4,95 81,84±4,72 47,79±2,12 85,61±4,43 26,72±0,76 35,92±1,13 0,37±0,03 59,09±3,50 >100 84,06±5,21 >100 >100 90,50±2,74 80,13±2,76 64,37±3,42 74,90±3,13 44,13±3,61 45,49±4,29 0,50±0,04 3.4 Kết bào chế xây dựng tiêu cuẩn sở cho cao dƣợc liệu từ hoa đu đủ đực 3.4.1 C o dược liệu với dung môi chiết xuất nước - Chiết xuất cao dƣợc liệu: Cao đặc hoa đu đủ đực bào chế từ hoa đu đủ đực theo phương pháp thích hợp với dung môi nước - Mô tả: Cao hoa đu đủ đực cao đặc quánh, mềm, đồng Màu nâu đen Mùi nồng, đặc trưng dược liệu Vị lợ, đắng - Hàm lƣợng cặn không tan nƣớc: Cặn khơng tan nước trung bình cao đặc hoa đu đủ đực 0,163%, đạt yêu cầu theo quy định DĐVN IV không 3% - Tỷ lệ khối lƣợng làm khô: Tỷ lệ khối lượng làm khơ trung bình cao đặc hoa đu đủ đực 13,867%, đạt yêu cầu theo quy định DĐVN IV không 20% - Hàm lƣợng tro toàn phần: Tro toàn phần trung bình cao đặc 22,867%, đạt yêu cầu theo quy định DĐVN IV không 35% - Hàm lƣợng kim loại nặng: Hàm lượng số kim loại nặng khảo sát cao đặc m c cho phép theo văn số 46/2007/QĐ-BYT - Độ pH: Độ pH trung bình dung dịch nước 4,876 - Định tính: Sơ cao có ch a hoạt chất: Alcaloid, flavonoid, saponin, đường khử, polyphenol, steroid, coumarin, carotene, chất béo - Hoạt tính kháng vi sinh vật: Cao đặc hoa đu đủ đực biểu hoạt tính kháng vi khuẩn Enterococcus faecalis (ATCC299212) với giá trị MIC 128 µg/mL có khả c chế phát triển nấm Candida albicans (ATCC10231) với giá trị MIC 128 µg/mL 15 - Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ: Cao thể hoạt tính gây độc tế bào d ng tế bào ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B, ung thư vú MCF-7 nồng độ 30 µg/mL 100 µg/mL với m c độ khác 3.4.2 C o dược liệu với dung môi chiết xuất cồn - Chiết xuất cao dƣợc liệu: Cao đặc bào chế từ hoa đu đủ đực theo phương pháp thích hợp với dung mơi chiết xuất cồn - Mô tả: Cao hoa đu đủ đực cao đặc quánh, mềm, đồng Màu nâu đ m Mùi nồng, đặc trưng dược liệu Vị lợ, đắng - Hàm lƣợng cặn không tan nƣớc: Cặn khơng tan nước trung bình cao đặc hoa đu đủ đực 2,133%, đạt yêu cầu theo quy định DĐVN IV không 3% - Tỷ lệ khối lƣợng làm khô: Tỷ lệ khối lượng làm khơ trung bình cao đặc hoa đu đủ đực 14,733%, đạt yêu cầu theo quy định DĐVN IV không 20% - Hàm lƣợng tro toàn phần: cao đặc hoa đu đủ đực 10,667%, đạt yêu cầu theo quy định DĐVN IV không 35% - Hàm lƣợng kim loại nặng: Hàm lượng số kim loại nặng khảo sát cao đặc m c cho phép theo văn số 46/2007/QĐ-BYT - Độ pH: Độ pH trung bình dung dịch cao đặc nước 5,614 - Định tính: Sơ cao có ch a hoạt chất: Alcaloid, flavonoid, saponin, đường khử, polyphenol, steroid, coumarin, carotene, chất béo - Hoạt tính kháng vi sinh vật: Cao đặc hoa đu đủ đực biểu hoạt tính kháng vi khuẩn Enterococcus faecalis (ATCC299212) với giá trị MIC 256 µg/mL có khả c chế phát triển nấm Candida albicans (ATCC10231) với giá trị MIC 128 µg/mL - Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ: Cao thể hoạt tính gây độc tế bào d ng ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B, ung thư v MCF-7 nồng độ 30 µg/mL 100 µg/mL với m c độ khác KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN 1- Từ dịch chiết tổng nước, methanol, ethanol 80% hoa Đu đủ đực (Carica papaya L.) phân tách 11 phân đoạn thử sang lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư Kết thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào d ng tế bào ung thư phổi, ung thư gan ung thư v 11 phân đoạn từ dịch chiết tổng nói cho thấy: 16 - Các phân đoạn N/ET, N/N; M/ET, M/M; E/H, E/ET, E/E hoạt tính gây độc tế bào d ng tế bào ung thư thử nghiệm - Phân đoạn M/H thể hoạt tính gây độc d ng tế bào ung thư phổi với % tế bào sống sót 29,69 ± 1,73 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn E/C thể hoạt tính gây độc mạnh d ng tế bào ung thư gan với % tế bào sống sót 49,91± 2,22 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn N/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh d ng tế bào ung thư phổi tế bào ung thư v với phần trăm tế bào sống sót 39,73 ± 0,33 48,03 ± 1,24 nồng độ 100 µg/mL - Phân đoạn M/C thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh d ng tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư gan tế bào ung thư v với phần trăm tế bào sống sót 35,76 ± 0,50; 46,81 ± 3,75 38,24 ± 1,60 nồng độ 100 µg/mL 2- Phân l p ác định cấu tr c 24 hợp chất hóa học từ cặn chiết chọn lọc từ hoa đu đủ đực: chất từ cặn chiết chloroform; 15 chất từ cặn chiết dichloromethane (một chất trùng với chất từ cặn chiết chloroform), theo tra c u tài liệu đến thời điêm này, chất CP12A có cấu tr c hợp chất phenolic mới, lần đầu phân l p từ thiên nhiên từ hoa đu đủ đực, đặt tên caricapapayin; chất từ cặn chiết ethyl acetate 3- Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư chất phân l p từ hoa đu đủ đực cho thấy chất CP17A, 19, 21 CPE1,2 hoạt tính nồng độ nghiên c u Nhóm chất CP c n lại có hoạt tính với IC50 tử 30,70-86,03 g/ml Nhóm chất CPE c n lại có hoạt tính với IC50 tử 26,72-91,37 g/ml 4- Đã bào chế ây dựng tiêu chuẩn sở cho loại cao dược liệu từ dung môi nước dung môi cồn Kết cho thấy cao đặc hoa đu đủ đực thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư d ng tế bào ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B, ung thư v MCF-7 nồng độ 30 µg/mL 100 µg/mL với m c độ khác Kết sở khoa học cho việc định hướng bào chế cao dược liệu thử nghiệm invivo hướng đến ng dụng thực tế II KIẾN NGHỊ Tiếp tục thử nghiệm độc tính cấp độc tính bán trường diễn cao dược liệu kiện phòng thí nghiệm ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung Tên đề tài: Xác định thành phần hóa học thử nghiệm số hoạt chất sinh học có khả ức chế tế bào ung thư từ hoa đu đủ đực. .. thành cơng chun đề tiến sĩ - Quy trình phân lập chất từ hoa đu đủ đực - Bộ số liệu phổ xác định cấu trúc hợp chất - Báo cáo kết thử nghiệm hoạt chất sinh học ức chế tế bào ung thư hoa đu đủ đực. .. c hoạt chất sinh học từ hoa đu đủ đực có khả c chế tế bào ung thư Đối tƣợng nghiên cứu Hoa đu đủ đực thu hái Quảng Nam-Đà Nẵng; Các dịch chiết từ hoa đu đủ đực; Các hợp chất phân l p từ hoa đu