Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất 1 (oxadiazolyl)methyl benzimidazol

ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người càng trở nên phức ạp và nhu cầu chăm sóc cũng ngày càng tăng lên. Chính vì thế việc nghiên cứu tìm ra các thuốc mới đóng vai trò quan trọng trong chiến lược bảo vệ sức khỏe con người của mỗi quốc gia. Tuy nhiên sự ra đời của thuốc mới là cả một quá trình thử nghiệm lâu dài. Đó là kết quả nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, trong đó tổng hợp hóa dược đóng vai trò quan trọng. Được hình thành và phát triển trên cơ sở của ổng hợp hữu cơ, tổng hợp hóa dược đã trở thành một ngành khoa học riêng biệt , nhằm tạo ra các thuốc phục vụ cho việc phòng và điều trị bệnh. Ngày nay, những huốc có nguồn gốc tổng họp hóa dược chiếm một số lượng rất lớn và không thể hiếu trong cuộc sống. Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính và có thể ứng dụng trong điều trị và lâm sàng, các nhà tổng hợp hóa dược thường dựa vào cấu trúc của các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tổng hợp hoặc bán tổng hợp tạo ra nhiều thuốc mới. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được các dẫn chất 1Hbenzodimidazol là nhóm hợp chất dị vòng có tác dụng sinh học đa dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm, diệt virus, chống ung thư, chống lao, chống co giật… Các dẫn chất benzimidazol được gắn thêm các dị vòng thơm khác như: oxadiazol, triazolo,… sẽ làm tăng cường các tác dụng sinh học, tác dụng thường được quan tâm đến là tác dụng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM CƯỜNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT

1-[(OXADIAZOLYL)METHYL]-BENZIMIDAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM CƯỜNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 1-[(OXADIAZOLYL)METHYL]-

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo, PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, , TS Nguyễn Văn Hải, những người đã tận tình hướng dẫn

em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn Ths Phạm Thị Hiền ,Ths Nguyễn Văn Giang, Ths Đào Nguyệt Sương Huyền và CN Phan Tiến Thành đã nhiệt tình giúp đỡ và

tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong quá trình học tập tại trường, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai

Trong quá trình thực hiện khóa luận em đã nhận được sự giúp đỡ của các cán

bộ Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học – Viện Công nghệ Sinh học của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ môn Vi Sinh - Sinh học - Trường Đại học Dược Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô trong trường, thư viện trường

Em cũng muốn gửi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn trong nhóm làm khóa luận ở bộ môn Công nghiệp Dược đã giúp đỡ và cho em những lời khuyên bổ ích về chuyên môn trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất cả bạn bè, và đặc biệt là cha mẹ và anh trai, những người luôn kịp thời động viên và giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong cuộc sống

Sinh viên

Nguyễn Kim Cường

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về tác dụng sinh học của benzimidazol _ 2

1.1.1 Kháng khuẩn 2

1.1.2 Kháng virus 4

1.1.3 Chống ung thư 6

1.1.4 Chống kí sinh trùng 8

1.1.5 Các hoạt động chống viêm và giảm đau 9

1.2 Tác dụng của dẫn chất mang cả khung benzimidazol và oxadiazol _ 11 1.2.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư 11

1.2.2 Tác dụng kháng khuẩn 13

1.3 Các phản ứng tổng hợp các dẫn chất _ 15 1.3.1 Phản ứng tạo vòng 1,3,4-oxadiazol 15

1.3.2 Phản ứng tạo vòng benzimidazol 15

1.3.3 Phản ứng S-alkyl hóa 17

1.4 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh cho đề tài 17 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu và thiết bị _ 18 2.1.1 Hóa chất và dung môi 18

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ đã sử dụng trong thực nghiệm 19

2.2 Nội dung nghiên cứu _ 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 22

2.3.2 Xác định cấu trúc 22 2.3.3 Thử tác dụng sinh học 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Tổng hợp hóa học _ 25

3.1.1 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (I) 26 3.1.2 Tổng hợp ethyl 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (II) 26 3.1.3 Tổng hợp 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (III) 27

N-(2,4-dichlorophenyl)-5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 34 3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được _ 35 3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 36 3.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) 37 3.3.3 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 38 3.4 Thử tác dụng sinh học 38 3.5 Bàn luận _ 39 3.5.1 Về tổng hợp hóa học và xác định cấu trúc các hợp chất 39 3.5.2 Về cấu trúc của các hợp chất trung gian và sản phẩm 41 3.5.3 Về tác dụng sinh học 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 DANH MỤC TÀI LIỆU _ 45

PHỤ LỤC 49

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H nuclear magnetic

resonance) HepG2 Dòng tế bào ung thư gan

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration)

MS Phổ khối (Mass spectrometry)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất 18

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị, dụng cụ 19

Bảng 2.3 Công thức các chất dự kiến tổng hợp được 21

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học 34

Bảng 3.2 Rf và t0 nc của 7 chất tổng hợp được 35

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của IVa, IVb, IVc 36

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của IVa, IVb, IVc 37

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H của IVa, IVb, IVc 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức các chất theo nghiên cứu của Kazimierczuk và cộng sự 2

Hình 1.2 Công thức các chất theo nghiên cứu của Ansari và Lal 3

Hình 1.3 Công thức các chất theo nghiên cứu của Gupta và Rani 3

Hình 1.4 Công thức các chất theo nghiên cứu của Ghoneim và cộng sự 4

Hình 1.5 Công thức các chất theo nghiên cứu của Pandey và Shukla 4

Hình 1.6 Công thức các chất theo nghiên cứu của Yadav và Pal 5

Hình 1.7 Công thức các chất theo nghiên cứu của Kristina và cộng sự 5

Hình 1.8 Công thức các chất theo nghiên cứu của Bishnoi và cộng sự 6

Hình 1.9 Công thức các chất theo nghiên cứu của Hranjec và cộng sự 6

Hình 1.10 Công thức theo nghiên cứu của Gellis và cộng sự 7

Hình 1.11 Công thức các chất theo nghiên cứu của Sondhi và cộng sự 8

Hình 1.12 Công thức các chất theo nghiên cứu của Mavrova và cộng sự 9

Hình 1.13 Công thức các chất theo nghiên cứu của Taha 10

Hình 1.14 Công thức các chất theo nghiên cứu của Mohan và cộng sự 10

Hình 1.15 Công thức các chất theo nghiên cứu của Gaba và cộng sự 11

Hình 1.16 Công thức 1 số chất theo nghiên cứu Mohammad Shaharyar và cộng sự 13

Hình 1.17 Công thức các chất theo nghiên cứu của Ansari và Lal 13

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ tổng hợp theo nghiên cứu của Gomez và cộng sự 9

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ tổng hợp theo nghiên cứu Asif Husain và cộng sự 12

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các chất theo nghiên cứu Salahuddin và cộng sự 14

Sơ đồ 1.4 phản ứng tạo vòng oxadiazol theo Shelly Gapil và cộng sự 15

Sơ đồ 1.5 Phản ứng tạo vòng oxadiazol theo Salahuddin và cộng sự 15

Sơ đồ 1.6 o-phenylendiamin ngưng tụ với acid carboxylic thơm 16

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp 2-alkyl và 2-arylbenzimidazol theo phương pháp vi sóng 16

Sơ đồ 1.8 Sơ đồ tổng hợp acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic 16

Sơ đồ 1.9 Phản ứng S-akyl hóa 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-thiol 17

Sơ đồ 3.1 Các giai đoạn tổng hợp các dẫn chất 25

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (I) 26

Sơ đồ 3.3 Tổng hợp ethyl 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (II) 26

Sơ đồ 3.4 Tổng hợp 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (III) 27

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-methyl 28

-1H-benzo[d]imdazol (IV) 28

Sơ đồ 3.6 Tổng hợp 2-((5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)thio)acetamid (IVa) 29

Sơ đồ 3.7 Tổng hợp methyl 4-(4-((5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)thio)butoxy)benzoat (IVb) 30

Sơ đồ 3.8 Tổng hợp methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat 30

Sơ đồ 3.9 Tổng hợp N-(2,4-dichlorophenyl)-5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amin (IVc) 32

Sơ đồ 3.10 Tổng hợp 2-cloro-N-(2,4-diclorophenyl)acetamid 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người càng trở nên phức

tạp và nhu cầu chăm sóc cũng ngày càng tăng lên Chính vì thế việc nghiên cứu tìm

ra các thuốc mới đóng vai trò quan trọng trong chiến lược bảo vệ sức khỏe con

người của mỗi quốc gia Tuy nhiên sự ra đời của thuốc mới là cả một quá trình thử

nghiệm lâu dài Đó là kết quả nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, trong đó tổng

hợp hóa dược đóng vai trò quan trọng Được hình thành và phát triển trên cơ sở của

tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hóa dược đã trở thành một ngành khoa học riêng biệt ,

nhằm tạo ra các thuốc phục vụ cho việc phòng và điều trị bệnh Ngày nay, những

thuốc có nguồn gốc tổng họp hóa dược chiếm một số lượng rất lớn và không thể

thiếu trong cuộc sống

Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính và có thể ứng

dụng trong điều trị và lâm sàng, các nhà tổng hợp hóa dược thường dựa vào cấu trúc

của các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tổng hợp hoặc bán tổng hợp tạo ra

nhiều thuốc mới

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol là

nhóm hợp chất dị vòng có tác dụng sinh học đa dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm,

diệt virus, chống ung thư, chống lao, chống co giật…

Các dẫn chất benzimidazol được gắn thêm các dị vòng thơm khác như:

oxadiazol, triazolo,… sẽ làm tăng cường các tác dụng sinh học, tác dụng thường

được quan tâm đến là tác dụng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư

Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học

một số dẫn chất của 1-[(oxadiazolyl)methyl]-benzimidazol” với các nội dung:

1 Tổng hợp một số dẫn chất 1-[(oxadiazolyl)methyl]-benzimidazol với các

nhóm thế khác nhau tại vị trí số 2 trên vòng 1,3,4-oxadiazol

2 Thử tác dụng gây độc tế bào của một số dẫn chất tổng hợp được

benzimidazol (1), chất thứ hai dựa trên vòng 5,6-dinitrobenzimidazol (2) và đã

chứng minh được hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất trên chống lại các chủng

khuẩn bệnh viện Stenotrophomonas malthophilia [20]

Hình 1.1 Công thức các chất theo nghiên cứu của Kazimierczuk và cộng sự

Sau đó, Ansari và Lal (2009) đã tổng hợp được azetidin-2-on (3) và đánh giá

về hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans, Aspergillus niger và Aspergillus flavus Các hợp chất thử nghiệm

có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram dương Các nhóm thân dầu của phân tử đóng vai trò thiết yếu trong việc tạo ra hiệu quả kháng khuẩn [7, 8 ]

Hình 1.2 Công thức các chất theo nghiên cứu của Ansari và Lal

Gupta và Rani (1977) tổng hợp 2-thiohalogenonitrophenylbenzimidazol bằng cách ngưng tụ halogenonitrobenzen và muối natri của 2-mercaptobenzimidazol IV,

thử nghiệm về hoạt tính kháng nấm chống lại Helmithosporium sativum, A niger và Fusarium oxysporum bằng phương pháp bào tử nảy mầm và đã ghi nhận được sự ức

chế của các bào tử ở mức 10 ppm [16]

Hình 1.3 Công thức các chất theo nghiên cứu của Gupta và Rani

Ghoneim và cộng sự (1998) tổng hợp các dẫn xuất của 2-[(4-aminophenyl)

sulphonyl] (5) của benzimidazol và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chống lại E coli

bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [14]

Hình 1.4 Công thức các chất theo nghiên cứu của Ghoneim và cộng sự

Tất cả các dẫn xuất 4-amino và 2,4-diaminophenylsulphonyl đều cho thấy hoạt tính kháng khuẩn

1.1.2 Kháng virus

Pandey và Shukla (1999) đã tổng hợp được các dẫn chất

7-(arylamidoalkyl)-3,4-diphenyl-isoquinolinyl-[1,5-c]-benzimidazol (6) và được đánh giá in vivo chống

lại virus cúm (IV) bằng cách cấy nó trong trứng của 1 con gà mái có phôi 10 ngày tuổi ở nồng độ 0,5 mg mỗi phôi trong khoang niệu Sau 48 h cho thấy rằng dẫn chất isoquinonyl benzimidazol với nhóm nicotinamid cho thấy tác dụng tối đa [24]

Hình 1.5 Công thức các chất theo nghiên cứu của Pandey và Shukla

Yadav và Pal (1996) đã tổng hợp được một số chất của benzimidazol như công thức dưới và thử nghiệm về hoạt tính kháng virus [33]

Hình 1.6 Công thức các chất theo nghiên cứu của Yadav và Pal

Kristina và cộng sự (2007) đã tổng hợp dược một nhóm dẫn chất

2-R1-5-amidino-benzimidazol (11) dẫn xuất mang amidino ở C-5 của vòng benzimidazol

bằng cách sử dụng các nhân dị vòng khác nhau tại C-2 và được đánh giá về hoạt

tính kháng virus đối với virus coxsackie và virus echo Tác dụng chông virus đã

quan sát thấy ở các hợp chất có vòng pyridin tại C-2 [21]

Hình 1.7 Công thức các chất theo nghiên cứu của Kristina và cộng sự

Bishnoi và cộng sự (1978) đã tổng hợp được

10-(α-p-benzimidazolyl-1-aminobenzyl)phenothiazin (12) và đã thể hiện được hoạt tính kháng virus đối với

JEV và HSV-1 [9]

Hình 1.8 Công thức các chất theo nghiên cứu của Bishnoi và cộng sự

1.1.3 Chống ung thư

Hranjec và cộng sự (2011) đã tổng hợp được một loạt các dẫn xuất

benzimidazol với base Schiff (13) bằng phản ứng của aldehyde thơm với

2-aminobenzimidazol tương ứng Các base Schiff tổng hợp đã được thử nghiệm với

hoạt tính kháng sinh invitro và cho thấy hoạt tính kháng sinh không đặc hiệu trên

các dòng tế bào thử nghiệm ở nồng độ cao nhất đã đo [18]

Hình 1.9 Công thức các chất theo nghiên cứu của Hranjec và cộng sự

Gellis và cộng sự (2008) đã tổng hợp được benzimidazol-4,7-dion thế ở vị trí-2

đã được tổng hợp thông qua một phản ứng vi sóng sử dụng

2-cloromethyl-1,5,6-trimethyl-1H-benzimidazol-4,7-dion Hoạt tính chống ung thư của nó đã được đánh

giá về ung thư đại tràng, ung thư vú và ung thư phổi Trong số này 2,2'-bis

(cloromethyl)-1,1'-dimethyl-5,5'-bi(1H-benzimidazol)-4,4',7,7'-tetraon (14) đã được

chứng tỏ là có tác dụng tuyệt vời chống ung thư tương đương với mitomycin C [13]

Hình 1.10 Công thức theo nghiên cứu của Gellis và cộng sự

Sondhi và cộng sự (2010) đã tổng hợp được nhiều dẫn xuất benzimidazol dị

vòng (15-18) bằng cách ngưng tụ của acid succinic, acid homophthalic và acid

2,3-pyrazinedicarboxlic với diamin thế khác nhau dưới chiếu xạ vi sóng Tất cả các hợp chất đã thể hiện được hoạt động chống ung thư tốt ở liều 50 mg/kg chống lại ung thư buồng trứng (IGR-OV-1), ung thư vú (MCF-7) và ung thư thần kinh trung ương (SF-295) ở người [30]

Hình 1.11 Công thức các chất theo nghiên cứu của Sondhi và cộng sự

1.1.4 Chống kí sinh trùng

Mavrova và cộng sự (2010) đã tổng hợp được một số 4(3H)-on chứa benzimidazol-2-yl-thioethyl và benzimidazol-2-yl-methanthioethyl ở

thien-[2,3-d]-pyrimidin-vị trí thứ hai của vòng pyrimidin để xác định hoạt tính chống kí sinh trùng Các dẫn

chất benzimidazol của thieno-[2,3-d]-pyrimidin-4(3H)-on (19) đã cho thấy hoạt tính

invitro chống lại Trichinella spiralis cao hơn so với albendazol Các hợp chất hoạt tính cao nhất gồm 2-[2-(5-nitro-1H-benzimidazol-1-yl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydro-[1]-

benzothieno-[2,3-d]-pyrimidin-4(3H) (20) cho thấy hoạt động 95% với liều 5

mg/kg.Các hợp chất tetrahydro-[1]-benzothieno-[2,3-d]-pyrimidin-4(3H)-on hoạt động ở mức 90% [22]

2-{2-[(5(6)-nitro-1H-benzimidazol-2-yl)thio]ethyl}-5,6,7,8-Hình 1.12 Công thức các chất theo nghiên cứu của Mavrova và cộng sự

Gomez và cộng sự (2008) đã tổng hợp được loạt chất mới lai hóa từ

benzimidazol và pentamidin (21) và mỗi hợp chất đã được thử nghiệm invitro

chống kí sinh trùng Trichomonas vaginalis, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Leishmania mexicana, và Plasmodium berghei Các hợp chất thử

nghiệm được so sánh với pentamidin và metronidazol [15]

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ tổng hợp theo nghiên cứu của Gomez và cộng sự

1.1.5 Các hoạt động chống viêm và giảm đau

Taha (2005) đã tổng hợp được một số đường imino của methylbenzimidazol

(22) và hoạt động chống viêm của các hợp chất đã được nghiên cứu bằng cách sử

dụng các u hạt bông pellet xét nghiệm sinh học ở chuột bằng chất chuẩn là indomethacin Giá trị % ức chế các u hạt đã được xác định cho từng hợp chất [31]

Hình 1.13 Công thức các chất theo nghiên cứu của Taha

Mohan và cộng sự (1984) đã tổng hợp được hợp chất (23) để thử nghiệm hoạt

tính kháng viêm chống phù nề do carrageenan [23]

Hình 1.14 Công thức các chất theo nghiên cứu của Mohan và cộng sự

Gaba và cộng sự (2010) đã tổng hợp được một loạt các chất mới

5-R-1-(phenylsulphonyl)-2-methylbenzimidazol (24) Các hợp chất được đánh giá hoạt

động chống viêm và giảm đau cũng như hiệu ứng ulcerogenic dạ dày bằng phương pháp sử dụng mô hình giảm phù chân chuột sử dụng indomethacin làm chất chuẩn đối chiếu [12]

Hình 1.15 Công thức các chất theo nghiên cứu của Gaba và cộng sự

1.2 Tác dụng của dẫn chất mang cả khung benzimidazol và oxadiazol

Nghiên cứu các hoạt chất mới trong điều trị ung thư đang là một nhiệm vụ quan trọng của hóa dược Ung thư là một bệnh của chu kỳ tế bào, trong đó các tế bào bất thường nguyên phân một cách không có kiểm soát Rất nhiều các hợp chất

dị vòng và dị vòng ngưng tụ đã được xác định thông qua sinh học phân tử, sàng lọc thực nghiệm và phát triển thuốc hợp lý để tìm ra các hoạt chất mới gây độc tế bào ung thư Bên cạnh các dị vòng benzimidazol với tác dụng sinh học đa dạng thì các lớp dị vòng như: oxadiazol và triazolo – thiadiazol cũng thu hút được sự quan tâm trong hóa dược vì có một loạt các hoạt chất mang các dị vòng này có tác dụng kháng khuẩn và chống khối u [17, 29]

1.2.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2012, Asif Husain và các cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất

benzimidazol mang khung oxadiazol (25-36) Các dẫn chất này được tổng hợp từ

4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-4-oxobutanhydrazid với mục đích tổng hợp các chất chống ung thư Các chất tổng hợp được nghiên cứu in vitro tác dụng gây độc tế bào

ung thư trên tất cả 60 dòng tế bào của người Kết quả cho thấy tác dụng trên tế bào

ung thư là đáng kể Đặc biệt trong đó có chât 34 ức chế sự tăng trưởng đáng kể và

vẫn thể hiện tác dụng khi pha loãng ở 5 nồng độ khác nhau (0,01; 0,1; 1; 10 và 100 µM) với các giá trị GI50 từ 0,49 đến 48,0 µM,đặc biệt (34) cho kết quả tốt trên các

tế bào ung thư phổi (HOP-92) [19]

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ tổng hợp theo nghiên cứu Asif Husain và cộng sự

Năm 2013, Mohammad Shaharyar và các cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng trên 60 dòng tế bào ung thư của các dẫn chất 2-(naphthalen-1-ylmethyl)naphthalen-2-yloxymethyl)-1-[5-(phenyl)-[1,3,4]-oxadiazol-2-ylmethyl]-

1H-benzimidazol Kết quả, các hợp chất tổng hợp thể hiện tác dụng từ trung bình

đến thấp trên các dòng tế bào thử nghiệm Riêng chất 37 là có hoạt tính tốt nhất

trong các chất, đặc biệt hoạt động ức chế mạnh trên MDA-MB-468 (ung thư vú) và

SK-MEL-28 (khối u ác tính), 2 hợp chất 38, 39 thể hiện tác dụng ức chế ít hơn và

thể hiện tốt trên dòng tế bào NCI-H522 (ung thư phổi không nhỏ) và UO-31(ung thư thận) , các dẫn chất khác thể hiện tác dụng kém hơn [26]

yl}] (40) và được đánh giá hoạt động kháng khuẩn đối với Gram (+) và vi khuẩn

Gram (-) Một số hợp chất tổng hợp cho thấy hoạt động chống lại nấm vừa phải [7, 8]

Hình 1.17 Công thức các chất theo nghiên cứu của Ansari và Lal

Salahuddin và các cộng sự năm 2012 đã tổng hợp benzimidazol bằng cách ngưng tụ o-phenylendiamin với acid phenoxyacetic, sau đó phản ứng với ethyl cloroacetat để được ethyl [2-(phenoxymethyl)-1H-benzimidazol- 1-yl]acetat Sau đó, hydrazin hóa thu được 2-[2-(phenoxymethyl)-1H-benzimidazol-

2-(phenoxymethyl)-1H-1-yl]-acetohydrazid Nhóm hydrazid này được tạo vòng oxadiazol với nhiều acid thơm với xúc tác POCl3 thu được các hợp chất Các hợp chất tổng hợp được thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Kết quả cho thấy, các hợp chất có tác dụng trên

Escherichia coli và có tác dụng trên Staphylococcus aureus Các hợp chất nhạy cảm nhất đối với Candida albicans và Aspergillus flavus [25]

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các chất theo nghiên cứu Salahuddin và cộng sự

1.3 Các phản ứng tổng hợp các dẫn chất

1.3.1 Phản ứng tạo vòng 1,3,4-oxadiazol

Các dẫn chất hydrazin thường được đóng vòng bởi acid xúc tác POCl3 hoặc

CS2 trong môi trường kiềm mạnh để thu được các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol Một số

ví dụ tổng hợp vòng 1,3,4-oxadiazol như sau:

Năm 2011, Shelly Gapil và các cộng sự đã tổng hợp oxadiazol-2-thiol bằng cách cho benzoylhyrazin phản ứng với CS2 (tỷ lệ mol 1:2) trong dung môi ethanol, xúc tác KOH, đun hồi lưu 4h Hiệu suất phản ứng 78 % [28]

5-phenyl-1,3,4-Sơ đồ phản ứng như sau:

Sơ đồ 1.4 phản ứng tạo vòng oxadiazol theo Shelly Gapil và cộng sự

Trong nghiên cứu của Salahuddin và cộng sự, vòng oxadiazol được tạo thành

bằng cách cho 2-[2-(phenoxymethyl)-1H-benzimidazol-1-yl]-acetohydrazid phản

ứng với các acid thơm, xúc tác POCl3, đun hồi lưu, sau phản ứng được cho vào nước lạnh và trung hòa bằng NaHCO3, xuất hiện tủa, lọc tủa thu được sản phẩm Hiệu suất của các phản ứng này từ 58% đến 86% [26]

Sơ đồ 1.5 Phản ứng tạo vòng oxadiazol theo Salahuddin và cộng sự

1.3.2 Phản ứng tạo vòng benzimidazol

Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo vòng benzimidazol Phần lớn tác giả

đi từ nguyên liệu o-phenylendiamin và dẫn chất Sau đây là một số cách tạo vòng benzimidazol từ o-phenylendiamin:

1 Phản ứng với acid

Thông thường, o-phenylendiamin được ngưng tụ với các acid mono

carboxylic, trong điều kiện phản ứng loại nước, sử dụng các acid như acid

polyphosphoric (PPA), acid hydrocloric, acid boric hoặc acid p-toluensulfonic tạo

ra các nhóm thế khác nhau ở vị trí số 2 trên nhân benzimidazol Tuy nhiên việc sử dụng tác nhân yếu hơn đặc biệt là acid Lewis, muối vô cơ, acid vô cơ cải thiện cả hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm [10]

Sơ đồ 1.6 o-phenylendiamin ngưng tụ với acid carboxylic thơm

Từ năm 1995, nhiều dẫn chất benzimidazol đã được tổng hợp theo công nghệ

vi sóng Năm 2007, Dubey và Moorthy đã tổng hợp các chất alkyl và arylbenzimidazol theo phương pháp này Thời gian phản ứng giảm đến phút, hiệu suất tăng 10-50% so với phương pháp trước đây [10]

2-R= H, CH3, C6H5, 4-NH2C6H4, 4-ClC6H4

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp 2-alkyl và 2-arylbenzimidazol theo phương pháp vi sóng

2 Phản ứng với anhydrid acid

Phản ứng của anhydrid acid với o-phenylendiamin sẽ tạo thành benzimidazol hoặc N,N-diacylphenylen diamin phụ thuộc vào điều kiện tiến hành Khi cho o-

phenylendiamin phản ứng với anhydrid của dicarboxylic sẽ thu được dẫn chất acid

của khung bezimidazol Ví dụ o-phenylendiamin đun hồi lưu với anhydrid succinic

trong vài giờ tạo thành acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic [32]

Phản ứng như sau :

Sơ đồ 1.8 Sơ đồ tổng hợp acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic

1.3.3 Phản ứng S-alkyl hóa

Phản ứng S-alkyl hóa thường được tiến hành bằng cách cho các dẫn chất thiol tác dụng với các dẫn chất của halogen và thực hiện trong môi trường khan của dung môi như sau: acetonitril, ethyl acetat, THF, DMF, DMAc, với sự có mặt của xúc tác như: pyridin, triethylamin, K2CO3 khan, Ví dụ, năm 2012 Kai Liu, Xiang

Lu đã thực hiện phản ứng S-akyl hóa 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-thiol bới tác nhân benzylbromid (tỷ lệ mol 1: 1,1) trong EtOH 800, xúc tác KOH Hiệu suất phản ứng 96% Sơ đồ phản ứng như sau:

Sơ đồ 1.9 Phản ứng S-akyl hóa 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-thiol

1.4 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh cho đề tài

Như vậy, thông qua các tài liệu tham khảo được, chúng tôi nhận thấy rằng các dẫn chất 1-[(oxadiazolyl)methyl]-benzimidazol đều có nhiều các tác dụng sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, chống co giật, diệt virus, chống lao…Tiếp nối các nghiên cứu đó, chúng tôi dự kiến tổng hợp các dẫn chất thế của 1-[(oxadiazolyl)methyl]-benzimidazol và thử tác dụng gây độc tế bào của chúng

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Khóa luận đã sử dụng một số hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa Dược – Bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược

Hà Nội

2.1.1 Hóa chất và dung môi

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc

8 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 Thụy Sỹ

17 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500MHz Mỹ

18 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ

19 Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS - Xevo TQ Mỹ

STT Tên dụng cụ, thiết bị Xuất xứ

2.2 Nội dung nghiên cứu

Tổng hợp các chất theo sơ đồ sau :

Bảng 2.3 Công thức các chất dự kiến tổng hợp được

2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (I)

Ethyl benzo[d]imidazol)acetat

(2-methyl-1H-(II)

benzo[d]imidazol-1-

2-(2-methyl-1H-yl)acetohydrazid (III)

benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4-

5-((2-methyl-1H-oxadiazole-2-thiol (IV)

benzo[d]imidazol-1-

yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-(IVb)

N-(2,4-diclorophenyl)-5- benzo[d]imidazol-1-

((2-methyl-1H-

yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amin (IVc)

Kiểm tra độ tinh khiết của 6 chất I, II, II, IV, IVa, IVb, IVc bằng SKLM và

đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc các chất IVa, IVb, IVc tổng hợp được

bằng phổ hồng ngoại IR, phổ khối lượng MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

1H-NMR

Thử tác dụng chống ung thư với chất IVa, IVb, IVc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học, dựa trên các phản ứng:

1 Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol

2 Phản ứng thế N1 tạo ester ethyl (2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat

3 Phản ứng hydrazid hóa ethyl (2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat

4 Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol

5 Phản ứng halogen hóa tạo cloroacetylclorid

6 Phản ứng acyl hóa amin thơm

7 Phản ứng mở vòng tetrahydrofuran

8 Phản ứng O alkyl hóa methyl 4-hydroxybenzoat

9 Phản ứng S-alkyl hóa benzo[d]imidazol

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl-1H-Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi tiến triển của phản ứng, hiện màu bằng đèn

Tại phòng phân tích cấu trúc phân tử Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, các chất IVa, IVb, IVc đã được ghi phổ hồng ngoại

(IR) trên máy với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong vùng 4000-400 cm-1[1, 3]

 Phổ khối lượng (MS)

Tại phòng phân tích khối phổ của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam các chất IVa, IVb, IVc được ghi phổ khối lượng trên máy

LC/MS-Xevo TQ với chế độ đo ESI [4]

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR)

Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz, tại Viện Hóa Học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng dung môi là DMSO [2]

2.3.3 Thử tác dụng sinh học

2.3.3.1 Thiết bị nghiên cứu

Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.3.3.2 Các dòng tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB

(Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng

trong các phép thử độ độc tế bào; Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi và MCF-7 (Human breast

carcinoma) - ung thư vú

2.3.3.3 Phương pháp thử độc tế bào

Thử độ độc tế bào bằng phương pháp MTT nhằm sàng lọc, phát hiện các

chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần

thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/mL; 32 µg/mL; 8 µg/mL; 2 µg/mL; 0,5 µg/mL Bổ xung 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI

1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU Giếng điều khiển có 200 µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/mL Ủ ở 37oC/ 5% CO2 Sau 3 ngày thêm 50 µl MTT (1mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh)

và ủ tiếp ở 37oC/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả

ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) = (OD điều khiển – OD mẫu) / OD điều khiển Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tổng hợp hóa học

Thông qua các tài liệu tham khảo và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl-

1H-benzo[d]imidazol theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1 Các giai đoạn tổng hợp các dẫn chất

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-1H-benzo[d]imidazol

Điều kiện phản ứng: a) acid acetic, HCl đặc, 45 phút; b) Ethyl cloroacetat, aceton

khan, K2CO3, 15h; c) hydazin hydrat, EtOH, 90 0 C, 4h; d) CS2, EtOH, 90 0 C, 5h; e) 2-iodoacetamid, aceton, K2CO3, 60 0 C, 2h; f) HBr, H2SO4, t 0 C, 3h; g)4- hydroxybenzoat, K2CO3, AcCN, 60 0 C, 2h ; h)aceton, K2CO3, KI, 50 0 C, 4h; i) SOCl2, 4h ;k) 2,4-dichoroanilin; l) DMF,K2CO3, KI, 100 0 C, 24h