Phạm việt long so sánh khả năng giải phóng in vitro và sinh khả dụng trên chó thí nghiệm của vi cầu plga la đông khô với vi cầu đối chiếu khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VIỆT LONG SO SÁNH KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG IN VITRO VÀ SINH KHẢ DỤNG TRÊN CHĨ THÍ NGHIỆM CỦA VI CẦU PLGA-LA ĐƠNG KHƠ VỚI VI CẦU ĐỐI CHIẾU KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VIỆT LONG Mà SINH VIÊN: 1801424 SO SÁNH KHẢ NĂNG GIẢI PHĨNG IN VITRO VÀ SINH KHẢ DỤNG TRÊN CHĨ THÍ NGHIỆM CỦA VI CẦU PLGA-LA ĐÔNG KHÔ VỚI VI CẦU ĐỐI CHIẾU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Trần Thị Hải Yến HVCH Nguyễn Thành Lâm Nơi thực hiện: Bộ môn Bào Chế Viện KNTTW HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Trần Thị Hải Yến Người tận tâm dẫn, hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian nghiên cứu, thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn HVCH Nguyễn Thành Lâm quan tâm dẫn giúp đỡ em suốt thời gian nghiên cứu, thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Bào chế, anh chị công tác Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Học viện Nông nghiệp Việt Nam hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn quý thầy Ban giám hiệu nhà trường, phịng ban cán nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, người tạo điều kiện cho em học tập, tiếp thu kiến thức suốt năm qua Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới anh chị em sinh viên K72, K73, K74 nhóm nghiên cứu Em đặc biệt cảm ơn ThS Bùi Thị Thương, DS Ngô Giao Thông, DS Vũ Thị Hồng Hạnh, bạn Bùi Thị Ngọc Hà, em Trần Thu Thảo, em Nguyễn Công Khương, em Võ Minh Hiển, người đồng hành em suốt quãng thời gian làm nghiên cứu khoa học Bộ môn Bào chế Em ln cảm thấy may mắn có gia đình bạn bè bên cạnh giúp đỡ, hỗ trợ, động viên em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên khóa 73 Phạm Việt Long MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan leuprolid acetat 1.1.1 Cơng thức hóa học 1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học 1.1.3 Độ ổn định 1.1.4 Một vài thông số dược động học .3 1.1.5 Ứng dụng điều trị .3 1.2 Tổng quan giải phóng dược chất khỏi PLGA 1.2.1 Cơ chế giải phóng dược chất khỏi PLGA 1.2.2 Phương pháp định lượng leuprolid acetat môi trường thử giải phóng 1.3 Tổng quan sinh khả dụng 1.3.1 Khái niệm sinh khả dụng 1.3.2 Đánh giá sinh khả dụng in vivo 1.3.3 Các thông số dược động học 1.3.4 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo 1.3.5 Phương pháp định lượng thuốc huyết 1.4 Một số nghiên cứu sinh khả dụng in vivo leuprolid acetat 10 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng 14 2.1.1 Nguyên vật liệu 14 2.1.2 Thiết bị 15 2.1.3 Động vật thí nghiệm 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp bào chế vi cầu PLGA-LA 16 2.3.2 Phương pháp đánh giá số tiêu chất lượng 18 2.3.3 Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện thực 19 2.3.4 Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện cấp tốc 21 2.3.5 Phương pháp so sánh khả giải phóng in vitro vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu 22 2.3.6 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo động vật thí nghiệm 22 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu .26 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27 3.1 So sánh khả giải phóng in vitro vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu 27 3.1.1 So sánh khả giải phóng in vitro mơi trường Tween 80 0,02% vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu điều kiện cấp tốc 27 3.1.2 So sánh khả giải phóng in vitro mơi trường đệm PBS-T vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu điều kiện cấp tốc 31 3.1.3 So sánh khả giải phóng in vitro vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu điều kiện thực 34 3.2 Kết nghiên cứu sinh khả dụng in vivo động vật thí nghiệm 39 3.2.1 Kết định lượng leuprolid acetat huyết chó 39 3.2.2 So sánh sinh khả dụng vi cầu thử với vi cầu đối chiếu 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt AUC0-∞ Tên đầy đủ Diện tích đường cong biểu diễn nồng độ - thời gian từ thời điểm đến ∞ Cmax Nồng độ LA cực đại huyết DCM Dicloromethan DĐVN V DMSO EE% EP FSH GnRH Dược điển Việt Nam V Dimethyl sulfoxid Hiệu suất vi cầu hóa % (Entrapment Efficiency %) Dược điển châu Âu Hormon kích thích nang trứng phát triển (Follicle-stimulating hormone) Hormon giải phóng gonadotropin (Gonadotropin release hormon) GPKD Giải phóng kéo dài HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao kl/kl Khối lượng/khối lượng kl/tt Khối lượng/thể tích KTTP Kích thước tiểu phân L/G Lactic acid/Glycolic acid LA Leuprolid acetat LClt% Hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu lý thuyết LCtt% Hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu thực tế LH N/D N/D/N Hormon làm noãn trưởng thành (Luteinizing hormone) Nước/Dầu Nước/Dầu/Nước NSX Nhà sản xuất PBS Đệm phosphat saline pH 7,4 PBS-T PBS-TN PLGA PLGA-LA PVA Đệm phosphat saline pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 Đệm phosphat saline pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 0,02% natri diazid Poly (lactic-co-glycolic) acid Vi cầu PLGA chứa dược chất leuprolid acetat Poly vinyl alcohol SD Độ lệch chuẩn SEM Kính hiển vi điện tử quét SKD Sinh khả dụng TCCS Tiêu chuẩn sở TKHH Tinh khiết hóa học TKPT Tinh khiết phân tích Tmax Thời gian để LA đạt nồng độ cực đại huyết tt/tt thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số dạng thuốc giải phóng kéo dài chứa leuprolid acetat Bảng 1.2 Phương pháp xử lý mẫu huyết .8 Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.3 Công thức bào chế vi cầu PLGA-LA 16 Bảng 2.4 Điều kiện sắc ký .25 Bảng 2.5 Điều kiện khối phổ 25 Bảng 3.1 Thành phần quy trình bào chế cơng thức vi cầu (1) 27 Bảng 3.2 Kết so sánh mẫu M2, M4, M5 với M1 30 Bảng 3.3 Thành phần quy trình bào chế cơng thức vi cầu (2) 31 Bảng 3.4 Kết so sánh mẫu M2, M5, M6 với M1 34 Bảng 3.5 Thành phần PLGA amoni bicarbonat công thức bào chế 34 Bảng 3.6 Kết so sánh mẫu M2, M5 với M1 38 Bảng 3.7 Thơng số dược động học LA chó 39 Bảng 3.8 Kết so sánh liệu dược động học vi cầu thử với vi cầu đối chiếu thông qua giá trị AUC0-∞ 41 Bảng 3.9 Kết so sánh liệu dược động học vi cầu thử với vi cầu đối chiếu thông qua giá trị Cmax 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức phân tử leuprolid acetat Hình 1.2 Các chế liên quan đến giải phóng thuốc Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế vi cầu PLGA-LA 17 Hình 3.1 Kích thước tiểu phân trung bình hàm lượng dược chất mẫu M2, M3, M4 M5 27 Hình 3.2 Đồ thị giải phóng điều kiện cấp tốc môi trường Tween 80 0,02% mẫu M2, M4 M5 (n = 3, TB±SD) 28 Hình 3.3 Đồ thị giải phóng cấp tốc mơi trường Tween 80 0,02% mẫu M2, M4, M5 M1 (n = 3, TB±SD) 30 Hình 3.4 Đồ thị giải phóng điều kiện cấp tốc mơi trường đệm PBS-T mẫu M2, M5 M6 (n = 3, TB±SD) .32 Hình 3.5 Kích thước tiểu phân trung bình hàm lượng dược chất mẫu M2, M5 M6 32 Hình 3.6 Đồ thị giải phóng dược chất điều kiện thực mẫu M2 M5 (n = 3, TB±SD) 35 Hình 3.7 Hình ảnh chụp SEM mẫu vi cầu M2 M5 phóng to 10.000 lần thời điểm ban đầu ngày giải phóng điều kiện thực 36 Hình 3.8 Hình ảnh chụp SEM mẫu vi cầu M2 M5 phóng to 3000 lần thời điểm ngày 21 giải phóng điều kiện thực 37 Hình 3.9 Đồ thị giải phóng in vitro mẫu M1, M2, M5 điều kiện thực (n = 3, TB±SD) 38 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn pha giải phóng ổn định điều kiện thực mẫu M2, M5 M1 39 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ LA huyết chó theo thời gian vi cầu thử vi cầu đối chiếu (n = 3, TB±SE) 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Leuprolid acetat (LA) nonapeptid tổng hợp, có cấu trúc tương tự với hormon giải phóng gonadotropin nội sinh (GnRH), chất tổng hợp tương tự hormon giải phóng gonadotropin (GnRH) với hiệu lực gấp khoảng 80-100 lần GnRH nội sinh, dùng để điều trị bệnh liên quan đến hormon dậy sớm phụ thuộc gonadotropin, ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn, ung thư vú, u trơn tử cung [32], [37], [42] LA có thời gian bán thải tương đối ngắn, bào chế dạng thuốc tiêm giải phóng phải dùng hàng ngày Trong đó, thời gian điều trị bệnh liên quan đến hormon thường kéo dài từ vài tháng đến vài năm Vì vậy, để đảm bảo tuân thủ điều trị bệnh nhân, việc bào chế thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa LA nạp vi cầu polyme phân hủy sinh học (PLGA) cần thiết Tại Bộ môn Bào chế - Khoa Bào chế công nghệ dược phẩm, vi cầu PLGA-LA bào chế đánh giá số đặc tính hóa lý, nghiên cứu chế giải phóng dược chất kéo dài, xây dựng tương quan giải phóng in vitro vi cầu PLGA-LA điều kiện thực điều kiện cấp tốc,…[2], [3], [4], [5] Tuy nhiên, việc đánh giá khả giải phóng in vitro vi cầu PLGA-LA đông khô so với vi cầu đối chiếu chưa thực đầy đủ Hơn nữa, thử nghiệm giải phóng in vitro điều kiện thực điều kiện cấp tốc chưa thể phản ánh đầy đủ khả giải phóng thuốc thể Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “So sánh khả giải phóng in vitro sinh khả dụng chó thí nghiệm vi cầu PLGA-LA đơng khơ với vi cầu đối chiếu” với mục tiêu sau: So sánh khả giải phóng in vitro vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu So sánh sinh khả dụng chó thí nghiệm vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu Hình 3.9 Đồ thị giải phóng in vitro mẫu M1, M2, M5 điều kiện thực (n = 3, TB±SD) So sánh kết thử giải phóng mẫu M2, M5 với liệu giải phóng mẫu vi cầu đối chiếu (mẫu M1) (phụ lục 5), kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết so sánh mẫu M2, M5 với M1 Cặp so sánh f1 f2 M2 với M1 28,07 41,03 M5 với M1 15,85 51,23 Từ bảng 3.6 nhận thấy so sánh với mẫu vi cầu đối chiếu, mẫu M2 có khác biệt so với mẫu vi cầu đối chiếu Ngược lại mẫu M5 có đồ thị % dược chất giải phóng điều kiện thực tương đồng với vi cầu đối chiếu, thể việc có số f2 lớn (51,23 > 50) f1 nhỏ Ngoài ra, tiến hành xây dựng phương trình tuyến tính giải đoạn giải phóng ổn định, nhận thấy số tốc độ K mẫu M5 (1,0310) ngang mẫu M1 (1,0387) nên tốc độ giải phóng dược chất pha giải phóng ổn định mẫu M5 tương đồng với vi cầu đối chiếu Hằng số tốc độ K mẫu M2 (1,1293) có khác biệt so với mẫu M5 vi cầu đối chiếu Kết xây dựng phương trình tuyến tính thể qua hình 3.10 38 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn pha giải phóng ổn định điều kiện thực mẫu M2, M5 M1 Kết luận: Trong mẫu vi cầu M2, M5 mẫu M5 có phần trăm dược chất giải phóng thời điểm tương đồng với mẫu vi cầu đối chiếu *Kết luận chung: Từ mục 3.1.1, 3.1.2, 3.1.3 thấy mẫu vi cầu M5 có khả giải phóng tương đồng với mẫu vi cầu đối chiếu, lựa chọn mẫu M5 cho nghiên cứu 3.2 Kết nghiên cứu sinh khả dụng in vivo động vật thí nghiệm 3.2.1 Kết định lượng leuprolid acetat huyết chó Tiến hành đánh giá sinh khả dụng đường tiêm bắp vi cầu thử (mẫu M3) vi cầu đối chiếu Kết định lượng nồng độ leuprolid acetat mẫu huyết chó thể hình 3.11, bảng 3.7 phụ lục 8, phụ lục Kết biểu thị dạng TB±SE Trong SE sai số chuẩn Bảng 3.7 Thông số dược động học LA chó Vi cầu đối chiếu Vi cầu thử Chó Tmax (giờ) Cmax (ng/mL) AUC0-∞ (giờ.ng/mL) Tmax (giờ) Cmax (ng/mL) AUC0-∞ (giờ.ng/mL) 2,00 30,02 372,97 2,00 15,46 282,17 1,00 9,38 169,35 1,00 30,07 410,77 2,00 7,57 188,36 1,00 10,06 181,84 TB 1,667 15,658 243,560 1,333 18,531 291,593 SE 0,333 7,199 64,937 0,333 5.976 66,253 39 Nhận xét: Vi cầu thử đầu có tốc độ hấp thu nhanh cao so với vi cầu đối chiếu Tmax vi cầu thử 1,333±0,333 giờ, vi cầu đối chiếu 1,667±0,333 Trong đó, Cmax vi cầu nghiên cứu đạt 18,531±5,976 ng/mL, vi cầu đối chiếu đạt 15,658±7,199 ng/mL Diện tích đường cong AUC0-∞ vi cầu thử đạt 291,593±66,253 giờ.ng/mL, vi cầu đối chiếu đat 243,560±64,937 giờ.ng/mL Có thể thấy, vi cầu PLGA-LA thử có tổng lượng thuốc hấp thu tương đương so với vi cầu đối chiếu Từ đồ thị hình 3.11, mẫu vi cầu PLGA-LA thử mẫu vi cầu đối chiếu giải phóng dược chất theo giai đoạn tương đồng Cả mẫu vi cầu có giai đoạn giải phóng ạt vài đầu (cụ thể lượng dược chất định lượng tăng dần từ thời điểm đến đầu), sau vào giai đoạn giải phóng chậm ổn định kéo dài khoảng 40 ngày Kết phù hợp với nghiên cứu sinh khả dụng in vivo LA mà Janki cộng công bố [7] Lượng dược chất định lượng máu thời điểm cuối 0,12±0,098 ng/mL (vi cầu thử) 0,007±0,008 ng/mL (vi cầu đối chiếu) thời điểm 35 ngày Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ LA huyết chó theo thời gian vi cầu thử vi cầu đối chiếu (n = 3, TB±SE) 3.2.2 So sánh sinh khả dụng vi cầu thử với vi cầu đối chiếu Để đánh giá rõ ràng sinh khả dụng hai mẫu, tiến hành so sánh liệu dược động học vi cầu thử với vi cầu đối chiếu qua thông số AUC0-∞, Cmax 40 phần mềm Graphprism, so sánh mẫu độc lập, sử dụng Independent Sample t-test Kết thể bảng 3.8, bảng 3.9 Bảng 3.8 Kết so sánh liệu dược động học vi cầu thử với vi cầu đối chiếu thông qua giá trị AUC0-∞ Lơ chó Tiêm vi cầu thử Tiêm vi cầu đối chiếu Cỡ mẫu Trung bình SE 291,593 66,235 243,560 64,937 p 0,6319 Nhận xét: Với mức ý nghĩa α = 0,05, kết bảng 3.8 cho thấy: + Giá trị p = 0,6319 > 0,05 điều chứng tỏ khác biệt diện tích đường cong AUC0-∞ vi cầu thử vi cầu đối chiếu khơng có ý nghĩa thơng kê Bảng 3.9 Kết so sánh liệu dược động học vi cầu thử với vi cầu đối chiếu thơng qua giá trị Cmax Lơ chó Tiêm vi cầu thử Tiêm vi cầu đối chiếu Cỡ mẫu Trung bình SE 18,531 5,976 15,658 7,199 p 0,7741 Nhận xét: Với mức ý nghĩa α = 0,05, kết bảng 3.9 cho thấy: + Giá trị p = 0,7741 > 0,05 điều chứng tỏ khác biệt nồng độ cực đại Cmax vi cầu thử vi cầu đối chiếu khơng có ý nghĩa thông kê Từ kết mục 3.2.1 kết xử lý thống kê, kết luận rằng, liệu sinh khả dụng vi cầu thử PLGA-LA đông khơ với vi cầu đối chiếu Lucrin® PDS Depot 3,75 mg khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Như vậy, thí nghiệm chứng minh vi cầu PLGA-LA đơng khơ có khả trì nồng độ dược chất máu thời gian dài, thích hợp cho việc điều trị kéo dài 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài đạt số kết sau: Đã bào chế so sánh khả giải phóng dược chất từ vi cầu PLGALA nghiên cứu so với mẫu vi cầu đối chiếu - Bào chế mẫu vi cầu PLGA-LA đông khô sử dụng polyme PLGA (LA/GA) = 75:25 - Đã đánh giá khả giải phóng dược chất mẫu vi cầu bào chế: + Các mẫu vi cầu sử dụng polyme PLGA (75:25) có chế giải phóng theo mơ hình giải phóng pha vi cầu đối chiếu gồm: pha giải phóng ạt ban đầu (burst release) – pha giải phóng ổn định + Các mẫu vi cầu có thêm amoni bicarbonat thành phần có liệu giải phóng dược chất in vitro tốt so với mẫu không thêm amoni bicarbonat - Đã so sánh liệu giải phóng in vitro vi cầu nghiên cứu với vi cầu đối chiếu (chế phẩm Lucrin® PDS Depot 3,75 mg): mẫu M5 có liệu giải phóng dược chất tương đương với vi cầu đối chiếu điều kiện thực điều kiện cấp tốc Đã đánh giá so sánh sinh khả dụng chó thí nghiệm vi cầu PLGA-LA nghiên cứu với vi cầu đối chiếu Lucrin® PDS Depot 3,75 mg - Kết cho thấy, vi cầu thử PLGA-LA nghiên cứu có liệu dược động học (thông qua thông số AUC0-∞, Cmax) khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với vi cầu đối chiếu Lucrin® PDS Depot 3,75 mg hai mẫu vi cầu có khả trì nồng độ thuốc thời gian dài KIẾN NGHỊ Dựa kết sinh khả dụng in vivo chó thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đưa kiến nghị sau: - Đánh giá sinh khả dụng in vivo vi cầu PLGA-LA nghiên cứu động vật thí nghiệm với cỡ mẫu cao - Đánh giá sinh khả dụng in vivo vi cầu PLGA-LA nghiên cứu người so sánh với vi cầu đối chiếu 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Bào chế (2020), Bào chế sinh dược học 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 60-62 Vũ Thị Hồng Hạnh (2022), Nghiên cứu chế giải phóng dược chất quy trình bào chế vi cầu Leuprolid acetat đơng khơ giải phóng kéo dài, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Liên (2021), Nghiên cứu đánh giá khả giải phóng kéo dài in vitro vi cầu Leuprolid acetat, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 34-35 Mai Văn Tân (2021), Hồn thiện quy trình bào chế vi cầu Leuprolid acetat, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 19-24 Ngô Giao Thông (2022), Nghiên cứu xây dựng ứng dụng tương quan giải phóng in vitro điều kiện dài hạn cấp tốc vi cầu Leuprolid acetat giải phóng kéo dài, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Tiếng Anh 10 11 12 13 14 15 Allison S Dean (2008), "Analysis of initial burst in PLGA microparticles", Expert opinion on drug delivery, 5(6), pp 615-628 Andhariya Janki V., Jog Rajan, et al (2019), "In vitro-in vivo correlation of parenteral PLGA microspheres: Effect of variable burst release", Journal of Controlled Release, 314, pp 25-37 Artursson Per, Palm Katrin, et al (2001), "Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport", Advanced drug delivery reviews, 46(1-3), pp 27-43 Avgoustakis Konstantinos (2005), "Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)", Encyclopedia of biomaterials and biomedical engineering, 1(1), pp 1-11 Blasi Paolo (2019), "Poly (lactic acid)/poly (lactic-co-glycolic acid)-based microparticles: an overview", Journal of Pharmaceutical Investigation, 49, pp 337-346 Cascone Sara (2017), "Modeling and comparison of release profiles: Effect of the dissolution method", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 106, pp 352-361 Costa Paulo, Lobo Jose Manuel Sousa (2001), "Modeling and comparison of dissolution profiles", European journal of pharmaceutical sciences, 13(2), pp 123-133 Fecteau Kellie A., Giori Luca, et al (2022), "Comparison of steroid and thyroid hormone concentrations in blood serum and plasma of captive tigers", Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 34(3), pp 547-551 Fredenberg Susanne, Wahlgren Marie, et al (2011), "The mechanisms of drug release in poly (lactic-co-glycolic acid)-based drug delivery systems—a review", International journal of pharmaceutics, 415(1-2), pp 34-52 Gu Bing, Burgess Diane J (2015), "Prediction of dexamethasone release from PLGA microspheres prepared with polymer blends using a design of experiment approach", International journal of pharmaceutics, 495(1), pp 393403 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Hall S C., Tan M M., et al (1999), "Characterization and comparison of leuprolide degradation profiles in water and dimethyl sulfoxide", The Journal of peptide research, 53(4), pp 432-441 Hauschke Dieter, Steinijans Volker, et al (2007), Bioequivalence studies in drug development: Methods and applications, John Wiley & Sons, pp Hirota Keiji, Doty Amy C., et al (2016), "Characterizing release mechanisms of leuprolide acetate-loaded PLGA microspheres for IVIVC development I: In vitro evaluation", Journal of controlled release, 244, pp 302-313 Hosseiny Davarani Saied Saeed, Pourahadi Ahmad, et al (2019), "Quantification of controlled release leuprolide and triptorelin in rabbit plasma using electromembrane extraction coupled with HPLC–UV", Electrophoresis, 40(7), pp 1074-1081 Iqbal Javed, Vigl Claudia, et al (2011), "Development and in vivo evaluation of a new oral nanoparticulate dosage form for leuprolide based on polyacrylic acid", Drug Delivery, 18(6), pp 432-440 Kojima Ryo, Yoshida Takatsune, et al (2015), "Release mechanisms of tacrolimus-loaded PLGA and PLA microspheres and immunosuppressive effects of the microspheres in a rat heart transplantation model", International journal of pharmaceutics, 492(1-2), pp 20-27 Lee Dong-Seok, Kang Dong Wook, et al (2020), "Development of level a in vitro–vivo correlation for electrosprayed microspheres containing leuprolide: physicochemical, pharmacokinetic, and pharmacodynamic evaluation", Pharmaceutics, 12(1), pp 36 Liu Jiwei, Ren Hao, et al (2019), "Mechanistic Evaluation of the Opposite Effects on Initial Burst Induced by Two Similar Hydrophilic Additives From Octreotide Acetate–Loaded PLGA Microspheres", Journal of Pharmaceutical Sciences, 108(7), pp 2367-2376 Luan Xiaosong, Bodmeier Roland (2006), "Modification of the tri-phasic drug release pattern of leuprolide acetate-loaded poly (lactide-co-glycolide) microparticles", European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 63(2), pp 205-214 Mastan Shaik, Latha Thirunagari Bhavya, et al (2011), "The basic regulatory considerations and prospects for conducting bioavailability/bioequivalence (BA/BE) studies–an overview", Comp Eff Res, 1, pp 1-25 Nasr Maha, Awad Gehanne A S., et al (2013), "Hydrophilic versus hydrophobic porogens for engineering of poly (lactide-co-glycolide) microparticles containing risedronate sodium", Pharmaceutical Development and Technology, 18(5), pp 1078-1088 Ogawa Yasuaki, Yamamoto Masaki, et al (1988), "Controlled-release of leuprolide acetate from polylactic acid or copoly (lactic/glycolic) acid microcapsules: influence of molecular weight and copolymer ratio of polymer", Chemical and pharmaceutical bulletin, 36(4), pp 1502-1507 Oh Yu Jin, Lee Jangwook, et al (2011), "Preparation of budesonide-loaded porous PLGA microparticles and their therapeutic efficacy in a murine asthma model", Journal of controlled release, 150(1), pp 56-62 Okada Hiroaki (1997), "One-and three-month release injectable microspheres of the LH-RH superagonist leuprorelin acetate", Advanced drug delivery reviews, 28(1), pp 43-70 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Okada Hiroaki, Inoue Yayoi, et al (1991), "Pharmacokinetics of once-a-month injectable microspheres of leuprolide acetate", Pharmaceutical research, 8, pp 787-791 Park Sunghoon, Kim Dong-Hwan, et al (2017), "Comparative in vitro release and clinical pharmacokinetics of leuprolide from Luphere 3M Depot, a 3-month release formulation of leuprolide acetate", Drug development and industrial pharmacy, 43(3), pp 441-447 Plosker Greg L., Brogden Rex N (1994), "Leuprorelin: a review of its pharmacology and therapeutic use in prostatic cancer, endometriosis and other sex hormone-related disorders", Drugs, 48(6), pp 930-967 Prajapati Vipul D., Jani Girish K., et al (2015), "Current knowledge on biodegradable microspheres in drug delivery", Expert opinion on drug delivery, 12(8), pp 1283-1299 Ravivarapu Harish B., Burton Kevin, et al (2000), "Polymer and microsphere blending to alter the release of a peptide from PLGA microspheres", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 50(2), pp 263-270 Ravivarapu Harish B., Lee Heeyong, et al (2000), "Enhancing initial release of peptide from poly (d, l-lactide-co-glycolide)(PLGA) microspheres by addition of a porosigen and increasing drug load", Pharmaceutical development and technology, 5(2), pp 287-296 SungKyunKwan University (1994), Analytical Approach for Drug Delivery System, SungKyunKwan University, pp Teutonico Donato, Montanari Silvia, et al (2012), "Leuprolide acetate: pharmaceutical use and delivery potentials", Expert opinion on drug delivery, 9(3), pp 343-354 Uhrich Kathryn E., Cannizzaro Scott M., et al (1999), "Polymeric systems for controlled drug release", Chemical reviews, 99(11), pp 3181-3198 Wang Juan, Wang Barbara M., et al (2002), "Characterization of the initial burst release of a model peptide from poly (D, L-lactide-co-glycolide) microspheres", Journal of controlled release, 82(2-3), pp 289-307 Wang Tengteng, Xue Peng, et al (2019), "Pore change during degradation of octreotide acetate-loaded PLGA microspheres: The effect of polymer blends", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 138, pp 104990 Welling Peter (1991), Pharmaceutical bioequivalence, Informa Health Care, pp Wilson Andrea C., Vadakkadath Meethal Sivan, et al (2007), "Leuprolide acetate: a drug of diverse clinical applications", Expert opinion on investigational drugs, 16(11), pp 1851-1863 Xiong D M., Wen S L., et al (2014), "Determination of Leuprolide in Beagle Dogs' Serum by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Study on Bioequivalence", Asian Journal of Chemistry, 26(8), pp 2321 Yang Yan, Bajaj Nimisha, et al (2009), "Development of highly porous large PLGA microparticles for pulmonary drug delivery", Biomaterials, 30(10), pp 1947-1953 Yoo Jin, Won You-Yeon (2020), "Phenomenology of the initial burst release of drugs from PLGA microparticles", ACS Biomaterials Science & Engineering, 6(11), pp 6053-6062 Zhan Yan, Chen Xiaoyan, et al (2009), "Rapid and sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the determination of 47 48 leuprolide in human serum", Journal of Chromatography B, 877(27), pp 31943200 Zhao Jinlong, Wang Lexi, et al (2017), "Development of near zero-order release PLGA-based microspheres of a novel antipsychotic", International journal of pharmaceutics, 516(1-2), pp 32-38 Zhou Jia, Walker Jennifer, et al (2020), "Effect of manufacturing variables and raw materials on the composition-equivalent PLGA microspheres for 1-month controlled release of leuprolide", Molecular pharmaceutics, 17(5), pp 15021515 PHỤ LỤC Phụ lục Kết thử giải phóng điều kiện dài hạn mẫu M2 M5 (n = 3, TB±SD) % giải phóng dược chất Thời gian (ngày) Mẫu M2 Mẫu M5 11,54±3,48 14,35±3,12 24,07±2,69 29,08±1,90 30,96±1,56 38,60±2,52 14 38,55±4,11 47,25±0,97 21 47,14±1,32 55,96±1,04 28 53,75±2,30 64,86±1,49 35 63,16±1,40 70,77±1,43 42 72,36±0,69 79,58±1,17 49 78,25±2,67 83,56±0,88 56 85,76±1,99 88,67±1,21 Phụ lục Kích thước tiểu phân (n = 5) khả nạp dược chất mẫu vi cầu (n = 3) Kích thước vi cầu Mẫu Khả nạp Hiệu suất Hàm lượng vi cầu hóa (LCtt %) (EE %) D[4,3] (µm) Dv(90) (µm) Span M2 12,48±0,25 21,61±1,66 1,864±0,029 6,64±0,68 64,46±1,27 M3 11,54±0,23 19,30±0,39 1,641±0,035 5,46±0,13 51,47±1,25 M4 14,82±0,68 22,15±0,68 1,813±0,02 5,48±0,47 52,29±2,01 M5 8,77±0,15 15,78±0,75 1,613±0,042 7,58±0,35 72,81±1,78 M6 31,86±2,57 54,64±2,37 3,512±1,05 3,62±0,97 29,70±2,37 Phụ lục Kết thử giải phóng điều kiện cấp tốc số mẫu môi trường Tween 80 0,02% (n = 3, TB±SD) % dược chất giải phóng Thời gian (giờ) M2 M4 M5 18,32±1,42 20,62±1,43 23,73±2,13 46,95±1,82 50,09±1,01 52,09±1,20 30 68,04±0,93 72,24±3,11 85,31±2,17 48 75,85±2,25 80,13±2,81 54 80,01±2,16 83,63±1,11 Phụ lục Kết thử giải phóng điều kiện cấp tốc số mẫu môi trường đệm PBS-T (n = 3, TB±SD) % dược chất giải phóng Thời gian (giờ) M2 M5 M6 11,10±1,18 16,65±1,34 13,73±2,02 27,29±2.16 38,81±1,62 29,70±1,32 30 59,52±1,86 62,34±1,38 34,98±1,53 48 68,68±2,04 70,43±2,34 42,39±0,91 54 73,31±1,02 75,07±0,93 49,16±2,05 Phụ lục Kết thử giải phóng dài hạn dự đốn thử giải phóng cấp tốc môi trường Tween 80 0,02% mẫu vi cầu đối chiếu Lucrin® depot PDS 3,75 mg (n = 3, TB±SD) Thử giải phóng dài hạn Thời gian (ngày) % giải phóng dược chất Thử giải phóng cấp tốc Thời gian (giờ) % giải phóng dược chất 27,49±1,38 11,65 ±1,02 32,82±1,58 16,91 ±1,99 48,43±1,40 52,35 ±2,03 14 58,50±2,81 24 86,63 ±1,24 21 63,16±1,41 30 91,86 ±2,19 28 71,74±2,75 35 83,47±2,71 42 90,88±2,72 49 96,44±2,57 56 98,84±1,56 Phụ lục 6.Dữ liệu dự đoán kết giải phóng cấp tốc mơi trường đệm PBS-T mẫu vi cầu đối chiếu Dữ liệu dự đốn phần Thời gian (giờ) trăm dược chất giải phóng 27,26 46,46 30 69,22 48 78,73 54 81,31 72 87,89 Phụ lục Phần trăm LA giải phóng theo thời gian vi cầu PLGA-LA bào chế theo cơng thức M5 vi cầu đối chiếu Lucrin® Depot PDS 3,75 mg (n = 3, TB±SD) Thời gian (giờ) 30 Giải phóng dược chất vi cầu 23,73±2,13 PLGA-LA đơng khơ (%) 52,09±1,20 85,31±2,17 Giải phóng dược chất vi cầu đối chiếu Lucrin Depot 3,75 mg (%) 52,35±2,03 91,86±2,19 11,65±1,02 Phụ lục Nồng độ thuốc trung bình huyết mẫu vi cầu thử vi cầu đối chiếu thời điểm (n = 3, TB±SE) Thời gian Nồng độ thuốc huyết (ng/mL) Vi cầu thử Vi cầu đối chiếu 0,25 7,53±6,15 8,04±2,23 0,5 11,55±6,92 10,73±1,99 16,61±6,73 15,21±2,28 17,99±5,93 15,44±2,31 12,63±3,21 9,91±1,17 6,57±3,19 4,86±0,77 2,97±1,50 2,70±0,49 24 0,72±0,42 0,61±0,11 32 0,34±0,18 0,35±0,07 ngày 0,28±0,10 0,26±0,03 ngày 0,18±0,06 0,17±0,02 ngày 0,16±0,03 0,15±0,02 ngày 0,13±0,04 0,10±0,01 14 ngày 0,21±0,10 0,18±0,02 21 ngày 0,14±0,03 0,14±0,01 28 ngày 0,098±0,014 0,097±0,004 35 ngày 0,12±0,098 0,07±0,008 Thời điểm lấy mẫu Mã ĐVTN T-CHO1 BQL T-CHO2 T-CHO3 R-CHO1 R-CHO2 R-CHO3 BQL BQL 0,034 BQL BQL 1,122 19,823 1,656 22,115 1,405 0,606 Phụ lục Nồng độ 0,5 4,839 25,393 4,410 23,218 5,638 3,320 Leuprolid acetat 9,687 30,068 10,061 29,549 9,384 6,683 huyết 15,463 29,286 9,235 30,018 8,731 7,572 chó (ng/mL) 8,831 18,999 10,048 17,309 6,685 5,725 2,948 12,933 3,833 9,653 3,208 1,729 1,084 5,944 1,883 5,752 1,709 0,630 24 0,235 1,561 0,369 1,289 0,300 0,227 32 0,152 0,687 0,169 0,809 0,131 0,110 ngày 0,212 0,475 0,142 0,477 0,209 0,107 ngày 0,149 0,288 0,099 0,319 0,092 0,105 ngày 0,169 0,211 0,112 0,238 0,032 0,173 ngày 0,089 0,216 0,085 0,158 0,053 0,094 14 ngày 0,072 0,411 0,140 0,319 0,144 0,071 21 ngày 0,117 0,093 0,206 0,155 0,210 0,067 28 ngày 0,072 0,119 0,102 0,113 0,106 0,071 35 ngày 0,117 BQL BQL 0,064 BQL 0,067 42 ngày BQL BQL BQL BQL BQL BQL 0,25 Ghi chú: T-CHO1, T-CHO2, T-CHO3: Chó thí nghiệm tiêm vi cầu thử R-CHO1, R-CHO2, R-CHO3: Chó thí nghiệm tiêm vi cầu đối chiếu Phụ lục 10 Sắc ký đồ định lượng mẫu huyết chó hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Phụ lục 11 Công thức tính hiệu suất nạp dược chất, hiệu suất vi cầu hóa Hiệu suất vi cầu hóa (EE%) đánh giá cách so sánh hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu thực tế (LCtt) với hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu lý thuyết (LClt) Hàm lượng dược chất vi cầu định lượng phương pháp mô tả mục 2.3.3.1 Hiệu suất vi cầu hóa tính theo cơng thức: ���� ��% = × 100% ���� Trong đó: Hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu lý thuyết (LClt) tính theo công thức: ���� = ��� ��� đầ� ��� ��� đầ� + �������� + ����� + � ������� × 100% Hàm lượng phần trăm dược chất vi cầu thực tế (LCtt) tính theo cơng thức: LC�� = ��� × 100% ��� �ầ�