Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất 2 phenoxybutylthio benzimidazol

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGÂN NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 2 PHENOXYBUTYLTHIO BENZIMIDAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Đào Nguyệt Sương Huyền Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Công nghiệp Dược 2. Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 2- PHENOXYBUTYLTHIO-

BENZIMIDAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 2- PHENOXYBUTYLTHIO-

1 Bộ môn Công nghiệp Dược

2 Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI-2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS

Nguyễn Đình Luyện, ThS Đào Nguyệt Sương Huyền - những người thầy đã nhiệt

tình hướng dẫn, cho tôi những lời khuyên quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đặc

biệt là TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang, ThS Phạm Thị Hiền và

CN Phan Tiến Thành thuộc phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược bộ môn Công

nghiệp Dược, trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học – Viện Công nghệ Sinh học của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa học - Trường Đại học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Đồng thời tôi xin cảm ơn toàn thể các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội!

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè - những người luôn giúp đỡ, động viên, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quãng thời gian học tập cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015

Sinh viên Nguyễn Thị Ngân

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ 2- MERCAPTOBENZIMIDAZOL 2

1.1.1 Cấu tạo của khung 2- mercaptobenzimidazol 2

1.1.2 Tính chất hóa lý của 2- mercaptobenzimidazol 2

1.2 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2-MERCAPTO-BENZIMIDAZOL 2

1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 2

1.2.2 Tác dụng gây độc tế bào ung thư 5

1.2.3 Tác dụng ức chế bơm proton H+/K+-ATPase, chống bài tiết dịch vị và chống viêm loét dạ dày 7

1.2.4 Tác dụng chống viêm, giảm đau 7

1.2.5 Các tác dụng khác của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol 9

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT KHUNG 2-MERCAPTOBENZIMIDAZOL 9

1.3.1 Phản ứng đóng vòng tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol (2MBI) 9

1.3.2 Tổng hợp dẫn chất S-alkyl hóa khung 2-mercaptobenzimidazol 11

1.3.2.1 Phản ứng S-alkyl hóa 11

1.3.2.2 Kết hợp khung 2-mercaptobenzimidazol và phenoxybutyl 11

1.4 LỰA CHỌN HƯỚNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CHO ĐỀ TÀI 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 13

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.3.1 Tổng hợp hóa học 15

2.3.2 Xác định độ tinh khiết 16

2.3.3 Xác định cấu trúc 16

2.3.4 Thử tác dụng sinh học 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 18

3.1.1 Tổng hợp các chất trung gian 18

3.1.1.1 Tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (II-a) 18

3.1.1.2 Tổng hợp 5-methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b) 18

3.1.1.3 Tổng hợp 1,4-dibromobutan 19

3.1.1.4 Tổng hợp methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat (III) 20

3.1.2 Tổng hợp các chất IV-a, IV-b, V-a, V-b 21

3.1.2.1 Tổng hợp 2-[(4-(4-methoxycarbonyl)phenoxybutyl)thio]-1H-benzo[d]imidazol (IV-a) 21

3.1.2.2 Tổng hợp 5-methyl-2-[(4-(4-methoxycarbonyl)phenoxybutyl)thio]-1H-benzo[d]imidazol (IV-b) 22

3.1.2.3 Tổng hợp 2-[(4-(4-carbonylhydroxy)phenoxybutyl)thio]-1H-benzo[d]imidazol (V-a) 23

3.1.2.4 Tổng hợp 5-methyl-2-[(4-(4-carbonylhydroxy)phenoxybutyl)thio]-1H-benzo[d]imidazol (V-b) 23

3.2 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 25

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC DẪN CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC 26

3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 26

3.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) 27

3.3.3 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 29

3.4 THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 31

3.5 BÀN LUẬN 32

3.5.1 Về tổng hợp hóa học 32

3.5.1.1 Phản ứng ngưng tụ tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol 32

3.5.1.2 Phản ứng alkyl hóa tạo methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat (III) 33

3.5.1.3 Phản ứng tạo IV-a, IV-b, V-a, V-b 34

3.5.2 Về cấu trúc các sản phẩm 34

3.5.3 Về hoạt tính sinh học 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µM Micromol

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear

Magnetic Resonance Spectroscopy) 2MBI 2-mercaptobenzimidazol

AcOH Acid acetic

CH2Cl2 Dicloromethan

CHCl3 Cloroform

CNS Tế bào ung thư hạch ở các bệnh nhân AIDS

CTCT Công thức cấu tạo

HT-29 Dòng tế bào ung thư đại tràng người

IC50 Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế

50%)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

LU-1, LU Dòng tế bào ung thư phổi

m Khối lượng

MCF7 Dòng tế bào ung thư vú

MeOH Methanol

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

MS Phổ khối lượng phân tử (Mass Spectroscopy)

n-BuOH n-butanol

OD Mật độ quang học

Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) SKLM Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 CTCT các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo G.Yaseen 3

Bảng 1.2 Đường kính vòng vô khuẩn của các chất 1a– 1f 3

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất 13

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ, thiết bị 14

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học 25

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to nc) của các chất 25

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) của các chất 27

Bảng 3.4 Kết quả phổ MS của các chất 28

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 29

Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào 32

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 CTCT của phân tử 2-mercaptobenzimidazol 2

Hình 1.2 CTCT các dẫn chất theo M Hosamani và V Shingalapur 4

Hình 1.3 CTCT một số dẫn chất styryl sulfon theo M S Vedula 5

Hình 1.4 CTCT dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo các nhà nghiên cứu 6

Trung Quốc 6

Hình 1.5 CTCT 2 dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo TS Nguyễn Văn Hải 6

Hình 1.6 CTCT chung của các dẫn chất theo Junggren và cộng sự 7

Hình 1.7 CTCT chung của các dẫn chất theo nghiên cứu của Sung Yun Cho 7

Hình 1.8 CTCT của các dẫn chất theo K Anandarajagopal và các cộng sự 8

Hình 1.9 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của Sidram A Nevade 8

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp khung 2-mercaptobenzimidazol của Allan và Deacon 1 9 Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp khung 2-mercaptobenzimidazol của Allan và Deacon 2 9 Hình 1.12 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol theo M L Wang năm 1995 10

Hình 1.13 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol theo M L Wang năm 2007 10

Hình 1.14 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol từ arylcarbamothioyl cyanid và o-cloroanilin 11

Hình 1.15 Phản ứng S-alkyl hóa với tác nhân alkyl halogenid của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol 11

Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol mang khung phenoxy 12

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp của các chất IV-a, IV-b, V-a, V-b 15

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp chất II-a 18

Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất II-b 19

Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp 1,4-dibrombutan 19

Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất III 20

Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất IV-a 21

Hình 3.6 Sơ đồ tổng hợp chất IV-b 22 Hình 3.7 Sơ đồ tổng hợp các chất V-a 23 Hình 3.8 Sơ đồ tổng hợp chất V-b 24 Hình 3.9 Sơ đồ quá trình tạo dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol từ o-

phenylendiamin và carbondisulfid 33

Hình 3.10 Phản ứng tạo sản phẩm phụ 1,4-bis(p-carbonylmethoxy)butan 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các dẫn xuất của 2-mercaptobenzimidazol là một trong những nhóm dẫn xuất quan trọng của dị vòng benzimidazol Một số hoạt chất chứa khung 2-mercaptobenzimidazol đã được đưa vào ứng dụng trong lâm sàng làm thuốc điều trị bệnh là: triclabendazol (trị sán), omeprazol (giảm acid dạ dày), lansoprazol (giảm acid dạ dày)….[23,28] Nhiều công trình nghiên cứu trong những thập kỷ gần đây

đã chỉ ra tác dụng sinh học đa dạng của các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol, điển hình như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống virus, gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, chống loét dạ dày, giảm lipid máu và xơ vữa động mạch [5,8] Hơn nữa, các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol có thể dễ dàng được tạo ra bằng con đường hóa học với hiệu suất tốt theo các phương pháp tổng hợp kinh điển để đáp ứng nhu cầu với quy mô lớn [5]

Chính vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu, tổng hợp các hợp chất mới của mercaptobenzimidazol là một hướng có tiềm năng lớn trong việc tìm ra các phân tử

có hoạt tính sinh học cao phát triển làm thuốc Mặt khác kết hợp mercaptobenzimidazol với khung phenoxybutyl đã được một vài nghiên cứu gần đây cho thấy có hoạt tính tốt Để góp phần làm phong phú thêm các nghiên cứu về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của lớp dẫn chất quan trọng này, chúng tôi thực

2-hiện đề tài “ Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất 2-

(phenoxybutylthio)benzimidazol” với những mục tiêu sau:

1 Tổng hợp một số dẫn chất 2- (phenoxybutylthio)benzimidazol

2 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của một số dẫn chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ 2- MERCAPTOBENZIMIDAZOL

1.1.1 Cấu tạo của khung 2- mercaptobenzimidazol

2- Mercaptobenzimidazol, tên khoa học 1H-benzo[d]imidazol-2-thiol là dẫn

chất của benzimidazol, cấu tạo bởi khung benzimidazol liên kết với nhóm thiol (SH) ở vị trí số 2 (xem hình 1.1)

1H-benzo[d]imidazol-2-thiol

Hình 1.1 CTCT của phân tử 2-mercaptobenzimidazol

Công thức phân tử: C7H6N2S

Khối lượng phân tử: 150,2 đvC

1.1.2 Tính chất hóa lý của 2- mercaptobenzimidazol

- Cảm quan: tinh thể hình phiến mỏng, có màu vàng nhạt hoặc màu trắng

- Độ tan:

 Tan được trong dung môi hữu cơ như: methanol, ethyl acetat, aceton…

 Tan rất tốt trong ethanol

 Tan rất ít trong nước, độ hòa tan trong nước: < 0,1 g/100 mL ở 23,5oC

Bảng 1.1 CTCT các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo G.Yaseen

µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL Kết quả cho thấy các hợp chất này có tính kháng

khuẩn từ trung bình đến tốt, trong đó chất 1c và 1e cho tác dụng mạnh nhất, chất 1a

và 1d không có tác dụng ức chế đối với E coli ở nồng độ thấp hơn 50 µg/mL, 1f có

tác dụng yếu trên B subtilis Kết quả cụ thể trong bảng sau [29]:

Bảng 1.2 Đường kính vòng vô khuẩn của các chất 1a– 1f

Hợp chất

B subtilis 6633 - Gr(+) E coli ATCC3750 – Gr(-)

50 µg/mL

100 µg/mL

200 µg/mL

50 µg/mL

100 µg/mL

200 µg/mL

Hình 1.2 CTCT các dẫn chất theo M Hosamani và V Shingalapur

Các chất thử và fluconazol, ciprofloxacin chuẩn được pha trong DMSO để

có nồng độ ban đầu 250 mg/mL và sau đó được pha loãng trong môi trường nuôi cấy thành các nồng độ: 125; 62,5; 31,250; 16; 8; 4; 2 và 1 mg/mL Hoạt tính của mỗi chất được xác định bằng cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trong ống nghiệm

Đối với tác dụng kháng khuẩn, thử nghiệm tiến hành trên S aureus và S

faecalus là vi khuẩn Gram (+), K pneumonia và E coli là vi khuẩn Gram (-), thuốc

đối chiếu là ciprofloxacin

Đối với tác dụng chống nấm, thử nghiệm tiến hành trên C albicans và A

fumigatus, thuốc đối chiếu là fluconazol

Trong số các hợp chất tổng hợp được thì hoạt tính chống vi khuẩn của 2b, 3b,

3e, 3f là tốt nhất so với fluconazol và ciprofloxacin chuẩn [15]

1.2.2 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2003, M S Vedula và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất styryl sulfon của 2-mercaptomethylbenzimidazol (xem hình 1.3)

Hình 1.3 CTCT một số dẫn chất styryl sulfon theo M S Vedula

Các dẫn chất tổng hợp được đem thử in vitro trên các dòng tế bào ung thư

khác nhau Kết quả cho thấy các chất thử cho tác dụng gây độc tế bào từ vừa phải đến tốt

Trong đó, các dẫn chất thế với nguyên tử halogen ở vị trí para trên nhân

thơm cho hoạt tính khá mạnh Đặc biệt là dẫn chất 5d (R=R1= R3= H, R2= Br) với

nhóm bromo ở vị trí para trên nhân phenyl cho tác dụng với GI50 trung bình là 8,5

µM Dẫn chất này cho tác dụng đặc biệt trên các dòng tế bào vú, thận và CNS (tế

bào ung thư hạch ở bệnh nhân AIDS) và buồng trứng Chất 5h

(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxy phenyl) cho tác dụng tốt hơn các hợp chất có gắn halogen ở vị trí

orthor với IC50 < 5µM trên hầu hết các dòng tế bào thử Chất 4k (R= -6-Cl, R1=

-CH3, R2= -Cl, R3= H) cho thấy hoạt tính mạnh nhất với tác dụng ức chế 50% sự phát triển của 4 dòng tế bào trên ở nồng độ < 1µM

Dựa trên cơ sở đặc tính dược lực học tương đối tốt, chất 4k được đem đi thử

nghiệm in vivo trên dòng tế bào ung thư đại tràng người (HT-29) ghép ngoại lai

trên chuột Kết quả cho thấy khi uống liều 400 mg/kg 4k chống lại 51% sự phát

triển của HT-29 [25]

Năm 2012, một nhóm các nhà nghiên cứu của Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của một số dẫn chất trong đó có dẫn chất của 2-mercaptobenzimidazol (xem hình 1.4) Chất này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư đại tràng [30]

Hình 1.4 CTCT dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo các nhà nghiên cứu

Trung Quốc

Năm 2014, TS Nguyễn Văn Hải và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của 2 dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol (xem hình 1.5)

Hình 1.5 CTCT 2 dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo TS Nguyễn Văn Hải

Các chất thử (20 µL) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của

khay 96 giếng để có nồng độ: 100; 20; 4 và 0,8 µg/mL Chất đối chứng là ellipticin,

sử dụng ở các nồng độ: 10; 2; 0,4 và 0,08 µg/mL Kết quả cho thấy 2 mẫu nghiên

cứu 7a, 7b có hoạt tính khá mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi (LU-1) và dòng tế bào ung thư vú (MCF7) [1]

1.2.3 Tác dụng ức chế bơm proton H + /K + -ATPase, chống bài tiết dịch vị và chống viêm loét dạ dày

Năm 1981, Junggren và các cộng sự đã tổng hợp một số dẫn chất

2-mercaptobenzimidazol có công thức cấu tạo sau (xem hình 1.6)

Hình 1.6 CTCT chung của các dẫn chất theo Junggren và cộng sự

Tất cả các dẫn chất này đều có tác dụng chống bài tiết dịch vị, trong đó có một số dẫn chất nêu trên là có tác dụng khá mạnh (hiệu lực ức chế 95-100%) [16]

Năm 2001, Y C Sung và cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng ức chế bơm proton H+/K+-ATPase của các dẫn chất benzimidazol có công thức cấu tạo chung như sau (xem hình 1.7)

Hình 1.7 CTCT chung của các dẫn chất theo nghiên cứu

của Sung Yun Cho

Các chất thử được sử dụng trên chuột, chất đối chiếu là omeprazol Kết quả

cho thấy các dẫn chất này đều có tác dụng ức chế bài tiết dịch vị ở dạ dày [9]

1.2.4 Tác dụng chống viêm, giảm đau

Năm 2010, K Anandarajagopal và các cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng giảm đau của các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol (xem hình 1.8)

Hình 1.8 CTCT của các dẫn chất theo K Anandarajagopal và các cộng sự

Tất cả các hợp chất làm giảm đau đáng kể với liều 20 mg/mL, khi so sánh

với pentazocin thuốc tiêu chuẩn 5 mg/mL Tất cả các hợp chất thử nghiệm có tác

dụng giảm đau sau 30 phút và giảm đau tối đa đạt được ở 120 phút [6]

Năm 2013, Sidram A Nevade đã tổng hợp và thử tác dụng chống viêm, giảm đau của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol có công thức cấu tạo chung sau (xem hình 1.9) Tất cả các hợp chất này đều có tác dụng chống viêm, giảm đau [23]

Hình 1.9 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của Sidram A Nevade

1.2.5 Các tác dụng khác của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol

Ngoài ra, trong nhiều năm gần đây, còn có rất nhiều các nghiên cứu cho tác dụng đa dạng khác của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol, như tác dụng chống virus [18], gây ngủ, chống giảm oxy huyết, ức chế men COX [19], giảm lipid máu và xơ vữa động mạch [7], ức chế Cytocrom P450 [13]…

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT KHUNG

2-MERCAPTOBENZIMIDAZOL

1.3.1 Phản ứng đóng vòng tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol (2MBI)

Năm 1950, J A VanAllan và B D Deacon đã nghiên cứu tổng hợp 2-

mercaptobenzimidazol (2MBI) từ o-phenylendiamin và kali ethylxantat trong dung

môi ethanol:

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp khung 2-mercaptobenzimidazol của Allan và Deacon 1

Phản ứng cho hiệu suất khoảng 84-86,5%, kali ethylxantat có thể được thay bằng hỗn hợp kali hydroxyd và carbon disulfid với hiệu suất đạt được tương đương Sản phẩm được kết tinh lại trong ethanol 95% thu được khoảng 90% sản phẩm với nhiệt độ nóng chảy không đổi [24]

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp khung 2-mercaptobenzimidazol của Allan và Deacon 2

Năm 1995, M L Wang cũng đã nghiên cứu tổng hợp khung

2-mercaptobenzimidazol bằng phản ứng giữa carbon disulfid và o-phenylendiamin

với xúc tác amin bậc 3 trong ethanol hoặc methanol và nước [27] Phản ứng xảy ra theo từng bước như sau:

Hình 1.12 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol theo M L Wang năm

1995

Năm 2007, M.L Wang cũng đã nghiên cứu tổng hợp khung

2-mercaptobenzimidazol bằng phản ứng giữa carbon disulfid và o-phenylendiamin

với xúc tác tetrabutylammonium hydroxid (QOH với Q: (C4H9)4N) hoặc

tetrabutylammonium bromide và kali hydroxyd, dung môi N,N- dimethylformamid,

dimethyl sulfoxid, tetrahydrofuran, acetonitril, methanol và ethanol [26]

Hình 1.13 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol theo M L Wang năm

2007

Khung 2-mercaptobenzimidazol cũng có thể tạo ra từ phản ứng giữa

o-phenylendiamin và dẫn chất arylcarbamothiol cyanid trong dung môi DMF/TEA hoặc EtOH/TEA [11] hoặc thu được từ phản ứng đi từ nguyên liệu ban đầu là dẫn

chất arylcarbamothioyl cyanid và o-cloroanilin trong dioxan/TEA [12]

Hình 1.14 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol từ arylcarbamothioyl

cyanid và o-cloroanilin

1.3.2 Tổng hợp dẫn chất S-alkyl hóa khung 2-mercaptobenzimidazol

1.3.2.1 Phản ứng S-alkyl hóa

Phản ứng S-alkyl hóa của 2-mercaptobenzimidazol thường sử dụng tác nhân

alkyl hóa là các alkyl-halogenid [3][9][20][25]:

Hình 1.15 Phản ứng S-alkyl hóa với tác nhân alkyl halogenid của dẫn chất

2-mercaptobenzimidazol

Phản ứng này được xảy ra trong nhiều loại dung môi khác nhau, có thể có

hoặc không có mặt base và chất xúc tác Dung môi có thể là N,N-

dimethylformamid, dimethyl sulfoxid, cloroform, tetrahydrofuran, toluen, aceton hoặc acetonitril, methanol Base sử dụng có thể là natri hydroxyd, kali hydroxyd,

kali carbonat, natri carbonat, các base hữu cơ như pyridin, triethylamin, diisopropylethylamin, N-methyl morpholin…Chất xúc tác bao gồm các ether vòng,

N,N-các muối amoni bậc 4 như tetrabutylamoni clorid, tetrabutyl bromid, tetrabutyl iodid, có thể là các muối halogenid vô cơ như kali iodid [17]…

1.3.2.2 Kết hợp khung 2-mercaptobenzimidazol và phenoxybutyl

Không có nhiều công trình nghiên cứu về kết hợp khung mercaptobenzimidazol và phenoxybutyl Gần đây, nhóm tác giả TS Nguyễn Văn Hải cùng các cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất của 2-mercaptobenzimidazol mang khung phenoxy qua cầu nối 1,4-butylen theo sơ đồ như hình 1.17

2-Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol mang khung phenoxy

Phản ứng được thực hiện trong dung môi aceton ở 40oC trọng 2,5h với xúc

tác là kali carbonat/ kali iodid Hiệu suất tổng hợp chất 2a là 72,44% và chất 2b là

dự kiến tổng hợp một số dẫn chất 2-(phenoxybutylthio)benzimidazol và thử tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất này

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

Để thực hiện khóa luận này chúng tôi đã sử dụng một số hóa chất, dung môi, thiết bị và dụng cụ của Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (xem bảng 2.1, bảng 2.2)

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

1 4-methyl-o-phenylendiamin Merck

4 Acid hydrocloric đặc (37%) Trung Quốc

5 Acid sulfuric đặc (98%) Trung Quốc

6 Carbon disulfid Trung Quốc

7 Dicloromethan Trung Quốc

8 1,4- Dioxan Việt Nam

10 Ethyl acetat Trung Quốc

11 Kali bromid Trung Quốc

12 Kali carbonat Trung Quốc

13 Kali hydroxyd Trung Quốc

14 Kali iodid Trung Quốc

16 Methyl 4-hydroxybenzoat Trung Quốc

24 Tetrahydrofuran Merck

7 Bộ lọc hút chân không Trung Quốc

8 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S Thụy Sỹ

9 Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 250 mL, 1000 mL Đức

13 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sỹ

14 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

15 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500MHz Mỹ

16 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ

17 Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS - Xevo TQ Mỹ

18 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức

19 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc

20 Ống đong 25 mL, 50 mL Trung Quốc

21 Pipet chia vạch 1 mL, 5 mL, 10 mL Đức

22 Sinh hàn hồi lưu Đức

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Tổng hợp 4 dẫn chất 2-[(4-phenoxybutyl)thio]-1H-benzo[d]imidazol theo sơ

đồ như hình 2.1

Điều kiện phản ứng: (1) CS2, KOH, H2O, EtOH, 80OC/3h

(2) K2CO3, KI, aceton, 60OC/4h (3) HCl, 1,4-dioxan, 80OC/5,5h

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp của các chất IV-a, IV-b, V-a, V-b

2 Kiểm tra độ tinh khiết

3 Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

4 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của chất IV-a, IV-b, V-a, V-b

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

 Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp

các chất dự kiến: phản ứng ngưng tụ, S-alkyl hóa, O-alkyl hóa, phản ứng thủy

phân…

 Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel GF254

Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng

 Sử dụng phương pháp chiết, kết tinh, kết tủa, cất để tinh chế sản phẩm

2.3.2 Xác định độ tinh khiết

 Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

 Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel GF254

Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

2.3.3 Xác định cấu trúc

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

 Phổ hồng ngoại (IR)

Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1 Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

 Phổ khối lượng phân tử (MS):

Được ghi phổ khối lượng trên máy LC/MS-Xevo TQ tại phòng phân tích khối phổ của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy LTQ Orbitrap X tại phòng phân tích khối phổ phân giải cao, Khoa Hóa học- Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với chế độ đo ESI

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H - NMR):

Được ghi trên máy Bruker AV-500MHz, tại Viện Hóa Học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AscendTM500, tại Khoa Hóa học-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng dung môi là DMSO

và MeOD với chất chuẩnlà tetramethylsilan

2.3.4 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi và ung thư vú tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp MTT [14,21]

 Thiết bị nghiên cứu

Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) = (OD điều khiển – OD mẫu) / OD điều khiển Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thêm 6,48 g (0,06 mol) o-phenylendiamin, 3,36 g (0,06 mol) kali hydroxyd,

65 mL ethanol tuyệt đối, 11 mL nước cất vào bình cầu 250 mL, sau đó thêm từ từ 3,7 mL (0,06 mol) carbon disulfid vào bình cầu trong 30 phút Tiến hành đun hồi lưu ở 80oC trong 3 giờ

Phản ứng kết thúc, tẩy màu với 0,8 g than hoạt Thêm 65 mL nước nóng (60-

70oC), acid hóa bằng HCl 5M đến pH 6-7 xuất hiện tủa, tiếp tục khuấy 1 giờ Lọc lấy tủa, rửa lại 3 lần bằng nước cất, kết tinh lại trong ethanol 50% Lọc tủa, sấy khô

ở 70- 80oC, thu được chất II-a

Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất II-b Tiến hành:

5-Methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b) được tổng hợp theo quy trình tương tự như tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (II-a), thực hiện với 6,1 g (0,05

mol) 4-methyl-o-phenylendiamin, 2,8 g (0,05 mol) KOH, 3,1 mL (0,05 mol) carbon

disulfid, 54 mL ethanol tuyệt đối, 9 mL nước cất

Thêm vào bình cầu 142 mL acid hydrobromic 48%, tiếp theo nhỏ từ từ 34,5

mL (0,65 mol) acid sulfuric đặc, sau đó thêm 17,2 mL (0,21 mol) tetrahydrofuran

và thêm vào vài viên đá bọt Lắc nhẹ và lắp bình cầu vào bếp bọc với hệ thống sinh hàn thích hợp Tiến hành đun hồi lưu trong 3 giờ

Phản ứng kết thúc, để nguội khối phản ứng Gạn lấy lớp dưới, rửa 2 lần với

70 mL nước cất, tiếp với 70 mL natri carbonat bão hòa, rửa lại với 70 mL nước cất đến pH = 7 Gạn lấy pha hữu cơ, làm khan, lọc loại bỏ chất làm khan, cất ở 198oC, cho vào bình tối màu và đậy nắp kín, bảo quản trong tủ hút

Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ chất rắn Cất quay chân không đến thể tích không đổi để loại dung môi Đổ sang bình chiết 125mL, rửa 3 lần với nước cất, mỗi lần 10 mL Làm khan bằng natri sulfat Lọc loại bỏ chất làm khan Lấy lớp hữu cơ vào bình cầu 25 mL, cất ở 115-117oC để thu hồi 1,4-dibromobutan Kết

tinh trong methanol 60%, sấy chân không đến khô, thu được chất III

hóa nhóm –SH Thêm 0,4 g (1,4 mmol) chất III vào hỗn hợp phản ứng và khuấy ở

40oC trong 4h Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol - 20:1

Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ chất rắn Cất quay chân không đến cắn Hòa tan cắn trong ethyl acetat và rửa với NaOH 10% cho đến hết 2-mercaptobenzimidazol (kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng), tiếp đó rửa lại 3 lần với nước cất cho đến pH = 7 Dịch ethyl acetat cất quay chân không đến cắn Kết tinh lại trong methanol 60% Lọc, sấy khô ở 60-70oC, thu được chất IV-a

Hòa tan 0,25g (0,7 mmol) IV-a trong 20mL 1,4-dioxan vào bình cầu 50mL,

nhỏ từ từ 8 mL (0,4 mol) HCl đặc vào bình phản ứng Đun ở 80oC trong 5,5 giờ

Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O - 9: 2: 2,5

Sau khi phản ứng kết thúc đem cất quay hỗn hợp phản ứng đến cắn Thêm 10 mL nước cất vào cắn, trung hòa đến pH=7 Lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng nước cất Sấy khô ở 60-70oC, thu được chất V-a