TRẦN TRUNG THÀNH xây DỰNG và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMYGDALIN TRONG THỰC PHẨM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

: BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN TRUNG THÀNH XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMYGDALIN TRONG THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN TRUNG THÀNH MÃ SINH VIÊN: 1701521 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMYGDALIN TRONG THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Cao Công Khánh Nơi thực hiện: 1.Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất 2.Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiền, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Cao Công Khánh – người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc cán công tác khoa Độc học Dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hỗ trợ giúp đỡ em suốt trình thực nghiên cứu khoa Em gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo mơn Hóa phân tích – Độc chất, thầy Ban giám hiệu, phịng Đào tạo giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận tốt trình học tập trường Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln bênh cạnh ủng hộ em để hồn thành khóa luận cách tốt Trong trình thực đề tài khơng thể tránh khỏi sai sót, kính mong thầy đưa góp ý, đánh giá để khóa luận em thêm hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 24 tháng năm 2022 Sinh viên Trần Trung Thành MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu amygdalin 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tính amygdalin 1.1.3 Quy định hành 1.2 Phương pháp phân tích 1.2.1 Các nghiên cứu thực xác định amygdalin 1.2.2 Phương pháp xác định 1.2.2.1 Bộ phận sắc ký lỏng 1.2.2.2 Bộ phận khối phổ 1.2.3 Cloramphenicol 12 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.2.1 Chất chuẩn 13 2.2.1.1 Pha chuẩn Amygdalin 13 2.2.1.2 Pha chuẩn Cloramphenicol 13 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 13 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ: 13 2.3 Nội dung nghiên cứu 14 2.3.1 Khảo sát điều kiện LC – MS 14 2.3.1.1 Điều kiện khối phổ 14 2.3.1.2 Điều kiện sắc ký 14 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 14 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng 14 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 15 2.3.4.1 Độ chọn lọc 15 2.3.4.2 Giới hạn định lượng, giới hạn phát 15 2.3.4.3 Đường chuẩn khoảng nồng độ xác định 16 2.3.4.4 Độ lặp lại độ thu hồi 16 2.3.4.5 Tính thích hợp hệ thống 17 2.3.5 Áp dụng phương pháp 17 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp LC – MS/MS 18 3.1.1 3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 18 3.1.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng 18 3.1.2 3.2 Xây dựng phương pháp LC – MS/MS 18 Tối ưu quy trình xử lí mẫu 21 3.1.2.1 3.1.2.2 Khảo sát dung môi chiết 21 Khảo sát dung môi loại béo 22 3.1.2.3 Khảo sát nhiệt độ siêu âm 22 3.1.2.4 Khảo sát thời gian siêu âm 23 3.1.2.5 Khảo sát thể tích dung mơi 23 3.1.2.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 25 3.1.2.7 Đánh giá ảnh hưởng 26 Thẩm định phương pháp phân tích 27 3.2.1 Độ chọn lọc 27 3.2.2 Độ ổn định hệ thống 29 3.2.3 Giới hạn định lượng, giới hạn phát 30 3.2.4 Đường chuẩn 31 3.2.5 Độ độ lặp lại 32 3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích hàm lượng amygdalin 33 Chương 4: Kết luận kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AMG Amygdalin Amygdalin Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa phân Chemists tích thống AOAC Ion hóa hóa học áp suất APCI Atmospheric Chemical Ionization khí Atmospheric Pressure Ion hóa photon áp Photonization suất khí German Federal Institute for Risk Viện Đánh giá Rủi ro Liên BfR Assessment bang Đức CAP Chloramphenicol Cloramphenicol EC European Commission Ủy ban Châu Âu ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử EtOH abs Ethanol absolute Ethanol tuyệt đối Food Standards Australia New Tiêu chuẩn Thực phẩm Zealand Australia New Zealand APPI FSANZ high performance liquid HPLC chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IS Internal standard Nội chuẩn Liquid chromatography– tandem LC -MS/MS mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ lần LOD limit of detection Giới hạn phát LOQ limit of quantification Giới hạn định lượng m/z mass to charge ratio Tỷ số khối lượng/điện tích ME Matrix effect Ảnh hưởng mẫu MeOH abs Methanol absolute Methanol tuyệt đối ML Maximum level Mức tối đa MRM multi reaction monitoring Theo dõi đa phản ứng MS mass spectrometry Khối phổ RSD relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SIM Selected Ion Monitoring Theo dõi chọn lọc ion Cục quản lý Thực phẩm USFDA U.S Food and Drug Administration Dược phẩm Hoa Kỳ USP US Pharmacopeia Dược điển Hoa Kỳ DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học amygdalin Hình 1.2 Sự hình thành HCN từ Amygdalin Hình 1.3 Cấu tạo thiết bị khối phổ 10 Hình 1.4 Cấu tạo tứ cục chập ba 10 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo Cloramphenicol 12 Hình 3.1 Khảo sát chương trình gradient 19 Hình 3.2 Khảo sát chương trình gradient 20 Hình 3.3 Kết khảo sát dung môi chiết 21 Hình 3.4 Kết khảo sát nhiệt độ siêu âm 22 Hình 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết siêu âm 23 Hình 3.6 Kết khảo sát thể tích dung mơi sử dụng 23 Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu phân tích tối ưu 25 Hình 3.8 Đường chuẩn AMG mẫu 26 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung môi MeOH 27 Hình 3.10 Sắc ký đồ chuẩn pha dung môi 27 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn, a) trắng – AMG, b) trắng thêm chuẩn – AMG, c) trắng – CAP, d) trắng thêm chuẩn – CAP 28 Hình 3.12 Sắc ký đồ LOQ AMG mẫu, a) nhân hạt, b) bánh 30 Hình 3.13 Đường chuẩn AMG có IS 31 Hình 3.14 Sắc ký đồ phân tích mẫu, a) Hạt hạnh nhân - CAP, b) Hạt hạnh nhân AMG, c) Bánh B1 - CAP, d) Bánh B1 - AMG 34 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số báo cáo ngộ độc cyanide sử dụng sản phẩm chứa amygdalin Bảng 1.2 Các nghiên cứu thực để xác định Amygdalin Bảng 3.1 Kết điều kiện tối ưu cho mảnh chất phân tích 18 Bảng 3.2 Các thơng số tối ưu cho thiết bị MS 18 Bảng 3.3 Các chương trình gradient khảo sát 19 Bảng 3.4 Chương trình gradient pha động tối ưu 20 Bảng 3.5 Kết khảo sát dung môi loại béo 22 Bảng 3.6 Kết đường chuẩn AMG khơng có IS 26 Bảng 3.7 Kết đánh giá ảnh hưởng 26 Bảng 3.8 Bảng so sánh tỉ số ion 28 Bảng 3.9 Yêu cầu số điểm IP theo Hội đồng Châu Âu 29 Bảng 3.10 Kết thời gian lưu 29 Bảng 3.11 Kết diện tích pic 29 Bảng 3.12 Kết LOQ trền mẫu 30 Bảng 3.13 Đường chuẩn AMG thêm IS 31 Bảng 3.14 Ảnh hưởng có sử dụng IS 31 Bảng 3.15 Kết độ thu hồi độ lặp lại mẫu nhân hạt 32 Bảng 3.16 Kết độ thu hồi độ lặp lại bánh 33 Bảng 3.17 Kết xác định hàm lượng Amygdalin mẫu thực phẩm 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống thời đại bận rộn, xã hội ngày phát triển, người ta phải để ý tới sức khỏe thân Việc chăm sóc cho sức khỏe thân người xuất phát từ việc ăn uống, tiêu thụ, sử dụng thực phẩm chất lượng, giàu dinh dưỡng có nguồn gốc rõ ràng Vì mà xu gần đây, việc lựa chọn bổ sung loại hạt sản phẩm từ hạt bữa ăn hàng ngày hạt óc chó, hạt điều, hạt hạnh nhân, hạt bí, … trở nên phổ biến Trong đó, hạt hạnh nhân nhiều nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng tới sức khỏe người dùng tăng mức polyphenol giảm đáng kể tác hại trình oxy hóa tới thể [40], cải thiện khả chống chọi với bất thường liên quan đến hội chứng chuyển hóa [43], thực phẩm hỗ trợ giảm cân [14], giúp làm tăng HDL cholesterol cải thiện dấu hiệu chuyển hóa lipid bất thường khác bệnh nhân Bệnh động mạch vành có cholesterol HDL ban đầu thấp [23] Bên cạnh việc lựa chọn thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, người có xu hướng sử dụng nguồn nguyên liệu khác thay cho nguyên liệu truyền thống Bột hạnh nhân cho có nhiều lợi ích bột mì truyền thống nên sử dụng để thay cho nguyên liệu làm bánh Tuy nhiên, hạnh nhân nguyên liệu từ hạnh nhân có chứa amygdalin – cyanogenic glycoside Khi vào đường tiêu hóa chất thủy phân tạo thành acid hydrocyanic, từ dẫn đến ngộ độc cyanid Ngộ độc cyanid nhẹ khiến người bệnh từ buồn nơn, chóng mặt, mức độ nặng co giật, tím, mê sâu Do vậy, người tiêu dùng hồn tồn có nhiều nguy tiếp xúc với amygdalin thực phẩm Tuy khơng bị gây ngộ độc cyanid cấp tính sử dụng dài ngày, thường xuyên làm người dùng bị nhiễm độc cyanid mạn tính Hiện nay, Bộ Y tế chưa có khuyến cáo hàm lượng tối đa hàng ngày nên tiêu thụ với amygdalin thực phẩm Việt Nam chưa có phương pháp xác định amygdalin thực phẩm Vì thực đề tài “Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng amygdalin thực phẩm” nhằm xác định amygdalin đánh giá nguy tới sức khỏe Mục tiêu mà đề tài nhắm tới: Xây dựng phương pháp xác định amygdalin sử dụng kỹ thuật LC –MS/MS Ứng dụng phương pháp để xác định amygdalin mẫu mua thị trường 24 Jaszczak-Wilke, E., Polkowska, A., Koprowski, M., Owsianik, K., Mitchell, A E., & Bałczewski, P (2021), “Amygdalin: Toxicity, Anticancer Activity and Analytical Procedures for Its Determination in Plant Seeds”, Molecules, 26(8), 2253 25 Jiagang, D., Wang, H., Liu, Y., Li, C., Hao, E., Du, Z., Bao, C., Lv, J., & Wang, Y (2012), “Anti-Atherosclerotic Effects Mediated by the Combination of Probucol and Amygdalin in Apolipoprotein E-Knockout Mice Fed with a High Fat Diet”, Journal of Animal and Veterinary Advances, 11(1), 20–25 26 Karsavuran, N., Charehsaz, M., Celik, H., Asma, B M., Yakıncı, C., & Aydın, A (2014), “Amygdalin in bitter and sweet seeds of apricots”, Toxicological & Environmental Chemistry, 96(10), 1564–1570 27 Li, X., Shi, F., Gu, P., Liu, L., He, H., & Ding, L (2014), “A sensitive LC–MS/MS method for simultaneous determination of amygdalin and paeoniflorin in human plasma and its application”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 92, 160–164 28 Meredith T., Jacobsen D., Haines J., Berger J-C., and A Van Heijst (1993), Antidotes for Poisoning by Cyanide, World Health Organization 29 Mirmiranpour, H., Khaghani, S., Zandieh, A., Khalilzadeh, O O., Gerayesh-Nejad, S., Morteza, A., & Esteghamati, A (2012), “Amygdalin inhibits angiogenesis in the cultured endothelial cells of diabetic rats”, Indian journal of pathology & microbiology, 55(2), 211–214 30 Nabavizadeh, F., Alizadeh, AM., adroleslami, ZS., Adeli, S (2011), “Gastroprotective effects of amygdalin on experimental gastric ulcer: Role of NO and TNF-alpha”, Journal of Medicinal Plants Research, 5, 3122-3127 31 Newton, G W., Schmidt, E S., Lewis, J P., Lawrence, R., & Conn, E (1981), “Amygdalin toxicity studies in rats predict chronic cyanide poisoning in humans” Western Journal of Medicine, 134(2), 97 32 Nikolic, L (2012), “Development and validation of HPLC method for the determination of amygdalin in the plant extract of plum kernel”, Research Journal of Chemistry and Environment 33 Qadir, M., & Fatima, K (2017), “Review on Pharmacological Activity of Amygdalin”, Archives in Cancer Research, 05(04) 34 Rubino, M J., & Davidoff, F (1979), “Cyanide poisoning from apricot seeds”, JAMA, 241(4), 359 35 Sauer, H., Wollny, C., Oster, I., Tutdibi, E., Gortner, L., Gottschling, S., & Meyer, S (2015), “Severe cyanide poisoning from an alternative medicine treatment with amygdalin and apricot kernels in a 4-year-old child”, Wiener Medizinische Wochenschrift, 165(9–10), 185–188 36 Savic, I M., Nikolic, V D., Savic-Gajic, I M., Nikolic, L B., Ibric, S R., & Gajic, D G (2015), “Optimization of technological procedure for amygdalin isolation from plum seeds (Pruni domesticae semen)”, Frontiers in Plant Science, 37 Shim, S M., & Kwon, H (2010), “Metabolites of amygdalin under simulated human digestive fluids”, International journal of food sciences and nutrition, 61(8), 770–779 38 Suchard, J R., Wallace, K L., & Gerkin, R D (1998), “Acute cyanide toxicity caused by apricot kernel ingestion”, Annals of emergency medicine, 32(6), 742– 744 39 Tanaka, T., Kimura, K., Kan, K., Katori, Y., Michishita, K., Nakano, H., & Sasamoto, T (2020), “Quantification of amygdalin, prunasin, total cyanide and free cyanide in powdered loquat seeds”, Food Additives & Contaminants: Part A, 37(9), 1503–1509 40 Torabian, S., Haddad, E., Rajaram, S., Banta, J., & Sabaté, J (2009), “ Acute effect of nut consumption on plasma total polyphenols, antioxidant capacity and lipid peroxidation”, Journal of human nutrition and dietetics : the official journal of the British Dietetic Association, 22(1), 64–71 41 Unproven methods of cancer management Laetrile (1991), CA: A Cancer Journal for Clinicians, 41(3), 187–192 42 White, W L., Arias-Garzon, D I., McMahon, J M., & Sayre, R T (1998), “Cyanogenesis in Cassava1” Plant Physiology, 116(4), 1219–1225 43 Wien, M A., Sabaté, J M., Iklé, D N., Cole, S E., & Kandeel, F R (2003), “Almonds vs complex carbohydrates in a weight reduction program”, International journal of obesity and related metabolic disorders : journal of the International Association for the Study of Obesity, 27(11), 1365–1372 Trang web: 44 , xem 12/5/2022 45 , xem 12/5/2022 PHỤ LỤC Phụ lục 1.1 Khảo sát chương trình gradient PL-1 Phụ lục 1.2 Khảo sát chương trình gradient PL-1 Phụ lục 1.3 Khảo sát dung môi chiết PL-1 Phụ lục 1.4 Khảo sát dung môi loại béo PL-2 Phụ lục 1.5 Khảo sát nhiệt độ siêu âm PL-2 Phụ lục 1.6.Khảo sát thời gian siêu âm PL-2 Phụ lục 1.7 Kết khảo sát thể tích dung mơi PL-2 Phụ lục 2.1 Kết đường chuẩn pha tronng dung môi sắc ký đồ PL-3 Phụ lục 2.2 Kết đường chuẩn mẫu nhân hạt sắc ký đồ PL-3 Phụ lục 2.3 Kết đường chuẩn mẫu bánh sắc ký đồ PL-3 Phụ lục 3.1 Sắc ký đồ dung môi PL-4 Phụ lục 3.2 Sắc ký đồ chuẩn pha dung môi PL-4 Phụ lục 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn, a) trắng – AMG, b) trắng thêm chuẩn – AMG, c) trắng – CAP, d) trắng thêm chuẩn – CAP PL-5 Phụ lục 3.4 Kết so sánh tỉ số ion mẫu PL-5 Phụ lục 4.1 Kết độ ổn định hệ thống PL-6 Phụ lục 5.1 Sắc ký đồ LOQ AMG mẫu, a) nhân hạt, b) bánh PL-7 Phụ lục 6.1: Kết độ độ lặp lại với mẫu nhân hạt PL-8 Phụ lục 6.2: Kết độ độ lặp lại bánh PL-9 Phụ lục 7.1 Sắc ký đồ phân tích mẫu, a) Hạt hạnh nhân - CAP, b) Hạt hạnh nhân AMG, c) Bánh B1 - CAP, d) Bánh B1 - AMG PL-10 Phụ lục 7.2 Kết phân tích mẫu thực sắc ký đồ PL-11 Phụ lục 1: Kết khảo sát Phụ lục 1.1 Khảo sát chương trình gradient Phụ lục 1.2 Khảo sát chương trình gradient Phụ lục 1.3 Khảo sát dung môi chiết PL-1 Phụ lục 1.4 Khảo sát dung môi loại béo Phụ lục 1.5 Khảo sát nhiệt độ siêu âm Phụ lục 1.6.Khảo sát thời gian siêu âm Phụ lục 1.7 Kết khảo sát thể tích dung môi PL-2 Phụ lục 2: Kết đường chuẩn Phụ lục 2.1 Kết đường chuẩn pha tronng dung môi sắc ký đồ Phụ lục 2.2 Kết đường chuẩn mẫu nhân hạt sắc ký đồ Phụ lục 2.3 Kết đường chuẩn mẫu bánh sắc ký đồ PL-3 Phụ lục 3: Kết độ đặc hiệu Phụ lục 3.1 Sắc ký đồ dung môi Phụ lục 3.2 Sắc ký đồ chuẩn pha dung môi PL-4 Phụ lục 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn, a) trắng – AMG, b) trắng thêm chuẩn – AMG, c) trắng – CAP, d) trắng thêm chuẩn – CAP Phụ lục 3.4 Kết so sánh tỉ số ion mẫu PL-5 Phụ lục 4: Kết độ ổn định hệ thống Phụ lục 4.1 Kết độ ổn định hệ thống PL-6 Phụ lục 5: Kết LOQ mẫu Phụ lục 5.1 Sắc ký đồ LOQ AMG mẫu, a) nhân hạt, b) bánh PL-7 Phụ lục 6: Độ độ lặp lại Phụ lục 6.1 Kết độ độ lặp lại với mẫu nhân hạt PL-8 Phụ lục 6.2 Kết độ độ lặp lại bánh PL-9 Phụ lục 7: Kết mẫu thực: Phụ lục 7.1 Sắc ký đồ phân tích mẫu, a) Hạt hạnh nhân - CAP, b) Hạt hạnh nhân AMG, c) Bánh B1 - CAP, d) Bánh B1 - AMG PL-10 Phụ lục 7.2 Kết phân tích mẫu thực sắc ký đồ PL-11 ...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN TRUNG THÀNH MÃ SINH VIÊN: 1701521 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMYGDALIN TRONG THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS... thụ với amygdalin thực phẩm Việt Nam chưa có phương pháp xác định amygdalin thực phẩm Vì chúng tơi thực đề tài ? ?Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng amygdalin thực phẩm? ?? nhằm xác định amygdalin. .. hàm lượng amygdalin hạt 36 Chương 4: Kết luận kiến nghị  Kết luận Sau trình nghiên cứu, đề tài đạt mục tiêu đề ra, cụ thể: Đã xây dựng thành cơng phương pháp phân tích xác định amygdalin thực phẩm