2.3.1. Tổng hợp hóa học
Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến: phản ứng ngưng tụ, S-alkyl hóa, O-alkyl hóa, phản ứng thủy phân…..
Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel GF254 Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng.
2.3.2. Xác định độ tinh khiết
Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt.
Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel GF254 Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
2.3.3. Xác định cấu trúc
Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
Phổ hồng ngoại (IR)
Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối lượng phân tử (MS):
Được ghi phổ khối lượng trên máy LC/MS-Xevo TQ tại phòng phân tích khối phổ của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy LTQ Orbitrap X tại phòng phân tích khối phổ phân giải cao, Khoa Hóa học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với chế độ đo ESI.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR):
Được ghi trên máy Bruker AV-500MHz, tại Viện Hóa Học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AscendTM500, tại Khoa Hóa học-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng dung môi là DMSO và MeOD với chất chuẩnlà tetramethylsilan.
2.3.4. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi và ung thư vú tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp MTT [14,21].
Thiết bị nghiên cứu
Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.
Phương pháp thử độc tế bào
Thử độ độc tế bào bằng phương pháp MTT nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
Tiến hành
Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/ml; 32 µg/ml; 8 µg/ml; 2 µg/ml; 0,5 µg/ml. Bổ xung 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200 µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 37oC/ 5% CO2. Sau 3 ngày thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37oC/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) = (OD điều khiển – OD mẫu) / OD điều khiển. Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC
3.1.1. Tổng hợp các chất trung gian
3.1.1.1. Tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (II-a)
Sơ đồ tổng hợp:
Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp chất II-a Tiến hành:
Thêm 6,48 g (0,06 mol) o-phenylendiamin, 3,36 g (0,06 mol) kali hydroxyd, 65 mL ethanol tuyệt đối, 11 mL nước cất vào bình cầu 250 mL, sau đó thêm từ từ 3,7 mL (0,06 mol) carbon disulfid vào bình cầu trong 30 phút. Tiến hành đun hồi lưu ở 80oC trong 3 giờ.
Phản ứng kết thúc, tẩy màu với 0,8 g than hoạt. Thêm 65 mL nước nóng (60- 70oC), acid hóa bằng HCl 5M đến pH 6-7 xuất hiện tủa, tiếp tục khuấy 1 giờ. Lọc lấy tủa, rửa lại 3 lần bằng nước cất, kết tinh lại trong ethanol 50%. Lọc tủa, sấy khô ở 70- 80oC, thu được chất II-a.
Kết quả:
- Cảm quan: tinh thể hình phiến mỏng, màu trắng ngà. - Khối lượng: 7,67 g. - Hiệu suất: 85,22 %. - Rf = 0,38 (hệ dung môi CHCl3 : CH3OH - 9:1). - Tonc = 301oC – 304oC. 3.1.1.2. Tổng hợp 5-methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b) Sơ đồ tổng hợp:
Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất II-b Tiến hành:
5-Methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b) được tổng hợp theo quy trình tương tự như tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (II-a), thực hiện với 6,1 g (0,05 mol) 4-methyl-o-phenylendiamin, 2,8 g (0,05 mol) KOH, 3,1 mL (0,05 mol) carbon disulfid, 54 mL ethanol tuyệt đối, 9 mL nước cất.
Kết quả:
- Cảm quan: Tinh thể hình phiến, màu trắng hơi nâu. - Khối lượng: m = 6,97 g. - Hiệu suất: 85%. - Rf = 0,34 (hệ dung môi CHCl3: CH3OH - 9:1). - To nc = 291oC – 293oC. 3.1.1.3. Tổng hợp 1,4-dibromobutan Sơ đồ tổng hợp:
Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp 1,4-dibrombutan
Tiến hành:
Thêm vào bình cầu 142 mL acid hydrobromic 48%, tiếp theo nhỏ từ từ 34,5 mL (0,65 mol) acid sulfuric đặc, sau đó thêm 17,2 mL (0,21 mol) tetrahydrofuran và thêm vào vài viên đá bọt. Lắc nhẹ và lắp bình cầu vào bếp bọc với hệ thống sinh hàn thích hợp. Tiến hành đun hồi lưu trong 3 giờ.
Phản ứng kết thúc, để nguội khối phản ứng. Gạn lấy lớp dưới, rửa 2 lần với 70 mL nước cất, tiếp với 70 mL natri carbonat bão hòa, rửa lại với 70 mL nước cất đến pH = 7. Gạn lấy pha hữu cơ, làm khan, lọc loại bỏ chất làm khan, cất ở 198oC, cho vào bình tối màu và đậy nắp kín, bảo quản trong tủ hút.
Kết quả:
- Cảm quan: Dạng lỏng, trong suốt, hơi vàng. - Thể tích: 11 mL (19,89 g).
- Hiệu suất: 43,42 %.
3.1.1.4. Tổng hợp methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat (III)
Sơ đồ tổng hợp:
Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất III Tiến hành:
Thêm 0,38 g (2,5 mmol) methyl 4-hydroxybenzoat và 3,46 g (25,07 mmol) kali carbonat cho vào bình cầu 2 cổ 100 mL. Thêm tiếp vào bình cầu 15 mL acetonitril, khuấy cho tan hết methyl 4-hydroxybenzoat. Cho 6 mL 1,4- dibromobutan (50,85 mmol) và 15 mL acetonitril vào bình nhỏ giọt, vừa nhỏ từ từ vừa khuấy hỗn hợp phản ứng ở 60oC trong 2h, tiếp tục khuấy ở 60oC thêm 2h. Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi cloroform: methanol - 30:1.
Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ chất rắn. Cất quay chân không đến thể tích không đổi để loại dung môi. Đổ sang bình chiết 125mL, rửa 3 lần với nước cất, mỗi lần 10 mL. Làm khan bằng natri sulfat. Lọc loại bỏ chất làm khan. Lấy lớp hữu cơ vào bình cầu 25 mL, cất ở 115-117oC để thu hồi 1,4-dibromobutan. Kết tinh trong methanol 60%, sấy chân không đến khô, thu được chất III.
Kết quả: - Cảm quan: bột màu trắng. - Khối lượng: m= 0,62 g. - Hiệu suất: 86,41 %. - Rf = 0,79 (hệ dung môi CHCl3: CH3OH - 30:1). - Tonc = 42oC – 43oC.
3.1.2. Tổng hợp các chất IV-a, IV-b, V-a, V-b
3.1.2.1. Tổng hợp 2-[(4-(4-methoxycarbonyl)phenoxybutyl)thio]-1H-benzo[d]imidazol (IV-a) benzo[d]imidazol (IV-a)
Sơ đồ tổng hợp:
Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất IV-a
Tiến hành:
Thêm 0,42 g (2,8 mmol) 2-mercaptobenzimidazol, 6,96 g (8,4 mmol) kali carbonat và 0,46 g (1,4 mmol) kali iodid vào bình cầu 2 cổ 100 mL. Tiếp tục thêm vào bình cầu 30 mL aceton, khuấy với sinh hàn hồi lưu ở 40oC trong 1 giờ để hoạt hóa nhóm –SH. Thêm 0,4 g (1,4 mmol) chất III vào hỗn hợp phản ứng và khuấy ở 40oC trong 4h. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol - 20:1.
Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ chất rắn. Cất quay chân không đến cắn. Hòa tan cắn trong ethyl acetat và rửa với NaOH 10% cho đến hết 2- mercaptobenzimidazol (kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng), tiếp đó rửa lại 3 lần với nước cất cho đến pH = 7. Dịch ethyl acetat cất quay chân không đến cắn. Kết tinh lại trong methanol 60%. Lọc, sấy khô ở 60-70oC, thu được chất IV-a.
Kết quả:
- Cảm quan: bột màu trắng ngà. - Khối lượng: m= 0,42 g.
- Hiệu suất: 84,26 %.
- Rf = 0, 72 ( hệ dung môi CH2Cl2: MeOH - 20: 1). - To
nc = 125oC – 128oC.
3.1.2.2. Tổng hợp 5-methyl-2-[(4-(4-methoxycarbonyl)phenoxybutyl)thio]-1H- benzo[d]imidazol (IV-b)
Sơ đồ tổng hợp:
Hình 3.6 Sơ đồ tổng hợp chất IV-b Tiến hành:
5-methyl-2-[(4-carbonylmethoxyphenoxy)butylthio]-1H-benzo[d]imidazol (IV-b) được tổng hợp theo quy trình tương tự như tổng hợp chất IV-a, thực hiện với 0,41 g (2,5 mmol) 5-methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b), 6,96 g (8,4 mmol) kali carbonat, 0,41 g (2,5 mmol) kali iodid và 0,35 g (1,2 mmol) chất III. Phản ứng kết thúc sau 4 giờ.
Kết quả:
- Cảm quan: bột màu trắng ngà. - Khối lượng: m= 0,39 g.
- Hiệu suất: 86,43 %.
- Rf = 0,72 (hệ dung môi CH2Cl2: MeOH - 20: 1) - Tonc = 166,6oC- 168oC.
3.1.2.3. Tổng hợp 2-[(4-(4-carbonylhydroxy)phenoxybutyl)thio]-1H- benzo[d]imidazol (V-a)
Sơ đồ tổng hợp:
Hình 3.7 Sơ đồ tổng hợp các chất V-a Tiến hành:
Hòa tan 0,25g (0,7 mmol) IV-a trong 20mL 1,4-dioxan vào bình cầu 50mL, nhỏ từ từ 8 mL (0,4 mol) HCl đặc vào bình phản ứng. Đun ở 80oC trong 5,5 giờ. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O - 9: 2: 2,5.
Sau khi phản ứng kết thúc đem cất quay hỗn hợp phản ứng đến cắn. Thêm 10 mL nước cất vào cắn, trung hòa đến pH=7. Lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần bằng nước cất. Sấy khô ở 60-70oC, thu được chất V-a.
Kết quả:
- Cảm quan: bột màu trắng. - Khối lượng: m= 0,21g. - Hiệu suất: 87,72%
- Rf = 0,88 (hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O - 9: 2: 2,5) - Tonc = 199,7oC - 200,7oC.
3.1.2.4. Tổng hợp 5-methyl-2-[(4-(4-carbonylhydroxy)phenoxybutyl)thio]-1H- benzo[d]imidazol (V-b).
Hình 3.8 Sơ đồ tổng hợp chất V-b Tiến hành:
V-b được tổng hợp theo quy trình tương tự như tổng hợp chất V-a, thực hiện với 0,26 g (0,7 mmol) IV-b, 20 mL 1,4-dioxan, 8 mL (0,4 mol) HCl đặc. Phản ứng kết thúc sau 5,5h.
Kết quả:
- Cảm quan: bột màu trắng xám. - Khối lượng: 0,22 g.
- Hiệu suất: 88,28 %.
- Rf = 0,86 (hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O - 9: 2: 2,5). - To
Như vậy, 4 dẫn chất 2-[(4-phenoxybutyl)thio]-1H-benzo[d]imidazol: IV-a,
IV-b, V-a, V-b đã được tổng hợp. Sau đây là bảng tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học:
Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học
Chất CTPT Cảm quan Hiệu suất
IV-a C19H20N2O3S Bột màu trắng 84,26%
IV-b C20H22N2O3S Bột màu trắng ngà 86,43%
V-a C18H18N2O3S Bột màu trắng xám 87,72%
V-b C19H20N2O3S Bột màu trắng xám 88,28%
3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT
Các chất sau khi được tổng hợp, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và đo nhiệt độ nóng chảy.
SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm với dung môi hòa tan ethanol hay methanol, hệ dung môi khai triển: CH2Cl2: MeOH (20: 1), CHCl3: MeOH (9: 1), n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5), soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để quan sát vết sắc ký.
Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt: 4 chất sau khi tinh chế đều có dạng chất rắn, được sấy khô và đo nhiệt độ nóng chảy để xác định khoảng nhiệt độ nóng chảy của từng chất.
Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to
nc) của các chất được tóm tắt trong bảng 3.2:
Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các chất
Chất tonc (oC ) Rf Hệ dung môi khai triển II-a 301oC-304oC 0,38 CHCl3: MeOH = 9:1
II-b 291oC-293oC 0,34 CHCl3: MeOH = 9:1
III 42oC-43oC 0,79 CHCl3: MeOH = 30:1
Nhận xét: Với hệ dung môi triển khai, các chất tổng hợp được cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ, giá trị Rf của sản phẩm và nguyên liệu khác biệt trên bản sắc ký và nhiệt độ nóng chảy của các chất có khoảng dao động tương đối hẹp (1- 3°C). Như vậy, có thể kết luận sơ bộ là các chất tổng hợp được khá tinh khiết.
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC DẪN CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC
Để xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được, tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
3.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
Thông qua việc phân tích phổ IR của các chất tổng hợp, nhận biết được các dải hấp phụ đặc trưng của dao động hóa trị (ν), dao động biến dạng (δ) của các nhóm chức và các liên kết điển hình có trong cấu trúc phân tử của chúng như C=C thơm, C-O, C=Oester, C-Hthơm …Ngoài ra với các nhóm thế khác nhau, mỗi chất lại có những pic đặc trưng riêng. Từ đó xác định được bộ khung của phân tử. Phổ đồ của các chất được trình bày ở các phụ lục 1- 10. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) của 4 chất IV-a, IV-b, V-a được ghi trong bảng 3.3.
IV-b 166,6oC-168oC 0,71 CH2Cl2: MeOH = 20: 1
V-a 199,7oC-200,7oC 0,88 n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5
Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) của các chất
Chất Công thức cấu tạo Nhóm
chức νmax (cm-1) Phụ lục IV-a N-H 3200 1 C-Hthơm 3081 C-Hno 2940 C=Oester 1708 C=Cthơm 1604;1514 C-O 1271 IV-b N-H 3100 7 C-Hthơm 3034 C-Hno 2946; 2875 C=Oester 1685 C=Cthơm 1606, 1508 C-O 1261 V-a C-Hno 2954 10 N+-H 2786 C=O 1712 C=Cthơm 1600; 1509 C-O 1252
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ IR phù hợp với cấu trúc dự kiến của các chất.
3.3.2. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)
Kết quả phân tích phổ MS của các chất IV-a, IV-b, V-a, V-b được ghi lại trong bảng 3.4:
Bảng 3.4 Kết quả phổ MS của các chất
Chất Công thức cấu tạo, CTPT
Khối lượng (M) m/z Phụ lục IV-a 356,44 357,0: [M+H]+; 355,0: [M-H]- 2,3 IV-b 370,47 369,0: [M-H]- 9 V-a 342,41 343,2: [M+H]+ 11
V-b 356,44 404,9: [M+MeOH+H2O-H]-; 441,0: [M+MeOH+3H2O- H]- 13
Nhận xét: - Kết quả phân tích phổ khối lượng cho thấy các chất tổng hợp được đều có các pic phân tử và có giá trị phổ khối lượng phù hợp với khối lượng phân tử của các chất dự kiến.
3.3.3. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất IV-a, IV-b, V-a, V-b được ghi lại trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Công thức cấu tạo, ký hiệu chất 1H-NMR Phụ
lục 1H-NMR(500 MHz, MeOD), δ (ppm): 1,94 (4H, m, C-CH2- CH2-C); 3,35 (2H, t, J= 7,0 Mz, -S-CH2-); 3,88 (3H, s, O-CH3); 4,09 (2H, t, J= 6,0 Hz, -O-CH2-); 6,94 (2H, dd, J1= 2,0 Hz, J2= 7,0 Hz, H-2’, H-6’); 7,20 (2H, m, H-5, H-6); 7,47 (2H, dd, J1= 3,0 Hz, J2= 6,0 Hz, H-4, H-7); 4,5,6
7,93 (2H, dd, J1= 2,0 Hz, J2= 7,0 Hz, H-3’, H-5’) 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 1,86 (4H, m, C-CH2- CH2-C); 2,36 (3H, s, C-CH3); 3,33 (2H, t, S-CH2); 3,80 (3H, s, -O-CH3-); 4,08 (2H, t, -O-CH2-); 6,91 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-6); 7,01 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-2’, H-6’); 7,23 (2H, m, H-4, H-7); 7,88 (2H, d, J= 9,0 Hz, H-3’, H-5’); 12,36 (1H, s, N-H) 8 1H-NMR(500 MHz, MeOD), δ (ppm): 1,96 (4H, m, C-CH2- CH2-C); 3,36 (2H, t, J= 7,0 Hz, -S-CH2-); 4,09 (2H, t, J= 6,0 Hz, -O-CH2-); 6,93 (2H, dd, J1= 2,0 Hz, J2= 7,0 Hz, H-2’, H-6’); 7,20 (2H, m, H-5, H-6);