Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester trong sản phẩm dinh dưỡng công thức bằng gc msms

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THU PHƯƠNG XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLYCIDYL ESTER TRONG SẢN PHẨM DINH DƯỠNG CÔNG THỨC BẰNG GC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THU PHƯƠNG Mã sinh viên: 1701463 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLYCIDYL ESTER TRONG SẢN PHẨM DINH DƯỠNG CƠNG THỨC BẰNG GC-MS/MS KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Ngô Minh Thúy ThS Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất Viện dinh dưỡng Quốc gia Việt Nam HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành dành cho người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian qua Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ThS Ngô Minh Thúy, ThS Lê Hồng Dũng TS Nguyễn Lâm Hồng dành nhiều thời gian tâm huyết để hướng dẫn, giúp đỡ hồn thành đề tài tốt nghiệp Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy cô công tác Bộ mơn Hóa Phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội dạy giúp đỡ thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn tồn thể cán khoa Hóa thực phẩm – Viện dinh dưỡng Quốc gia giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực tập nghiên cứu khoa Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn chân thành cho gia đình, bạn bè Sự đồng hành, sẻ chia người nguồn động lực to lớn suốt năm tháng học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2022 Sinh viên Lê Thu Phương MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu glycidyl ester 1.1.1 Công thức cấu tạo tính chất lý hóa 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Sự xuất glycidyl ester sản phẩm dinh dưỡng công thức 1.1.4 Độc tính 1.1.5 Quy định hành 1.2 Phương pháp xác định glycidyl ester sản phẩm dinh dưỡng công thức 1.2.1 Chiết xuất chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng công thức 1.2.2 Phương pháp xác định glycidyl ester dầu 1.2.2.1 Định lượng gián tiếp 1.2.2.2 Định lượng trực tiếp 1.3 Tổng quan sắc kí khí khối phổ 1.3.1 Sắc kí khí 1.3.2 Detector khối phổ 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Chất chuẩn 12 2.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 12 2.1.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 12 2.1.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc 12 2.1.4 Chuẩn bị mẫu blank 13 2.1.5 Dung mơi, hóa chất 13 2.1.6 Thiết bị, dụng cụ 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích 14 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 14 2.2.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 15 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu thử 15 2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu chuẩn 15 2.3.2 Phương pháp phân tích 15 2.3.3 Phương pháp thẩm định 16 2.3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 16 2.3.3.2 Độ đặc hiệu 16 2.3.3.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 17 2.3.3.4 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 17 2.3.3.5 Độ xác 18 2.3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 19 2.3.5 Phương pháp xử lý kết 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 20 3.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện GC-MS/MS 20 3.2.1 Điều kiện sắc kí khí 20 3.2.2 Điều kiện khối phổ 21 3.3 Thẩm định phương pháp 23 3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 23 3.3.2 Độ đặc hiệu 23 3.3.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 25 3.3.4 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 26 3.3.5 Độ xác 28 3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 29 3.5 Bàn luận 30 3.5.1 Phương pháp xử lý mẫu 30 3.5.2 Phương pháp phân tích 31 3.5.3 Thẩm định phương pháp 31 3.5.4 Phân tích mẫu thực tế 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 Kết luận 33 Đề xuất 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nội dung đầy đủ Nghĩa tiếng Việt 2-chloropropanediol 2-monochloropropane-1,3-diol ester 3-bromopropanediol 3-bromopropanediol internal standard 3-monobromopropane-1,2-diol 2-chloropropandiol 2-monochloropropan-1,3diol ester 3-bromopropandiol Chuẩn nội 3bromopropandiol 3-monobromopropan-1,2- ester diol ester 3-chloropropanediol 3-chloropropandiol 3-monochloropropane-1,2-diol 3-monochloropropan-1,2- ester diol ester As low as reasonably achievable Association of Official Analytical Chemists American Oil Chemists’ Society Thấp đạt Hiệp hội nhà hố phân tích thức Hiệp hội nhà hóa học dầu Mỹ Năng lượng va chạm Ion hóa hóa học Gây ung thư, gây độc với hệ sinh sản Diacylglycerol 2-MCPD 2-MCPDE 3-MBPD 3-MBPD IS 3-MBPDE 3-MCPD 3-MCPDE ALARA AOAC 10 AOCS 11 12 CE CI 13 CMR 14 DAG Collision energy Chemical ionization Carcinogenic, Mutagenic or Toxic to Reproduction Diacylglycerol 15 EFSA European Food Safety Authority Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu 16 EtOEt 17 FSCJ Diethyl ether Food Safety Commission of Japan Diethyl ether Ủy ban An toàn thực phẩm Nhật Bản 18 GC-MS/MS Gas Chromatography - Tandem Mass Spectrometry Sắc kí khí khối phổ lần 19 GE Glycidyl ester Glycidyl ester 20 GLC Gas - liquid chromatography Sắc kí khí – lỏng 21 Gly-P Glycidyl palmitate Glycidyl palmitat 22 Gly-P-d5 Glycidyl palmitate-d5 Glycidyl palmitat-d5 23 GSC Gas - solid chromatography Sắc kí khí – rắn 24 IARC International Agency for Research on Cancer Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế 25 IP Identification point Điểm nhận dạng 26 IS Internal standard Chất chuẩn nội Ủy ban chuyên gia Phụ 27 JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives 28 LC-MS/MS Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Sắc kí lỏng khối phổ lần 29 LOAEL Lowest observed adverse effect Liều thấp gây độc level tính quan sát 30 LOD Limit of detection Giới hạn phát 31 LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng 32 MAG Monoacylglycerol Monoacylglycerol 33 34 ML MoE Maximum level Margin of expose Ngưỡng tối đa cho phép Biên độ phơi nhiễm 35 36 MTBE NCI Tert-butyl methyl ether Negative chemical ionization 37 NTP National Toxicology Program 38 MTBE Tert-butyl methyl ether Tert-butyl methyl ether Ion hóa học âm Chương trình Độc chất Quốc gia Tert-butyl methyl ether 39 PBA Phenylboronic acid Acid phenylboronic 40 41 PCI THF Positive chemical ionization Tetrahydrofuran Ion hóa học dương Tetrahydrofuran gia thực phẩm FAO WHO DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Quy định ngưỡng tối đa GE (tính theo glycidol) EFSA Bảng 1.2 Các phương pháp xác định gián tiếp GE dầu thực vật xác nhận thức AOCS Bảng 2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 15 Bảng 3.1 Các mảnh phổ đặc trưng dự kiến 3-MBPD chuẩn nội 21 Bảng 3.2 Các mảnh phổ đặc trưng tối ưu 3-MBPD chuẩn nội 22 Bảng 3.3 Năng lượng va chạm tối ưu (CE) 23 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống 23 Bảng 3.5 Số điểm IP phương pháp 25 Bảng 3.6 Kết tỉ lệ ion 25 Bảng 3.7 Kết đường chuẩn 27 Bảng 3.8 Kết độ thu hồi độ lặp lại 28 Bảng 3.9 Kết phân tích mẫu thực tế 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo glycidyl ester Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo glycidol Hình 1.3 Sự hình thành GE từ DAG MAG Hình 2.1 Sơ đồ nguyên lý xử lý mẫu 15 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 20 Hình 3.2 Sắc kí đồ mảnh phổ 3-MBPD IS 22 Hình 3.3 Sắc kí đồ mẫu blank, mẫu chuẩn mẫu blank thêm chuẩn 24 Hình 3.4 Sắc kí đồ mức nạp chuẩn 15 µg/kg 26 Hình 3.5 Sắc kí đồ mức nạp chuẩn µg/kg 26 Hình 3.6 Kết đường chuẩn 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Glycidyl ester (GE) chất sinh trình tinh chế dầu ăn, xác định lần dầu cọ [35] Sau đó, GE phát với lượng đáng kể nhiều loại dầu thực vật tinh chế khác [23, 26, 35] thực phẩm có chứa dầu [21, 33, 34] Độc tính GE chưa nghiên cứu đầy đủ, nghiên cứu gần cho thấy phần lớn GE chuyển hóa thành glycidol q trình tiêu hóa [4, 7] Chất chuyển hóa glycidol cho chất gây ung thư tác động gen [12, 32] Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A (nhóm chất có khả gây ung thư cho người) [20] Điều dấy lên lo ngại nguy tiềm ẩn sức khỏe người [41] Vì vậy, tháng năm 2018, Ủy ban An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) ban hành quy định ngưỡng tối đa GE (tính theo glycidol) [14] Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam chưa có quy định thức hàm lượng GE thực phẩm Chính vậy, việc phát triển phương pháp định lượng để khảo sát hàm lượng GE sản phẩm thị trường cần thiết để cung cấp liệu đánh giá nguy cơ, sở để quan quản lý đề xuất ngưỡng an toàn GE thực phẩm, đặc biệt sản phẩm dinh dưỡng cơng thức Trong nhiều năm qua, có nhiều phương pháp định lượng GE nghiên cứu phát triển giới Tuy nhiên, phần lớn phương pháp có xác định GE dầu tinh chế, việc định lượng mẫu phức tạp thực phẩm (đặc biệt sản phẩm dinh dưỡng cơng thức) cịn hạn chế Cho đến nay, Việt Nam chưa có phương pháp phân tích tiêu chuẩn xác định GE sản phẩm dinh dưỡng cơng thức Vì vậy, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester sản phẩm dinh dưỡng công thức GC-MS/MS” thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester sản phẩm dinh dưỡng công thức GC-MS/MS Ứng dụng phương pháp để sơ đánh giá hàm lượng glycidyl ester số sản phẩm dinh dưỡng công thức thị trường Chuẩn nội RT (min) 13,11 13,11 13,07 13,07 Ion m/z 147.100 m/z 91.100 m/z 150.100 m/z 93.100 Response 79819 M Amount Cal: 0.010 100.00 32.49 - 48.73 0,050 151948 M Ratio 0.008 - 0.210 0,009 32867 M 377017 M Target Range 41,18 100.00 31.14 - 46.71 40,3 Target Range Ratio C3 Chuẩn ngoại Chuẩn nội RT (min) 13,12 13,12 13,07 13,07 C4 Ion m/z 147.100 m/z 91.100 m/z 150.100 m/z 93.100 Response 325197 M Amount Cal: 0.030 0,032 130962 M 496036 M 199496 M 0.024 - 0.630 100.00 32.49 - 48.73 0,050 40,27 100.00 31.14 - 46.71 40,22 Chuẩn ngoại Chuẩn nội RT (min) 13,11 13,11 13,07 13,07 C5 Chuẩn ngoại Chuẩn nội Ion m/z 147.100 m/z 91.100 m/z 150.100 m/z 93.100 Response 956874 M Amount Cal: 0.100 189758 M Ratio 0.080 - 2.100 0,092 383031 M 525997 M Target Range 100.00 32.49 - 48.73 0,050 40,03 100.00 31.14 - 46.71 36,08 RT (min) 13,11 13,11 13,07 13,07 Ion m/z 147.100 m/z 91.100 m/z 150.100 m/z 93.100 Response 2827670 M Amount Cal: 0.300 100.00 32.49 - 48.73 0,050 177358 M Ratio 0.240 - 6.300 0,306 1072474 M 470192 M Target Range 37,93 100.00 31.14 - 46.71 37,72 Target Range Ratio C6 Chuẩn ngoại Chuẩn nội RT (min) 13,10 13,10 13,06 13,06 Ion m/z 147.100 m/z 91.100 m/z 150.100 m/z 93.100 Response 4416989 M Amount Cal: 1.000 1,000 1625883 M 225738 M 84457 M 0.800 - 21.000 100.00 32.49 - 48.73 0,050 36,81 100.00 31.14 - 46.71 37,41 Phụ lục Sắc kí đồ đánh giá độ thu hồi độ lặp lại Mức 1: Nạp chuẩn 25 µg/kg M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Mức 2: Nạp chuẩn 50 µg/kg M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Mức 3: Nạp chuẩn 75 µg/kg M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Phụ lục Sắc kí đồ mẫu thực tế (1) NĐ.I.03 Lần Lần (2) NĐ.I.05 Lần Lần (3) NĐ.II.03 Lần Lần (4) NĐ.II.06 Lần Lần (5) NK.I.02 Lần Lần (6) NK.I.08 Lần Lần (7) NK.I.09 Lần Lần (8) NK.II.02 Lần Lần Phụ lục Thông tin chất chuẩn sử dụng nghiên cứu ... nghiệp ? ?Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester sản phẩm dinh dưỡng công thức GC- MS/MS” thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng glycidyl ester sản phẩm dinh. .. xuất ngưỡng an toàn GE sản phẩm dinh dưỡng công thức 1.2 Phương pháp xác định glycidyl ester sản phẩm dinh dưỡng công thức GE sản phẩm dinh dưỡng công thức thường xác định cách chiết chất béo... Phương pháp xác định glycidyl ester sản phẩm dinh dưỡng công thức 1.2.1 Chiết xuất chất béo từ sản phẩm dinh dưỡng công thức 1.2.2 Phương pháp xác định glycidyl ester dầu 1.2.2.1 Định