NGUYỄN THÀNH lâm xây DỰNG và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLISTIN METHANSULFONAT TRONG HUYẾT TƯƠNG KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Nguyễn Thành Lâm Mã sinh viên: 1701291 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLISTIN METHANSULFONAT TRONG HUYẾT TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Thuỳ Linh ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc Nơi thực hiện: Bộ môn Kiểm nghiệm – Hóa phân tích Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Khố luận hồn thành Khoa Độc học Dị nguyên - Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia, hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Thuỳ Linh ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc Để hồn thành đề tài, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu đến từ thầy cơ, bạn bè gia đình Tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến họ Lời đầu tiên, với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Thuỳ Linh thuộc mơn Hố phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc người tận tình hướng dẫn, bảo chia sẻ cho tơi kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phùng Công Lý NCS.ThS Vũ Ngân Bình tồn thể thầy cơ, tất anh chị khoa Độc học Dị nguyên khoa Nghiên cứu phát triển giúp đỡ, động viên, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi q trình tơi thực khố luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, gia đình tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Do thiếu sót kinh nghiệm thời gian thực nghiên cứu nên đề tài tơi cịn nhiều thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn bè để đề tài hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 26 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thành Lâm DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan colistin methansulfonat 1.1.1 Cơng thức cấu tạo, tính chất lý hóa CMS 1.1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.2 Cấu trúc hóa học colistin, colistin methansulfonat liên quan đến phân tích cấu trúc vi khuẩn 1.1.3 Cơ chế tác dụng 1.1.3.1 Cấu trúc vi khuẩn Gram (-) 1.1.3.2 Con đường ly giải màng 1.1.3.3 Con đường tiếp xúc 1.1.3.4 Con đường hydroxyl 1.1.4 Đặc điểm dược lý tác dụng không mong muốn 1.1.4.1 Đặc điểm dược lý 1.1.4.2 Tác dụng không mong muốn 1.1.5 Đặc điểm dược động học liên quan đến theo dõi TDM 1.1.5.1 Đặc điểm dược động học 1.1.5.2 Khuyến cáo theo dõi TDM bệnh nhân dùng CMS 10 1.1.6 Chỉ định liều dùng 10 1.1.6.1 Chỉ định CMS 10 1.1.6.2 Liều dung cách dùng 10 1.2 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ lần (LC-MS/MS) ứng dụng LC-MS/MS giám sát điều trị Colistin methansulfonat 11 1.2.1 Tổng quan LC-MS/MS 11 1.2.1.1 Nguyên tắc 11 1.2.1.2 Nguồn ion hóa ESI 12 1.2.1.3 Đầu dò khối phổ tứ cực 13 1.2.1.4 Chế độ ghi phổ MRM 13 1.3 Sơ lược phương pháp định lượng CMS huyết tương 13 Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18 2.1.1 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 18 2.1.2 Nguyên liệu, hố chất, dung mơi 18 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Chuẩn bị mẫu 18 2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 18 2.2.2.1 Lựa chọn chất chuẩn nội 20 2.2.2.2 Xác định điều kiện sắc ký 20 2.2.2.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu chuẩn huyết tương 20 2.2.2.4 Xây dựng qui trình xử lý mẫu chuẩn quy trình thủy phân 20 2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 21 2.3.1 Độ chọn lọc 21 2.3.2 Độ ổn định hệ thống 21 2.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 21 2.3.4 Giới hạn định lượng (LLOQ) 22 2.3.5 Độ đúng, độ xác phương pháp 23 2.3.5.1 Độ đúng, độ xác ngày 23 2.3.5.2 Độ đúng, độ xác khác ngày 23 2.3.6 Tỷ lệ thu hồi chất phân tích 24 2.3.7 Độ ổn định 24 2.3.7.1 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc sau thời gian ngắn nhiệt độ phòng 24 2.3.7.2 Độ ổn định mẫu chuẩn huyết tương sau thời gian ngắn nhiệt độ phòng 24 2.3.7.3 Độ ổn định mẫu chuẩn huyết tương sau chu kỳ để đông - rã đông 25 2.3.7.4 Độ ổn định mẫu chuẩn huyết tương sau thời gian dài nhiệt độ bảo quản 25 2.3.8 Độ pha loãng 25 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết xây dựng phương pháp nghiên cứu 26 3.1.1 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 26 3.1.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 28 3.1.2.1 Lựa chọn dung môi kết tủa protein 28 3.1.2.2 Lựa chọn dung môi chiết loại tạp 29 3.1.3 Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu quy trình thuỷ phân 31 3.1.3.1 Lựa chọn nồng độ H2SO4 quy trình thủy phân 31 3.1.3.2 Lựa chọn nhiệt độ ủ quy trình thủy phân 32 3.1.3.3 Lựa chọn thời gian ủ quy trình thủy phân 33 3.2 Kết thẩm định phương pháp phân tích 35 3.2.1 Độ chọn lọc 36 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 36 3.2.3 Đường chuẩn, khoảng tuyến tính 37 3.2.4 Giới hạn định lượng 38 3.2.5 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày 39 3.2.5.1 Độ đúng, độ xác ngày 39 3.2.5.2 Độ đúng, độ xác khác ngày 41 3.2.6 Tỷ lệ thu hồi chất phân tích 44 3.2.7 Độ ổn định 46 3.2.7.1 Độ ổn định sau thời gian ngắn bảo quản nhiệt độ phòng dung dịch chuẩn gốc 46 3.2.7.2 Độ ổn định mẫu chuẩn huyết tương sau thời gian ngắn nhiệt độ phòng 47 3.2.7.3 Độ ổn định mẫu chuẩn huyết tương sau chu kỳ đông - rã đông 48 3.2.7.4 Độ ổn định dài ngày mẫu chuẩn huyết tương 50 3.2.7.5 Độ ổn định mẫu sau xử lý 53 3.2.8 Độ pha loãng 54 3.3 Độ ổn định CMS 55 3.3.1 Độ ổn định CMS nhiệt độ phòng 55 3.3.2 Độ ổn định CMS thủy phân với H2SO4 56 3.4 Kết xử lí mẫu thực 57 3.5 Bàn luận 59 3.5.1 Kĩ thuật xử lí mẫu 59 3.5.2 Phương pháp phân tích định lượng COL, CMS 61 3.5.3 Thẩm định phương pháp 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt MeCN Acetonitrile Acetonitril AUC Area under the curve Sinh khả dụng CE Collision energy Năng lượng chạm Q2 CMS Colistin methansulfonate Colistin methansulfonat COL Colistin Colistin Ctrough trough concentration Nồng độ đáy CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên CXP Collision cell exit potential Điện cuối Q3 DP Declustering potential Thế phân nhóm Q1 EP Entrance potential ESI Electrospray ionization HPLC High Performance Liquid Chromatography Ion hóa phun điện tử Sắc ký lỏng hiệu cao Mẫu kiểm soát chất lượng nồng HQC High Quality Control Sample HT Plasma Huyết tương HTT Blank plasma Huyết tương trắng độ cao Liquid Chromatography - Mass LC - MS/MS spectrometry/Mass Sắc ký lỏng lần khối phổ spectrometry LLOQ Lower Limit Of Quantification LQC Lower Quality Control Sample m/z Mass-to charge ratio MIC MQC MRM Minimum Inhibitory Concentration Giới hạn định lượng Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp Tỉ số khối lượng ion/ điện tích ion Nồng độ ức chế tối thiểu Middle Quality Control Mẫu kiểm soát chất lượng nồng Sample độ trung bình Multiple reaction monitoring MS Mass spectrometry Khối phổ PD Pharmacodynamics Dược lực học PK Pharmacokinetics Dược động học Q1 1st Quadrupole Tứ cực thứ Q2 2nd Quadrupole Tú cực thứ Q3 3rd Quadrupole Tứ cực thứ r Pearson correlation coefficient Hệ số tương quan S/N Signal to noise ratio SKĐ Chromatogram Sắc ký đồ TB Average Trung bình TDM Theurapeutic Drug Monitoring ULOQ Upper Limit Of Quantification Giới hạn định lượng The United States Food and Cục quản lý thuốc thực phẩm Drug Administration Mỹ US - FDA Tỉ lệ tín hiệu chất phân tích/ nhiễu Theo dõi nồng độ thuốc máu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Liều khuyến cáo CMS 11 Bảng 2.1 Chuẩn bị dung dịch làm việc G1 –G6 19 Bảng 3.1 Kết khảo sát điều kiện bắt mảnh 26 Bảng 3.2 Kết khảo sát tỷ lệ pha động 27 Bảng 3.3 Kết khảo sát kết tủa protein COL 29 Bảng 3.4 Kết khảo sát loại tạp COL 31 Bảng 3.5 Kết khảo sát nồng độ H2SO4 CMS 32 Bảng 3.6 Kết khảo sát nồng độ H2SO4 COL 32 Bảng 3.7 Kết khảo sát nhiệt độ ủ CMS 33 Bảng 3.8 Kết khảo sát nhiệt độ ủ COL 33 Bảng 3.9 Kết khảo sát thời gian ủ CMS 34 Bảng 3.10 Kết khảo sát thời gian ủ COL 34 Bảng 3.11 Ảnh hưởng HTT thời điểm trùng thời gian lưu COL 36 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống COL 37 Bảng 3.13 Kết khảo sát đường chuẩn COL 38 Bảng 3.14 Kết xác định giới hạn định lượng LLOQ 39 Bảng 3.15 Kết độ đúng, độ xác ngày COL A 40 Bảng 3.16 Kết độ đúng, độ xác ngày COL B 41 Bảng 3.17 Kết độ đúng, độ xác khác ngày COL A 42 Bảng 3.18 Kết độ đúng, độ xác khác ngày COL B 43 Bảng 3.19 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi COL 45 Bảng 3.20 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi IS 45 Bảng 3.21 Kết độ ổn định COL sau thời gian ngắn bảo quản nhiệt độ phòng dung dịch chuẩn gốc 46 Bảng 3.22 Kết độ ổn định mẫu chuẩn COL huyết tương sau thời gian ngắn nhiệt độ phòng 48 Bảng 3.23 Kết độ ổn định mẫu chuẩn COL huyết tương sau ba chu kỳ đông - rã đông 49 Bảng 3.24 Độ ổn định ngày mẫu chuẩn COL huyết tương 50 Bảng 3.25 Độ ổn định 14 ngày mẫu chuẩn COL huyết tương 51 Bảng 3.26 Độ ổn định 21 ngày mẫu chuẩn COL huyết tương 52 Bảng 3.27 Độ ổn định mẫu sau xử lý COL 53 Bảng 3.28 Độ pha loãng mẫu COL sau xử lí 54 Bảng 3.29 Độ ổn định CMS huyết tương nhiệt độ phòng 55 Bảng 3.30 Độ ổn định CMS huyết tương với H2SO4 56 Bảng 3.31 Kết nồng độ COL tự 57 Bảng 3.32 Kết nồng độ COL toàn phần 58 Bảng 3.33 Điểm gãy nhạy cảm colistin số chủng vi khuẩn 59 Chloroform – COL B n- hexan COL A, B MeCN- COL A MeCN-COL B TCA 1%/MeCN- COL A, B TCA 2%/MeCN-COL B 50% AF-COL B 95% AF- COL A, B Phụ lục Đường chuẩn COL B Spk 0,1 Spk 0,2 Spk 0,5 Spk Spk Spk COL A Spk 0,1 Spk 0,2 Spk 0,5 Spk Spk Spk Phụ lục Độ phù họp hệ thống L1, L4 COL A L2, L5 COL B Phụ lục Độ xác, ngày độ pha loãng COL A COL B MQC-M3, HQC-M1 (COL A) Spk-5, pha loãng lần (COL B) Phụ lục Độ xác khác ngày, Độ ổn định COL B MQC-M2, HQC-M5 MQC-M5, HQC-M3 COL A MQC-M5, HQC-M3 LQC-M5, MQC-M3 Độ xác ngày độ ổn định 21 ngày Phụ lục Kết phân tích mẫu thực COL A COL B BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THÀNH LÂM XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLISTIN METHANSULFONAT TRONG HUYẾT TƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 ... thực đề tài ? ?Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Colistin methansulfonat huyết tương LC-MS/MS” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng colisin A/B CMS huyết tương LC-MS/MS... 2.3 Thẩm định phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp nội dung bắt buộc phương pháp phân tích nói chung phương pháp định lượng dược chất dịch sinh học nói riêng Hiện Việt Nam, thẩm định phương. .. lọc cao phù hợp cho TDM lâm sàng[32, 18] 1.3 Sơ lược phương pháp định lượng CMS huyết tương Một số phương pháp có sẵn để xác định nồng độ colistin huyết tương phương pháp xét nghiệm vi sinh[24,