TRẦN THỊ HUYỀN TRANG xây DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN và VILDAGLIPTIN TRONG VIÊN nén hỗn hợp METFORMIN và VILDAGLIPTIN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HUYỀN TRANG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ VILDAGLIPTIN TRONG VIÊN NÉN HỖN HỢP METFORMIN VÀ VILDAGLIPTIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2021 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HUYỀN TRANG Mã sinh viên: 1601814 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ VILDAGLIPTIN TRONG VIÊN NÉN HỖN HỢP METFORMIN VÀ VILDAGLIPTIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dƣợc, Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Trƣớc trình bày nội dung thuộc đề tài nghiên cứu mình, tơi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến ngƣời đồng hành, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu khoa học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giảng viên hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Thuận – giảng viên Bộ mơn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Cơ khơng nhiệt tình dạy bảo, động viên mà cố gắng tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu môn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dƣợc, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội ln giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn chân thành cho gia đình, bạn bè ủng hộ động viên suốt năm tháng học tập nghiên cứu mái trƣờng Đặc biệt, xin cảm ơn bạn Đinh Thị Lý, anh Dƣơng Tiến Anh, em Phạm Thị Thu Trang, em Bùi Văn Sơn, em Nguyễn Bình Minh em Phạm Quỳnh Mai đồng hành, chia sẻ buồn vui giúp đỡ suốt trình nghiên cứu mơn Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2021 Sinh viên Trần Thị Huyền Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Metformin hydroclorid 1.1.1 Cấu tạo hóa học 1.1.2 Tính chất 1.1.3 Cơ chế tác dụng tác dụng dƣợc lý 1.1.4 Dƣợc động học 1.1.5 Chỉ định 1.1.6 Các phƣơng pháp định lƣợng Metformin 1.2 Tổng quan Vildagliptin 1.2.1 Cấu tạo hóa học 1.2.2 Tính chất 1.2.3 Cơ chế tác dụng tính chất vật lý 1.2.4 Dƣợc động học 1.2.5 Chỉ định 1.2.6 Các phƣơng pháp định lƣợng Vildagliptin 1.3 Sự kết hợp Metformin Vildagliptin 1.3.1 Ý nghĩa mặt chế tác dụng dƣợc lý 1.3.2 Chỉ định 10 1.3.3 Các phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Metformin Vildagliptin 10 1.4 Vài nét phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 12 1.4.1 Nguyên tắc kiểu sắc ký lỏng hiệu cao 12 1.4.2 Sắc ký phân bố cặp ion 13 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tƣợng nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung mơi, hóa chất 15 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Xây dựng phƣơng pháp phân tích 16 2.2.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 16 2.2.3 Ứng dụng 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu: 16 2.3.1 Xử lý mẫu 16 2.3.2 Xác định điều kiện sắc ký 17 2.3.3 Thẩm định quy trình phân tích 18 2.3.4 Ứng dụng thực tế: 20 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Khảo sát bƣớc sóng phát hiện: 21 3.2 Khảo sát pha động 22 3.3 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời MET VIL HPLC 26 3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 26 3.3.2 Độ chọn lọc 27 3.3.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 28 3.3.4 Độ 29 3.3.5 Độ xác (độ lặp lại độ xác trung gian) 31 3.4 Ứng dụng thực tế 33 3.5 Bàn luận 34 3.5.1 Khảo sát bƣớc sóng phát 34 3.5.2 Khảo sát pha động tỉ lệ pha động: 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 4.1 Kết luận: 37 4.2 Đề xuất 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril : Hiệp hội nhà phân tích hóa học thức AOAC (Association of Official Analytical Chemists) BP : Dƣợc điển Anh (British Phamacopoeia) C18 : Octadecylsilan DĐVN : Dƣợc điển Việt Nam EP : Dƣợc điển châu Âu (European British Phamacopoeia) : Sắc ký lỏng hiệu cao (High-performance liquid HPLC chromatography) VIL IPA : Tác nhân tạo cặp ion (ion pair agent) JP : Dƣợc điển Nhật (Japanese Pharmacopoeia) MeOH : Methanol MET : Metformin R : Hệ số tƣơng quan RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard deviation) S TB : Diện tích pic tR : Thời gian lƣu t°nc : Nhiệt độ nóng chảy USP : Dƣợc điển Mỹ (United States Pharmacopoeia) UV - VIS : Quang phổ tử ngoại khả kiến : Trung bình : Vildagliptin DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Một số phƣơng pháp định lƣợng Metformin Bảng 1.2 Một số phƣơng pháp định lƣợng Vildagliptin Bảng 1.3 Một số phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Metformin Vildagliptin viên nén 10 Bảng 1.4 Đặc điểm sắc ký pha thuận sắc ký pha đảo 12 Bảng 2.1 Nồng độ điểm chuẩn 19 Bảng 2.2 Nồng độ điểm thực độ 19 Bảng 3.1 Các pha động kháo sát 22 Bảng 3.2 Chƣơng trình chạy gradient pha động 25 Bảng 3.3 Độ phù hợp hệ thống 26 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ tuyến tính 28 Bảng 3.5 Độ thu hồi MET 29 Bảng 3.6 Độ thu hồi VIL 30 Bảng 3.7 Kết độ lặp lại, độ xác trung gian khác ngày 31 Bảng 3.8 Kết độ xác trung gian khác ngƣời phân tích 32 Bảng 3.9 Kết định lƣợng viên nén bao phim Galvus Met 50mg/850 mg 33 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Metformin Hydroclorid Hình 1.2 Công thức cấu tạo Vildagliptin Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại MET 21 Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại VIL 21 Hình 3.3.Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp MET VIL (pha động 1) sắc ký đồ pha động 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ MET (pha động 2) 23 Hình 3.5 Sắc ký đồ VIL (pha động 2) 24 Hình 3.6 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp MET VIL (pha động 3) 24 Hình 3.7 Sắc ký đồ MET (pha động 4) 25 Hình 3.8 Sắc ký đồ VIL (pha động 4) 25 Hình 3.9 Kết độ chọn lọc 27 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính diện tích pic nồng độ MET 28 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính diện tích pic nồng độ VIL 29 Nhận xét: RSD MET VIL ngày, khác ngày ngƣời phân tích, khác ngƣời phân tích thỏa mãn yêu cầu: RSD MET ≤ 1,3%, RSD VIL ≤ 1,9% Kết luận: Phƣơng pháp đạt yêu cầu độ xác theo yêu cầu AOAC 3.4 Ứng dụng thực tế Ứng dụng phƣơng pháp thẩm định để định lƣợng viên nén bao phim Galvus Met chứa 50 mg VIL 850 mg MET công ty Novartis Pharma Services AG Khối lƣợng trung bình viên: 0,9679 g Tiến hành xử lý mẫu chuẩn mẫu thử nhƣ trình bày mục 2.3.1 Kết định lƣợng đƣợc thể Bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết định lượng viên nén bao phim Galvus Met 50mg/850 mg MET Mẫu Lƣợng cân (g) Diện tích pic (mAu.s) 0,8670 5455341 VIL Hàm lƣợng (mg) % hàm Diện tích Hàm lƣợng pic lƣợng so với (mAu.s) (mg) nhãn % hàm lƣợng so với nhãn Chuẩn MET Chuẩn VIL 21976 0,0507 Thử 0,9924 5177239 836,43 98,4 22481 49,75 99,5 Thử 0,9788 5114436 837,77 98,6 22159 49,72 99,4 Thử 0,9968 5227964 840,90 98,9 23067 50,82 101,7 TB % hàm lƣợng so với nhãn (%) 98,6 100,2 Nhận xét: Hàm lƣợng dƣợc chất viên viên: MET từ 98,4% – 98,9 %, VIL từ 99,4% – 101,7% 33 Theo chuyên luận viên nén Metformin DĐVN V, yêu cầu hàm lƣợng MET từ 95,0% -105,0% Do Vildagliptin chƣa có chuyên luận dƣợc điển nên lựa chọn đánh giá theo tiêu chuẩn sở, yêu cầu hàm lƣợng từ 95,0% – 105,0% Kết luận: viên nén bao phim Galvus Met công ty Novartis Pharma Services AG đạt yêu cầu tiêu định lƣợng 3.5 Bàn luận 3.5.1 Khảo sát bước sóng phát MET có khả hấp thụ UV có liên hợp điện tử p – π ( điện tử tự Nito liên kết đơi nhóm CO) Ngƣợc lại Vildagliptin có liên kết bội nhóm CO CN nên khả hấp thụ kém, hấp thụ đƣợc bƣớc sóng có lƣợng cao Vì vậy, để định lƣợng đƣợc Vildagliptin phải ƣu tiên lựa chọn bƣớc sóng ngắn Trong tài liệu tham khảo [22] sử dụng bƣớc sóng 239 nm (là cực đại hấp thụ Metformin) để định lƣợng đồng thời Ta thấy, bƣớc sóng dài để hấp thụ Vildagliptin nên cho đáp ứng với Vildagliptin Tuy nhiên, tiến hành khảo sát bƣớc sóng ngắn (nhỏ 210 nm) mặc đáp ứng Vildagliptin tốt nhƣng nhiễu lớn, gây sai số đáng kể Trong trình khảo sát cho thấy, Metformin cực tiểu hấp thụ 217 nm, bƣớc sóng thích hợp để định lƣợng Vildagliptin Vì vậy, chúng tơi lựa chọn bƣớc sóng 218 nm (cực tiểu hấp thụ MET ± 1nm) để tiến hành định lƣợng đồng thời Metformin Vildagliptin 3.5.2 Khảo sát pha động tỉ lệ pha động: Khi sử dụng đệm phosphat làm pha động gặp phải vấn đề pic MET sớm (do sử dụng sắc ký pha đảo cộng với việc MET dạng muối, phân cực mạnh nên pha tĩnh không lƣu giữ đƣợc MET cột lâu) Để giải vấn đề dùng phƣơng pháp tạo cặp ion để làm giảm bớt tính phân cực MET Chúng tơi sử dụng chất tạo cặp ion với MET Natri 1-heptansulfonat để tăng thời gian lƣu MET Tuy nhiên, sử dụng Natri - heptansulfonat : 34 ACN (90:10) làm pha động thời gian lƣu MET hợp lý nhƣng thời gian lƣu VIL lại dài Do VIL có tính phân cực nên để giảm thời gian lƣu VIL, lựa chọn chƣơng trình gradient với phần trăm đệm giảm dần Khi tránh đƣợc việc phải định lƣợng phƣơng pháp khác nhau, giảm đƣợc thời gian phân tích Đối chiếu với phƣơng pháp phân tích tiêu chuẩn sở nhƣ sau: - Sắc ký pha đảo - Cột C18 (150 x 4,6 mn, 3µm) - Bƣớc sóng phát hiện: 218 nm 210 nm - Nhiệt độ cột: 35°C - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 10 µl - Đệm phosphate KH2PO4 pH 3, thêm g/l ammonium hexaflorophosphat - Dung môi pha mẫu: đệm phosphate – H2O – ACN (400 : 600 : 25) - Kênh A: đệm phosphate – H2O (40 : 60) - Kênh B: đệm phosphate – ACN (40 : 60) - Chƣơng trình gradient: Thời gian Tỷ lệ kênh A (%) Tỷ lệ kênh B (%) 97 97 85 15 75 25 12 25 75 12,1 97 18 97 - Kết quả: thời gian lƣu MET khoảng phút, thời gian lƣu VIL khoảng 11,5 phút 35 Tiêu chuẩn sở định lƣợng định lƣợng đồng thời MET VIL nhƣng bƣớc sóng khác Định lƣợng MET bƣớc sóng 218 nm, định lƣợng VIL bƣớc sóng 210 nm Nguyên tắc phƣơng pháp sắc ký đảo, tạo cặp ion, đó, sử dụng ammonium hexaflorophosphat (tƣơng tự nhƣ Natri 1- heptan sulfonat) có khả tạo tạo cặp với MET Qua thấy, phƣơng pháp chúng tơi tiết kiệm đƣợc thời gian tiến hành phân tích bƣớc sóng pha động chuẩn bị đơn giản 36 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Từ kết thực nghiệm, đạt đƣợc mục tiêu sau: (1a) Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Metformin Vildagliptin viên nén sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) + Xử lý mẫu:  Dung môi pha mẫu: ACN – H2O (1 : 40)  Nồng độ mẫu thử phân tích: MET 85 µg/ml, VIL µg/ml + Điều kiện sắc ký:  Cột C18 (150 x 4,6mm, µm)  Thể tích tiêm: 20 µl  Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút  Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng  Bƣớc sóng phát hiện: 218 nm  Pha động: đệm pH 3,85 (Natri 1-heptansulfonat 0,2 g/l 0,5 g/l NaCl) – ACN, chạy chƣơng trình gradient sau: Thời gian Tỷ lệ đệm (%) Tỷ lệ ACN (%) 90 10 90 10 13 75 25 14 75 25 15 90 10 25 90 10 (1b) Phƣơng pháp xây dựng đƣợc thẩm định: phƣơng pháp xây dựng có độ chọn lọc cao, đƣờng chuẩn từ 42,3 µg/ml – 101,6 µg/ml MET (R2 = 0,9942), từ 2,58 µg/ml - 6,18 µg/ml VIL (R2 = 0,9963); độ tốt (98,0% - 99,0% MET 98,9% - 101,4% VIL), độ xác tốt ( < 1,03% MET < 1,33% VIL) 37 (2) Áp dụng phƣơng pháp thẩm định để định lƣợng viên nén thành phần Metformin Vildagliptin 4.2 Đề xuất Phƣơng pháp định lƣợng đƣợc thẩm định ứng dụng để định lƣợng trình nghiên cứu bào chế viên nén Metformin, Vildagliptin Viện Cơng nghệ Dƣợc phẩm Quốc gia Ngồi ra, cịn đƣợc sử dụng để kiểm tra chất lƣợng thành phẩm cho thành phẩm chứa MET, VIL khác thị trƣờng DĐVN chƣa có chuyên luận định lƣợng đồng thời thành chất 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, tập 1, Nhà xuất Y học Bộ Y Tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.637 Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V tập 1, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2018), Hướng dẫn ASEAN thẩm định quy trình phân lục 1- Thơng tƣ 32/2018/TT-BYT Quy định việc đăng ký lƣu tích, phụ hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc Tiếng Anh Al Omari Mousa, Khader, Yousef, Dauod, Ali Shakir, Beni Yonis, Othman Ahmed, Khassawneh, Adi Harbi Mohammad, (2016), "Vildagliptin efficacy in combination with metformin among Jordanian patients with type diabetes mellitus inadequately controlled with metformin", Journal of drug assessment 5(1), pp 29-33 AOAC (2016), Guidelines for Standard Method Performance Requirements Banik Sujan, Karmakar, Palash, Miah, MD Anowar Hossain, (2015), "Development and validation of a UV-spectrophotometric method for determination of vildagliptin and linagliptin in bulk and pharmaceutical dosage forms", Bangladesh Pharmaceutical Journal 18(2), pp 163-168 Bayer G (2014), Martindale: The Complete Drug Reference, 38, Pharmaceutical Press, UK, pp.506 Boovizhikannan Thangabalan, Palanirajan, Vijayaraj Kumar, (2013), "RP-HPLC determination of vildagliptin in pure and in tablet formulation", Journal of Pharmacy Research 7(1), pp 113-116 10 British Pharmacopoeia Commission (2020), British Pharmacopoeia 11 Gundala Usharani, Bhuvanagiri, Chandra Shekar, Nayakanti, Devanna, (2013), "Simultaneous estimation of vildagliptin and metformin in bulk and pharmaceutical formulations by UV spectrophotometry", American Journal of PharmTech Research 3(1), pp 338-345 12 Halimi S., Schweizer, A., Minic, B., Foley, J., & Dejager, S., (2008), "Combination treatment in the management of type diabetes: focus on vildagliptin and metformin as a single tablet", Vasc Health Risk Management 4(3), pp 481-492 13 Malakar Aparajita, Bokshi, Bishwajit, Nasrin, Dilruba, (2012), "Development and validation of RP-HPLC method for estimation of Vildagliptin from table dosage form", International Journal of Pharmaceutical Life Sciences 1(1) 14 Mathieu C Degrande E (2008), "Vildagliptin: a new oral treatment for type diabetes mellitus", Vasc Health Risk Management 4(6), pp 13491360 15 Moldoveanu SC David V (2013), "Chapter 5—Retention Mechanisms in Different HPLC Types", Essentials in Modern HPLC Separations, pp 145-190 16 Pragati Ranjan Satpathy V Mohan Goud, Bhoga Bhagya, Jvc Sharma N.Shyamala, (2014), "Development and validation of a rp-hplc method for the assay of vildagliptin", World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences 3(2), pp 2303 - 2310 17 Shakoor Abdul, Ahmed, Mahmood, Adnan, Ahmad, Hussain, Riaz, Hussain, Sajad, Rehman, Kiren, Rashid, Ayoub, Mushtaq, Maria, Batool, Sadia, (2019), "Determination of Metformin and Vildagliptin in Solid Dosage Form and Rabbit Plasma by HPLC: An Application to Pharmacokinetic Study", Lat Am J Pharm 38(2), pp 361-7 18 Shirode AR Maduskar PD, Deodhar MS, Kadam VJ, (2014), "RP-HPLC and HPTLC methods for simultaneous estimation of metformin hydrochloride and vildagliptin from bulk and marketed formulation: Development and validation", Journal of Pharmaceutical Research International 4(20), pp 2370-2386 19 Shrikrishna B Baokar, Sugandha, V Mulgund, Nisharani, S Ranpise, (2013), "Development and Validation of RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Vildagliptin and Metformin ", Research Journal of Pharmaceutical 5(2), pp 95-98 20 Ståhlberg J (2000), "CHROMATOGRAPHY: LIQUID| Ion Pair Liquid Chromatography", Encyclopedia of Separation Science, pp 676-684 21 United States Pharmacopeial Convention (2020), USP 43 - NF 38, United States Pharmacopeial Convention 22 W Abu Dayyih M Hamad, E Mallah, A Abu Dayyih, R Awad, Z Zakaria, T Arafat, (2017), "Method development and validation of vildagliptin and metformin hcl in pharmaceutical dosage form by reverse phase–high performance liquid chromatography (RP-HPLC)", International journal of pharmaceutical sciences and research, pp 29652972 23 National Center for Biotechnology Information (2021), PubChem Compound Summary for CID 6918537, Vildagliptin, Retrieved January 01-2021, from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Galvus 24 The electronic medicines compendium (emc) (2020), Eucreas 50 mg/850 mg film-coated tablets, Retrieved January https://www.medicines.org.uk/emc/product/6226/smpc 01-2021, from PHỤ LỤC Sắc ký đồ mẫu đƣờng chuẩn Sắc ký đồ định lƣợng viên nén Galvus Met Phụ lục Sắc ký đồ mẫu đường chuẩn Điểm 1: Điểm 2: Điểm 3: Điểm 4: Điểm 5: Điểm 6: Phụ lục Sắc ký đồ mẫu thử ... HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HUYỀN TRANG Mã sinh viên: 1601814 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ VILDAGLIPTIN TRONG VIÊN NÉN HỖN HỢP METFORMIN VÀ VILDAGLIPTIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Metformin Vildagliptin viên nén hỗn hợp Metformin Vildagliptin? ?? với mục đích: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời Metformin Vildagliptin sắc... chuyên luận định lƣợng Vildagliptin nhƣ định lƣợng đồng thời Metformin Vildagliptin Do vậy, việc xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời chất cần thiết Từ chúng tơi thực đề tài ? ?Xây dựng phƣơng pháp