TỔNG hợp và THỬ tác DỤNG SINH học dẫn CHẤT SUCCINAT của CURCUMIN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - ĐẶNG THỊ HẢI YẾN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC DẪN CHẤT SUCCINAT CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - ĐẶNG THỊ HẢI YẾN MÃ SINH VIÊN: 1401697 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC DẪN CHẤT SUCCINAT CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hải NCS Phạm Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải NCS Phạm Thị Hiền, người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt, bảo cho kiến thức, kinh nghiệm u u tạ i điều iện gi p đ suốt qng thời gian tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành ơn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, TS Nguyễn Văn Giang, TS Đào Nguyệt Sương Huyền NCS Nguyễn Thị Ngọc nhiệt t nh gi p đ , động viên khích lệ tạ điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp n Trong q trình thực khóa luận, tơi nhận gi p đ cán thuộc Phòng Hóa cơ, khoa Hóa cán Phòng NMR trường Đại h c Khoa h c tự nhiên – Đại h c quốc gia Hà Nội cán Phòng Thử nghiệm sinh h c, Viện Công nghệ sinh h c, Viện Hàn lâm Khoa h c Công nghệ Việt Nam, xin chân thành ơn Tôi xin nă ơn c c ạn bè đồng hành suốt th ng h c tập trường.Xin ơn anh chị, bạn đặc biệt bạn Trần Thị Hường em thực khóa luận phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược, Bộ mơn Cơng nghiệp Dược ln gắn ó, động iên, gi p đ , sẻ chia suốt quãng thời gian thực khóa luận Cuối cùng, xin dành biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, hai em gái tất người thân tr ng gia đ nh tôi, người ln thương, ủng hộ để tơi có ngày hôm Do thời gian làm thực nghiệ iến thức thân hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn è để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành ơn! Hà Nội, ng 18 th ng 05 nă 2019 Sinh viên Đặng Thị Hải Yến MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan curcumin 1.1.1 Cấu trúc hóa h c 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.3 Độ ổn định 1.1.4 Tác dụng sinh h c curcumin 1.2 Tiền thuốc succinat ứng dụng biến đổi cấu trúc curcumin 1.2.1 Tiền thuốc succinat 1.2.2 Các dẫn chất succinat curcumin 1.3 Lựa chọn hướng nghiên cứu 11 1.3.1 Lựa ch n hướng tổng hợp 11 1.3.2 Lựa ch n phép thử hoạt tính sinh h c 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên liệu, hóa chất 13 2.2 Dụng cụ – Thiết bị 14 2.3 Nội dung nghiên cứu 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Tổng hợp hóa h c 15 2.4.2 Kiể tra độ tinh khiết 16 2.4.3 X c định cấu trúc hóa h c 16 2.4.4 Thử hoạt tính sinh h c 16 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Cải tiến quy trình tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) 23 3.1.1 Tổng hợp S-1 theo tài liệu tham khảo 23 3.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 24 3.1.3 Quy trình tổng hợp S-1 26 3.1.4 X c định cấu trúc S-1 29 3.2 Tổng hợp dẫn chất succinat curcumin 32 3.2.1 Xây dựng quy trình tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2) 32 3.2.2 X c định cấu trúc sản phẩm S-2 37 3.2.3 Thử hoạt tính sinh h c 40 3.3 Bàn luận 41 3.3.1 Về tổng hợp hóa h c 41 3.3.2 Về x c định cấu trúc sản phẩm 45 3.3.3 Về thử hoạt tính sinh h c 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic resonance) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) AR Tinh khiết phân tích (Analytical reagent) CTCT Cơng thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử S-1 mono-O-(2-Hydroxyethyl)-curcumin S-2 2-(Curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat DCM Dicloromethan DMEM Môi trường nuôi cấy Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) DMF Dimethyl formamid DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị carbon FBS Huyết bào thai bò (Fetal bovine serum) G Gam H Giờ Hela Human cervix carcinoma (Ung thư tử cung người) HepG2 Human hepatocellular carcinoma (Ung thư gan người) HPLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at 50%) IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại) K562 Human leukemia (Ung thư bạch cầu cấp người) L-NMMA NG-methyl-L-arginin acetat logP Hệ số phân bố dầu nước LPS Lipopolysaccharid MCF7 Human breast carcinoma (Ung thư vú người) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, - diphenyltetrazolium OD Mật độ quang học (Optical Density) PEG Polyethylen glycol Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) SA Khả trung hòa gốc oxy hóa tự SC50 Nồng độ trung hòa 50% gốc tự (Scavenging concentration at 50%) SKLM Sắc ký lớp mỏng SRB Sulforhodamin B δ Độ chuyển dịch hóa học RAW 264.7 Dòng đại thực bào chuột 264.7 t°nc Nhiệt độ nóng chảy SOD Chất chống oxy hóa phân giải dây chuyền (superoxid dismutase) TCA Trichloracetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Kết thử hoạt tính gây độc mPEG2000–succinyl–curcumin curcumin hai dòng tế bào ung thư .10 Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu - hóa chất 13 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ - thiết bị 14 Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi phản ứng 24 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi DMF 25 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng .25 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng .26 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) S-1 29 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) S-1 29 Bảng 3.7 Kết phân tích phổ 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) S-1 30 Bảng 3.8 Kết phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) S-1 31 Bảng 3.9 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol anhydrid succinic : S-1 33 Bảng 3.10 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo S-2 .34 Bảng 3.11 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo S-2 .35 Bảng 3.12 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) S-2 37 Bảng 3.13 Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) S-2 .37 Bảng 3.14 Kết phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) S-2 .38 Bảng 3.15 Kết phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) S-2 39 Bảng 3.16 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa 40 Bảng 3.17 Khả ức chế sản sinh NO lên dòng tế bào RAW 264.7 .40 Bảng 3.18 Tác động mẫu nghiên cứu đến sống sót tế bào RAW 264.7 .40 Bảng 3.19 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư Hela HepG2 41 Bảng 3.20 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư K562 MCF7 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo curcumin .2 Hình 1.2 Dạng hỗ biến ceto-enol dung dịch Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin Hình 1.4 Sự phân hủy curcumin tác dụng ánh sáng Hình 1.5 Sự phân hủy curcumin môi trường kiềm .5 Hình 1.6 Tác dụng sinh học tiềm curcumin Hình 1.7 Tiền thuốc artemisinin Hình 1.8 Tiền thuốc α-tocopherol Hình 1.9 Công thức cấu tạo curcumin diethyl disuccinat 10 Hình 1.10 Cơng thức cấu tạo mPEG2000–succinyl–curcumin 10 Hình 1.11 Phản ứng tạo dẫn chất succinat curcumin .11 Hình 1.12 Phản ứng tạo curcumin diethyl disuccinat 11 Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp S-2 12 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2) 15 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp S-1 23 Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp S-1 quy mơ g/mẻ 28 Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp S-2 32 Hình 3.4 Cơ chế phản ứng tổng hợp S-1 42 Hình 3.5 Các sản phẩm phụ phản ứng tạo S-1 .42 Hình 3.6 Cơ chế phản ứng acyl hóa tạo S-2 43 Hình 3.7 Dạng hỗ biến enol - ceton 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xa xưa, người biết đến sử dụng nghệ đời sống hàng ngày Nghệ không dùng làm gia vị cho bữa ăn, làm phẩm màu mà sử dụng làm thuốc Với vai trò làm thuốc, nghệ sử dụng để làm mờ sẹo vết thương, hỗ trợ điều trị đau dày, chữa mụn nhọt,…Hiện nay, nghiên cứu curcuminoid nhóm hoạt chất tạo nên tác dụng sinh học quan trọng củ nghệ Hỗn hợp curcuminoid bao gồm curcumin, demethoxycurcumin bisdemethoxycurcumin curcumin thành phần (77%) [22] Curcumin nghiên cứu chứng minh tác dụng dược lý như: chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, làm lành vết thương, làm liền sẹo… [1], [19] Tuy có nhiều tác dụng sinh học ứng dụng lâm sàng curcumin bị hạn chế độ tan curcumin nước pH acid sinh lý thấp, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng sử dụng theo đường uống dẫn đến sinh khả dụng curcumin thấp [22] Để tăng sinh khả dụng curcumin, người ta tiến hành đưa curcumin vào hệ thống phân phối thuốc liposome, micel, polisacharid, tạo phức hợp phospholipid tiểu phân nano… Tuy nhiên, chưa cải thiện độ ổn định curcumin môi trường kiềm ánh sáng [24] Một hướng tiếp cận khác sử dụng cho chất có hoạt tính sinh học tốt tan tổng hợp tiền thuốc-một chiến lược sửa đổi phân tử nhằm mục đích tối ưu hóa tính chất hóa lý dược lý thuốc để cải thiện độ tan tính dược động học giảm độc tính thuốc Các tiền thuốc hay gặp thường ester, amid, carbamat, carbonat, ether, imin,… [8] Dạng ester succinat số đích hướng đến tổng hợp tiền thuốc Một số ví dụ kể đến dạng ester succinat chất cloramphenicol, prednisolon, methylprednisolon làm tăng độ tan so với chất mẹ ban đầu [15]; dạng ester succinat artemisinin artesunat vừa tăng độ tan, vừa tăng tác dụng chống sốt rét so với artemisinin [3] Xuất phát từ thực tiễn trên, thực đề tài “Tổng hợp thử tác dụng chống ung thư dẫn chất succinat curcumin” với hai mục tiêu: Tổng hợp dẫn chất succinat curcumin Thử tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm dẫn chất tổng hợp Phụ lục 13 Phổ 13C-NMR S-2 Phụ lục 14 Phổ 13C-NMR giãn S-2 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner Scanned with CamScanner ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - ĐẶNG THỊ HẢI YẾN MÃ SINH VIÊN: 1401697 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC DẪN CHẤT SUCCINAT CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn... chất succinat curcumin với hai mục tiêu: Tổng hợp dẫn chất succinat curcumin Thử tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm dẫn chất tổng hợp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan curcumin 1.1.1... cộng tiến hành tổng hợp dẫn chất succinat curcumin sử dụng tác nhân anhydrid succinic dung mơi pyridin 20○C [9] (Hình 1.11) Hình 1.11 Phản ứng tạo dẫn chất succinat curcumin  Sử dụng tác nhân halogenid