Bảng 2.3. Công thức các chất dự kiến tổng hợp được. Công thức Danh pháp 2-methyl-1H- benzo[d]imidazol (I) Ethyl (2-methyl-1H- benzo[d]imidazol)acetat (II) 2-(2-methyl-1H- benzo[d]imidazol-1- yl)acetohydrazid (III) 5-((2-methyl-1H- benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)-1,3,4- oxadiazole-2-thiol (IV) 2-((5-((2-methyl-1H- benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol- 2-yl)thio)acetamid (IVa) Methyl 4-(4-((5-((2-methyl- 1H-benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol- 2-yl)thio)butoxy)benzoat (IVb) N-(2,4-diclorophenyl)-5- ((2-methyl-1H- benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol- 2-amin (IVc)
Kiểm tra độ tinh khiết của 6 chất I, II, II, IV, IVa, IVb, IVc bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc các chất IVa, IVb, IVc tổng hợp được bằng phổ hồng ngoại IR, phổ khối lượng MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
1H-NMR.
Thử tác dụng chống ung thư với chất IVa, IVb, IVc. 2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết
Sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học, dựa trên các phản ứng:
1.Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol. 2.Phản ứng thế N1 tạo ester ethyl (2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat. 3.Phản ứng hydrazid hóa ethyl (2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat. 4.Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-
2-methyl-1H-benzo[d]imidazol.
5.Phản ứng halogen hóa tạo cloroacetylclorid. 6. Phản ứng acyl hóa amin thơm.
7. Phản ứng mở vòng tetrahydrofuran.
8.Phản ứng O alkyl hóa methyl 4-hydroxybenzoat.
9.Phản ứng S-alkyl hóa 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl-1H- benzo[d]imidazol.
Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi tiến triển của phản ứng, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM. Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt.
2.3.2 Xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
Tại phòng phân tích cấu trúc phân tử Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các chất IVa, IVb, IVc đã được ghi phổ hồng ngoại (IR) trên máy với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong vùng 4000-400 cm-1[1, 3].
Phổ khối lượng (MS)
Tại phòng phân tích khối phổ của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam các chất IVa, IVb, IVc được ghi phổ khối lượng trên máy LC/MS-Xevo TQ với chế độ đo ESI [4].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR)
Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz, tại Viện Hóa Học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng dung môi là DMSO [2].
2.3.3 Thử tác dụng sinh học 2.3.3.1 Thiết bị nghiên cứu
Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.
2.3.3.2 Các dòng tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB
(Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào; Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi và MCF-7 (Human breast
carcinoma) - ung thư vú
2.3.3.3 Phương pháp thử độc tế bào
Thử độ độc tế bào bằng phương pháp MTT nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần
thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/mL; 32 µg/mL; 8 µg/mL; 2 µg/mL; 0,5 µg/mL. Bổ xung 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU. Giếng điều khiển có 200 µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/mL. Ủ ở 37oC/ 5% CO2. Sau 3 ngày thêm 50 µl MTT (1mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37oC/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) = (OD điều khiển – OD mẫu) / OD điều khiển. Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Tổng hợp hóa học.
Thông qua các tài liệu tham khảo và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl- 1H-benzo[d]imidazol theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.1 Các giai đoạn tổng hợp các dẫn chất
1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-1H-benzo[d]imidazol.
Điều kiện phản ứng: a) acid acetic, HCl đặc, 45 phút; b) Ethyl cloroacetat, aceton khan, K2CO3, 15h; c) hydazin hydrat, EtOH, 900C, 4h; d) CS2, EtOH, 900C, 5h; e) 2-iodoacetamid, aceton, K2CO3, 600C, 2h; f) HBr, H2SO4, t0C, 3h; g)4- hydroxybenzoat, K2CO3, AcCN, 600C, 2h ; h)aceton, K2CO3, KI,500C, 4h; i) SOCl2, 4h ;k) 2,4-dichoroanilin; l) DMF,K2CO3, KI, 1000C, 24h
3.1.1 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (I)
Sơ đồ phản ứng: (sơ đồ 3.2)
Sơ đồ 3.2 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (I) Tiến hành:
Thêm 5,4g (0,05mol) o-phenylendiamin, 8,5mL dung dịch HCl đặc và
8,5mL (0,09mol) acid acetic băng vào bình cầu 100mL. Lắp sinh hàn và đun hồi lưu hỗn hợp trên trong 45 phút ở 1400C, kết hợp khuấy từ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động ethylacetat: n-hexan= 7:3, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được đổ từ từ vào cốc có mỏ có chứa 50mL nước đá. Sau đó, điều chỉnh về pH =7-8 bằng dung dịch ammoniac đặc trong điều kiện 0-100C, kết hợp khuấy từ. Để lạnh hỗn hợp trong vòng 30 phút sẽ thu được tủa. Lọc thu lấy tủa, sấy ở nhiệt độ 60-700C, rồi kết tinh lại trong cồn 10%. Lọc qua phễu Buchner, rửa tinh thể 3 lần với 10mL nước cất, hút kiệt và sấy khô thu sản phẩm.
Kết quả:
- Khối lượng: 4,63g (Hiệu suất 70,2%). - Cảm quan: tinh thể hình kim màu trắng. - Rf = 0,32 (ethylacetat: n-hexan = 7:3). - T0nc = 177-1790C.
3.1.2 Tổng hợp ethyl 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (II)
Sơ đồ phản ứng (sơ đồ 3.3)
Tiến hành:
Hòa tan hỗn hợp gồm 4,0g (0,03mol) 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (I) và 20mL aceton khan trong bình cầu 100mL. Thêm tiếp 4,0g K2CO3 khan, cuối cùng thêm từ từ 3,2mL ethyl cloroactic (d= 1,1450g/mL) vào hỗn hợp trên. Lắp dụng cụ làm khan có gắn CaO, sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12h. Sau đó, đun hồi lưu hỗn hợp trên trong vòng 3h.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động cloroform-methanol= 9:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp phản ứng được lọc loại bỏ muối vô cơ, cất quay đến kiệt. Cắn thu được hòa tan trong cồn tuyệt đối, tẩy màu bằng than hoạt. Sau đó dịch lọc được cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm, kết tinh lại trong nước. Lọc tủa rồi rửa bằng nước cất 3 lần với 10mL, hút kiệt và sấy ở nhiệt độ 600-700C thu sản phẩm rắn.
Kết quả:
- Khối lượng: 4,20g (Hiệu suất 60,9%)
- Cảm quan: tinh thể màu trắng - Rf = 0,72 (CHCl3: MeOH= 9: 1) - T0
nc = 108-1100C
3.1.3 Tổng hợp 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (III)
Sơ đồ phản ứng (sơ đồ 3.4)
Sơ đồ 3.4 Tổng hợp 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (III) Tiến hành:
Hòa tan hỗn hợp gồm: 4,01g (0,018mol) ethyl-2-(2-methyl-1H- benzo[d]imidazol)acetat (II) và 20mL EtOH tuyệt đối trong bình cầu 100mL. Thêm tiếp 20mL (0,33mol) hydrazin monohydrat 80%. Lắp sinh hàn, khuấy từ và đun hồi lưu trong 4h.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O = 9:2:2,5, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được làm lạnh trong vòng 30 phút, xuất hiện sản phẩm tủa màu trắng, lọc qua phễu Bucher và rửa tủa 2 lần với 10mL nước lạnh. Sấy ở nhiệt độ 60-700C thu sản phẩm.
Kết quả:
- Khối lượng: 2,77g (Hiệu suất 74%) - Cảm quan: chất rắn màu trắng - Rf = 0,52 (n-BuOH: AcOH: H2O = 9:2:2,5) - T0 nc = 160-1620C 3.1.4 Tổng hợp 5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4- oxadiazole-2-thiol (IV) Sơ đồ phản ứng (sơ đồ 3.5) Sơ đồ 3.5. Tổng hợp 5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4- oxadiazole-2-thiol (IV) Tiến hành:
Thêm 2,10g (9,76mmol) 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)acetohydrazid (III), 10mL EtOH tuyệt đối và 1,09g (19,5mmol) KOH vào trong bình cầu 100mL. Thêm tiếp 3mL H2O, sau cùng nhỏ từ từ 0,61mL (9,76mmol) CS2
vào hỗn hợp phản ứng. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 5giờ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động n-butanol: methanol: nước = 10:1:3, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh hỗn hợp và trung hòa về pH= 5-6 bằng dung dịch acid hydrocloric 1M, tiếp tục khuấy trong vòng 1h, xuất hiện tủa trắng. Lọc thu tủa qua phễu Buchner, kết tinh lại trong EtOH.
Kết quả:
- Khối lượng: 2,04g (Hiệu suất 80,1%) - Cảm quan: chất rắn màu trắng, nhẹ - T0 nc = 148-1520C - Rf = 0,74 (n-BuOH: MeOH: H2O = 10:1:3) 3.1.5 Tổng hợp 2-((5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4- oxadiazol-2-yl)thio)acetamid (IVa) Sơ đồ phản ứng (sơ đồ 3.6) Sơ đồ 3.6 Tổng hợp 2-((5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-1,3,4- oxadiazol-2-yl)thio)acetamid (IVa) Tiến hành:
Thêm 0,2g (0,77mmol) 5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)- 1,3,4-oxadiazole-2-thiol (IV); 0,5g K2CO3 và 10mL aceton khan vào trong bình cầu 100mL. Khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ thường trong vòng 1 giờ. Sau đó, thêm 0,14g (0,77mmol) 2-iodoacetamid vào hỗn hợp trên. Lắp sinh hàn và đun hồi lưu trong 2h (sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng).
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O =9: 2: 2,5, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ muối vô cơ, tẩy màu bằng than hoạt, cô bớt aceton rồi thêm 15mL H2O nước, xuất hiện tủa. Lọc tủa qua phễu Buchner, sấy ở nhiệt độ 60-700C. Chất rắn IVa được kết tinh lại trong EtOH.
Kết quả:
- Khối lượng: 0,16g (Hiệu suất 70%) - Cảm quan: chất rắn màu trắng
- Tc0
nc = 136-1380C
3.1.6. Tổng hợp methyl 4-(4-((5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)- 1,3,4-oxadiazol-2-yl)thio)butoxy)benzoat (IVb)
Sơ đồ phản ứng (sơ đồ 3.7)
Sơ đồ 3.7. Tổng hợp methyl 4-(4-((5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)- 1,3,4-oxadiazol-2-yl)thio)butoxy)benzoat (IVb)
Tiến hành:
Điều chế tác nhân methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat (VII)
Sơ đồ 3.8 Tổng hợp methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat
Tổng hợp 1,4-dibrombutan (VI)
Thêm vào bình cầu 142 mL acid hydrobromic 48%, tiếp theo nhỏ từ từ 34,5 mL (0,65 mol) acid sulfuric đặc, sau đó thêm 17,2 mL (0,21 mol) tetrahydrofuran (V) và thêm vào vài viên đá bọt. Lắc nhẹ và lắp bình cầu vào bếp bọc với hệ thống sinh hàn thích hợp. Tiến hành đun hồi lưu trong 3 giờ.
Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội khối phản ứng và đổ sang bình chiết 250 mL. Gạn lấy lớp dưới vào cốc có mỏ, rửa 2 lần với 70 mL nước cất, tiếp với 70 mL natri carbonat bão hòa, rửa lại với 70 mL nước cất đến pH = 7. Gạn lấy pha hữu cơ vào bình nón 50 mL, làm khan bằng Na2SO4, cất
ở 198oC, cho vào bình tối màu và đậy nắp kín, bảo quản trong tủ hút.
Kết quả:
- Cảm quan sản phẩm: Dạng lỏng, trong suốt, hơi vàng. - Thể tích: 11 mL (19,89 g).
- Hiệu suất: 43,42 %.
Tổng hợp methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat (VII)
Thêm 0,38 g (2,5 mmol) methyl 4-hydroxybenzoat và 3,46 g (25,07 mmol) kali carbonat cho vào bình cầu 2 cổ 100 mL. Thêm tiếp vào bình cầu 15 mL acetonitril, khuấy cho tan hết methyl 4-hydroxybenzoat. Cho 6 mL 1,4- dibromobutan (50,85 mmol) (VI) và 15 mL acetonitril vào bình nhỏ giọt, vừa nhỏ từ từ vừa khuấy hỗn hợp phản ứng ở 60oC trong 2h, tiếp tục khuấy ở 60oC thêm 2h. Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi cloroform: methanol = 30:1.
Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ chất rắn. Cất quay chân không đến thể tích không đổi để loại dung môi. Đổ sang bình chiết 125mL, rửa 3 lần với nước cất, mỗi lần 10mL. Làm khan bằng Na2SO4. Lọc loại bỏ chất làm khan. Lấy lớp hữu cơ vào bình cầu 25 mL, cất ở 115-117oC. Kết tinh trong methanol 60%, sấy chân không đến khô, thu được chất .
Kết quả: - Cảm quan sản phẩm: bột màu trắng. - Khối lượng: m= 0,62 g. - Hiệu suất: 86,41 %. - Rf = 0,79 (hệ dung môi CHCl3: CH3OH = 30:1). - To nc = 42oC – 43oC.
Tổng hợp methyl 4-(4-((5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)- 1,3,4-oxadiazol-2-yl)thio)butoxy)benzoat (IVb)
Thêm 0,2g (0,77mmol) 5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)- 1,3,4-oxadiazole-2-thiol (IV); 0,5g K2CO3; 0,125g KI và 10mL aceton khan vào
trong bình cầu 100mL. Khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ thường trong vòng 1 giờ. Sau đó, thêm 0.2g (0,77mmol) methyl 4-(4-bromobutoxy)benzoat (VII) vào hỗn hợp trên. Lắp sinh hàn và đun hồi lưu trong 2h (sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng). Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động cloroform: methanol = 9:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ muối vô cơ, tẩy màu bằng than hoạt, cô bớt aceton rồi thêm 15mL H2O nước, xuất hiện tủa. Lọc tủa qua phễu Buchner, sấy ở nhiệt độ 60-700C. Chất rắn IVb được kết tinh lại trong EtOH.
Kết quả:
- Khối lượng: 0,25g (Hiệu suất 72%) - Cảm quan: chất rắn màu trắng - Rf = 0,48 (cloroform: methanol = 9:1) - Tc0 nc = 112-1140C 3.1.7 Tổng hợp N-(2,4-dichlorophenyl)-5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amin (IVc) Sơ đồ phản ứng (sơ đồ 3.9) Sơ đồ 3.9 Tổng hợp N-(2,4-dichlorophenyl)-5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amin (IVc)
Tiến hành:
Điều chế tác nhân 2-cloro-N-(2,4-diclorophenyl)acetamid (X)
Sơ đồ phản ứng (sơ đồ 3.10)
Sơ đồ 3.10. Tổng hợp 2-cloro-N-(2,4-diclorophenyl)acetamid
Điều chế cloroacetylclorid (IX)
Dùng bình cầu 100mL. Thêm vào bình cầu 10,0g (0,11 mol) acid cloroacetic (VIII), tiếp theo nhỏ 10,37 mL SOCl2 (0,11 mol). Hồi lưu trong 4 giờ, sục nitơ trong 1 giờ đầu phản ứng. Kết thúc phản ứng tiến hành cất lấy phân đoạn 100- 1080C. Sản phẩm là chất lỏng không màu.
Điều chế 2-cloro-N-(2,4-diclorophenyl)acetamid (X)
Hòa tan trong bình cầu 100mL hỗn hợp 0,5g (3mmol) 2,4-dicloroanillin và 3mL acid acetic. Thêm từ từ 0,37mL cloroacetylclorid (IX) khuấy liên tục ở 400C trong vòng 1h.
Sau khi kết thúc phản ứng đổ dung dịch phản ứng vào 20mL dung dịch NaHCO3 bão hòa, làm lạnh thấy xuất hiện kết tủa. Lọc thu lấy tủa, rửa 2 lần với nước. Sấy khô. Sản phẩm là chất rắn màu trắng.
Tổng hợp N-(2,4-dichlorophenyl)-5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amin(IVc)
Thêm 0,2g (0,77mmol) 5-((2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)- 1,3,4-oxadiazole-2-thiol (IV); 0,5g K2CO3; 0,125g KI và 10mL DMF khan vào trong bình cầu 100mL. Khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ thường trong vòng 1 giờ. Sau đó, thêm từ từ 0,19g (0,77mmol) 2-cloro-N-(2,4-diclorophenyl)acetamid (X) vào hỗn hợp trên. Lắp sinh hàn và đun hồi lưu trong 24h ở nhiệt độ 1000C
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O =9: 2: 2,5, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Sau khi phản ứng kết thúc, bình phản ứng được để nguội,đổ vào cốc có mỏ chứa 15mL nước lạnh, khuấy 2h, xuất hiện tủa. Lọc tủa qua phễu Buchner, sấy ở nhiệt độ 60-700C. Chất rắn IVc được kết tinh lại trong EtOH.
Kết quả:
- Khối lượng: 0,24g (Hiệu suất 71%) - Cảm quan: chất rắn màu nâu
- Rf = 0,48 (n-BuOH: AcOH: H2O =9: 2: 2,5) - Tc0
nc = 186-1870C
Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp hóa học
Stt Chất Cảm quan Hiệu suất
1 I Tinh thể hình kim màu trắng 70,2%
2 II Tinh thể màu trắng 60,9%
3 III Chất rắn màu trắng 74%
4 IV Chất rắn màu trắng, nhẹ 80,1%
5 IVa Chất rắn màu trắng 70%
6 IVb Chất rắn màu trắng 72%
7 IVc Chất rắn màu nâu đỏ 71%
3.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng sắc kí lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy như sau:
+ TLC được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel GF254 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
- Dung môi hòa tan: EtOH 960, aceton.
- Hệ dung môi: n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5); cloroform: methanol (9: 1);