BÙI THỊ PHƢƠNG MAI TỔNG hợp và THỬ tác DỤNG một số HOẠT TÍNH SINH học dẫn CHẤT GLUTARAT của CURCUMIN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - BÙI THỊ PHƢƠNG MAI TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC DẪN CHẤT GLUTARAT CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - BÙI THỊ PHƢƠNG MAI MÃ SINH VIÊN: 1401392 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC DẪN CHẤT GLUTARAT CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hải NCS Phạm Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI-2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải NCS-ThS.Phạm Thị Hiền, người thầyđã trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt, bảo cho tơi kiến thức, kinh nghiệm u u v tạ i điều iện gi đ suốt quãng thời gian thực khóa luận Tơi xin chân thành Văn Giang nhiệt t nh gi ơn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện vàTS Nguyễn đ , động viên khích lệ v tạ điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệ n Tơi xin chân thành gi ơn Ban Giám hiệu Nh trường toàn thể thầy cô Trường Đại h c Dược Hà Nội tạ điều kiện tốt cho suốt trình h c tập trường Trong trình thực khóa luận tơi nhận gi thuộc Viện Công nghệ sinh h c, Viện H n lâ đ cán Kh a h c v Công nghệ Việt Na , c n ộ h a Hóa – trường Đại h c Kh a h c tự nhiên, xin chân thành ơn Cuối cùng, xin gửi lời ơn đến gia đ nh người bạn Nguyễn Tấn Thành, Lường Thị Trang, Nguyễn Văn Na … gi đ , chia sẻ, động viên, khích lệ tơi sống h c tập! Do thời gian làm thực nghiệ iến thức thân hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn è để khóa luận hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 05 nă 2019 Sinh viên Bùi Thị Phƣơng Mai MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH 10 ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan curcumin 1.1.1 Cấu trúc hóa h c 1.1.2 Tính chất l hóa v độ ổn định 1.2 Hoạt tính sinh học curcumin dẫn chất 1.2.1 Hoạt tính chống viêm 1.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa 10 1.2.3 Tác dụng hòng v điều trị ung thư 12 1.2.4 Các hoạt tính sinh h c khác 14 1.3 Lựa chọn hƣớng nghiên cứu dẫn chất curcumin 15 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên liệu – Hóa chất 19 2.2 Dụng cụ – Thiết bị 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Tổng hợp hóa h c 21 2.4.2 Kiể tra độ tinh khiết 21 X c định cấu trúc hóa h c 22 2.4.4 Thử hoạt tính sinh h c 22 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 29 3.1 Tổng hợp hóa học 29 3.1.1 Tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (M-1) 29 3.1.2 Tổng hợp ester glutarat mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (M-2) 32 3.2 Xác định cấu trúc 36 3.2.1 Kết phân tích phổ mono-O-(2-Hydroxyethyl)-curcumin (M-1) 36 3.2.2 Kết phân tích phổ (Curcumin-O-yl)ethyl hemiglutarat (M-2) 39 3.3 Thử hoạt tính sinh học 42 3.3.1 Thử hoạt tính chống ung thư 42 3.3.2 Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH 43 3.3.3 Thử hoạt tính ức chế NO 43 3.4 Bàn luận 44 3.4.1 Về tổng hợp hóa h c 44 3.4.2 Về x c định cấu trúc sản phẩm 48 3.4.3 Về thử hoạt tính sinh h c 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 DANH MỤC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic resonance) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired immunodeficiency syndrome) AMP Adenosine monophosphat AMPK AMP-activated protein kinase AR Tinh khiết phân tích (Analytical reagent) AR Androgen receptor Bcl-2 B-cell lymphoma COX Cyclooxygenase CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DAC Diacetyl curcumin DGC Diglutaryl curcumin DMC Dimethoxycurcumin DMEM Môi trường nuôi cấy Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) DMF Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl DR Điểm thụ thể tự hủy (Death receptors) ĐvC Đơn vị carbon FBS Huyết bào thai bò(Fetal bovine serum) ER Estrogen receptor G Gam H Giờ Hela Ung thư tử cung người (Human cervix carcinoma) HepG2 Ung thư gan người(Human hepatocellular carcinoma) HIV Virus gây suy giảm miễn dịch người ( Human immunodeficiency virus) HPLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử( Inhibition concentration at 50% ) IR Phổ hồng ngoại ( Infrared spectroscopy) M-1 mono-O-(2-Hydroxyethyl)-curcumin M-2 (Curcumin –O-yl)ethyl hemiglutarat JAK/STAT Janus kinase/signal transducer and activator of transcription K562 Ung thư bạch cầu cấp người (human myelogenous leukemia) MAPK mitogen-activated protein kinases MCF7 Ung thư vú người(Human breast carcinoma) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) PANC-1 Tế bào ung thư tuyến tụy người PC-3 Tế bào ung thư tuyến tiền liệt người RAW 264.7 Dòng đại thực bào chuột 264.7 Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) ROS Gốc tự oxy hóa (Reactive Oxygen Species) SC50 Nồng độ trung hòa 50% gốc tự do(Scavenging concentration at 50%) SKBR-3 Tế bào ung thư vú người SKLM Sắc ký lớp mỏng SOD Chất chống oxy hóa phân giải dây chuyền( Superoxide dismutase) STAT3 Signal transducer and activator of transcription T°nc Nhiệt độ nóng chảy THF Tetrahydrofuran TNF Yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) XO Xanthine oxydase DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu - hóa chất 19 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ - thiết bị 20 Bảng 3.1.Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi đến phản ứng tạo M-1 30 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ aceton:DMF đến phản ứng tạo M-1 31 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến phản ứng tạo M-1 31 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ 2-bromoethanol:curcumin 32 Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi đến phản ứng tạo M-2 34 Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi đến phản ứng tạo M-2 35 Bảng 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian đến phản ứng tạo M-2 35 Bảng 3.8 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ M-1:anhydryd glutaric 36 Bảng 3.9.Kết phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, CH3OH) M-1 36 Bảng 3.10 Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) M-1 37 Bảng 3.11 Kết phân tích phổ 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) M-1 37 Bảng 3.12 Kết phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) M-1 38 Bảng 3.13 Kết phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, CH3OH) M-2 39 Bảng 3.14 Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) M-2 40 Bảng 3.15 Kết phân tích phổ 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) M-2 40 Bảng 3.16 Kết phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) M-2 41 Bảng 3.17.Kết thử nghiệm gây độc tế bào Hela K562 43 Bảng 3.18 Kết thử nghiệm gây độc tế bào HepG2 MCF7 43 Bảng 3.19 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa 43 Bảng 3.20 Khả ức chế sản sinh NO lên dòng tế bào RAW 264.7 44 Bảng 3.21 Tác động mẫu nghiên cứu đến sống sót tế bào RAW 264.7 44 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo curcumin Hình 1.2.Dạng hỗ biến ceton - enol curcumin dung dịch Hình 1.3.Phản ứng imin hóa β-diceton curcumin Hình 1.4.Phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin Hình 1.5 Phản ứng curcumin với gốc tự Hình 1.6 Các dạng tồn curcumin theo pH dung dịch Hình 1.7 Các sản phẩm phân hủy curcumin tác dụng pH Hình 1.8 Các sản phẩm phân hủy curcumin tác dụng ánh sáng Hình 1.9.Một số dẫn chất curcumin thể hoạt tính chống viêm tốt 10 Hình 1.10 Dẫn chất phosphat curcumin 10 Hình 1.11 Dẫn chất imin hóa curcumin 11 Hình 1.12 Tetrahydrocurcumin 12 Hình 1.13 Dẫn chất lai hóa amino acid curcumin 13 Hình 1.14 Dẫn chất curcumin có hoạt tính chống ung thư tuyến tiền liệt tốt 14 Hình 1.15 Dấn chất curcumin có khả kháng khuẩn tốt 15 Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp diester glutarat curcumin 15 Hình 1.17 Sơ đồ tổng hợp ester glutarat curcumin theo S Aggarwal cộng 16 Hình 1.18 [DLys6]-LHRH–curcumin 16 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp ester glutarat mono-O-(2-Hydroxyethyl)-curcumin 21 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp M-1 29 Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng tạo M-2 32 Hình 3.3 Cơ chế phản ứng alkyl hóa curcumin 45 Hình 3.4 Các tạp alkyl hóa sinh trình phản ứng 45 Hình 3.5 Cơ chế phản ứng ester hóa anhdryd glutaric 47 Hình 3.6.Các tạp sinh trình ester hóa 47 Hình 3.7.Dạng hỗ biến enol-ceton 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nhiều năm qua, nhiều nghiên cứu curcumin- phenolic chiết xuất từ củ nghệ dẫn chất thể nhiều hoạt tính sinh học khác nhau.Các hoạt tính sinh học curcumin tìm thấy chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, AIDS, bệnh tim mạch xơ phổi,…[13] Đặc biệt curcumin ức chế cytokine gây viêm ức chế protein đích khác dòng tế bào ung thư - tác dụng sinh học mà hướng tới thử nghiệm cho đề tài này[13] Curcumin chứng minhan toàn sử dụng liều cao (12g/ngày) người[11] Mặc dù curcumin có hoạt tính sinh học đa dạng tính an toàn cao độ tan nước pH acid sinh lý thấp, với độ ổn định kém, nhanh chóng bị chuyển hóa sử dụng theo đường uống dẫn đến sinh khả dụng không cao nên khả ứng dụng lâm sàng curcumin hạn chế[12] Để cải thiện sinh khả dụng curcumin người ta sử dụng phương pháp vật lý phương pháp hóa họcdựa khung curcuminoid có sẵn, tạo dẫn chất giúp cải thiện độ tan, độ ổn định nâng cao hoạt tính sinh học curcumin Gần đây, nhóm nghiên cứu môn Công nghiệp Dược tổng hợp thử tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư tế bào HepG2 dẫn chất mono alkyl hóa curcumin (mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin), hai hoạt tính cho kết quảcao curcumin [3] Nghiên cứu mở nhiều hướng biến đổi cấu trúc tiềm cho curcumin Theo đó, năm 2017, tác giả Nơng Thị Bích Vân tổng hợp thành cơng dẫn chất phosphat (mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin) cho hoạt tính chống viêm hoạt tính chống oxy hóa cao curcumin Mặt khác, nghiên cứu S Aggarwal cộng ester glutarat curcumin tạo dẫn xuất ổn định dung dịch nước dễ dàng bị thủy phân có mặt enzym esterase để giải phóng thuốc vị trí tác dụng.[18] Từ định hướng trên, tiến hành tổng hợp dẫn chất curcumin (mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin) dạng ester glutarat với hi vọng cải thiện độ tan, độ hấp thu curcumin, từ làm tăng hoạt tính sinh học so với chất ban đầu Phụ lục 11.Phổ H1-MNR M-2 Phụ lục 12.Phổ C13-NMR M-2 Phụ lục 13.Phổ C13-NMR M-2 Phụ lục 14.Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư Phụ lục 15.Kết thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa Phụ lục 16.Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxid ... TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - BÙI THỊ PHƢƠNG MAI MÃ SINH VIÊN: 1401392 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC DẪN CHẤT GLUTARAT CỦA CURCUMIN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người... miễn, dị ứng  Một số dẫn chất curcumin cho hoạt tính chống viêm tốt - Năm 1997, A N Nurfinal cộng tổng hợp loạt dẫn chất curcumin số có số dẫn chất thể hoạt tính chống viêm vượt trội curcumin [21]... 1.9 Một số dẫn chất curcumin thể hoạt tính chống viêm tốt - Năm 2017, tác giả Nơng Thị Bích Vân tổng hợp dẫn chất phosphat curcuminvà đánh giá hoạt tính chống viêm thơng qua phép thử ức chế sinh