Nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của viên nang theophylin tác dụng kéo dài

FDA : Food and Drug Administration -Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ HPLC : High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng hiệu năng cao NTN : Người tình nguyện TDKD : Tác dụn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

DS NGUYỄN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG

VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NANG THEOPHYLIN TÁC DỤNG KÉO DÀI

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ Dược PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 607301

LUẬN VÃN THẠC sĩ Dược HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS VÕ XUÂN MINH TH.S NGUYỄN TRầ n l i n h

• í ỷ

HÀ NỘI -2003

Trong quá trình thực hiện luận văn " N gh iên cứu đán h giá sinh kh ả dụng

và tương đư ơng sin h học của nang T heophyln TD K D *\ tôi đã nhận được sựgiúp đỡ quí báu của các Thầy, Cô giáo bộ môn bào chế, Bộ môn phân tích, Bộ môn hoá dược, ban giám hiệu Trưòỉng trung học Dược TW và phòng đào tạo sau đại học- Trường Đại Học Dược Hà Nội

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PSG TS Võ Xuân Minh.

ThS Nguyễn Trần Linh.

Những người đã trực tiếp giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy, Cô giáo Trường Đại Học Dược

Hà Nội đã giảng dạy giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày thàng 12 năm 2003

Học viên : Nguyễn Thị Hường

FDA : Food and Drug Administration

-(Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ)

HPLC : High performance liquid chromatography -

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

NTN : Người tình nguyện

TDKD : Tác dụng kéo dài

TĐSH : Tương đương sinh học

SKD : Sinh khả dụng

R : Viên đối chiếu (nang Euphylline LA 200mg)

T : Viên thử (nang Theophylin TDKD 200mg)

o : Dung dịch theophylin lOOmg trong 100 ml nướcMRT ; Thời gian lưu trú trung bình

USP : Dược điển Mỹ

Cs/Cp : Tỉ lệ nồng độ theophylin trong nước bọt và trong huyết

tương NTN

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

PHẦN 1 - TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về thuốc tác dụng kéo dài 2

1.1.1 Khái niệm .2

1.1.2 ư u n h ư ợ c đ iể m 3

1.1.3 Các dược chất thường chế dưới dạng tác dụng kéo dài 3

1.1.4 Các hệ tác dụng kéo dài dùng đường uống 4

1.2 Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 4

1.2.1 Thiết kế nghiên cứu 4

1.2.2 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học - Qui định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh h ọ c 8

1.2.3 Áp dụng mô hình không ngăn trong nghiên cứu dược động học 15

1.3 Tưong quan in vitro - in vivo 19

1.3.1 Chỉ tiêu in v itro 19

1.3.2 Chỉ tiêu in vivo 20

1.3.3 Tương quan in vitro - in v iv o 20

1.4 Theophylin và chế phẩm theophylin tác dụng kéo dài 25

1.4.1 Theophylin 25

1.4.2 Q iế phẩm theophylin tác dụng kéo dài 30

PHẨN 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 32

2.1 Nguyên vật liệu 32

2.2 Phương tiện 32

2.3 Ngưòi tình nguyện 33

sinh học 33

2.4.2 Lấy và bảo quản mẫu sinh học 34

2.4.3 Chiết xuất và định lượng theophylin từ dịch sinh học 34

2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích theophylin trong dịch sinh h ọ c 36

2.4.5 Xây dựng đường chuẩn theophylin trong dịch sinh học 36

2.4.6 Đánh giá tương quan giữa nồng độ theophylin trong nước bọt và trong huyết tưcfng .37

2.4.7 Xác định các thông số dược động học 37

2.4.8 Đánh giá tương đương sinh học 39

2.4.9 Nghiên cứu tương quan in vitro - in vivo 40

PHẦN 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 42

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lưọtig theophylin trong dịch sinh h ọ c 42

3.1.1 Xác định tính chọn lọc của phương pháp 42

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn theophylin trong nước bọt và trong huyết tương 44

3.1.3 Xác định độ chính xác của phương p háp 48

3.1.4 Xác định tính đúng của phương pháp 50

3.1.5 Giód hạn định lượng 53

3.2 Xác định tương quan giữa nồng độ theophylin trong nước bọt và trong huyết tương 53

3.3 Định lượng nồng độ theophylin trong nước bọt khi nghiên cứu liều đ ơ n 56

3.4.1 Các thông số dược động học của 3 mẫu R, T, o 59

3.4.2 Đánh giá mức độ tương đương sinh học giữa viên nang theophylin tác dụng kéo dài và Euphylline L.A 61

3.5 Xác định Mỏi tương quan in vivo và in vitro 66

3.5.1 Tính toán tốc độ hấp thu theo phương pháp giải tích chập 6 6 3.5.2 Nghiên cứu tương quan in vitro-in vivo của viên nang theophylin tác dụng kéo dài 6 8 PHẦN 4 - BÀN LUẬN 71

4.1 Về xây dựng và thẩm định phưoTig pháp định lượng theophylin trong dịch sinh h ọ c 71

4.2 Về liên quan giữa nồng độ theophylỊn trong nước bọt và huyết tương người tình nguyện 71

4.3 Về sinh khả dụng và TƯƠNG đương sinh học 74

4.4 Về tương quan in vivo - in vitro 76

PHẦN 5 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

Đã từ lâu theophylin là thuốc đã được dùng để điều trị hen phế quản Tuy nhiên, theophylin có thời gian bán thải ngắn, khoảng điều trị hẹp (5 - 1 0 |ig/ml) nên khi sử dụng các dạng thuốc qui ước thì nồng độ dược chất trong máu dao động nhiều giữa các cá thể làm hiệu quả điều trị không ổn định, thuốc không an toàn Trong khi đó có rất nhiều thuốc mới ra đời dùng điều trị hen nên theophylin dạng qui ước ít được dùng [12], [23].

Thuốc tác dụng kéo dài là dạng thuốc có nhiều ưu điểm như giảm số lần dùng thuốc cho người bệnh, giảm tác dụng phụ, tăng hiệu quả điều trị Để khắc phục những hạn chế của theophylin dạng qui ước, người ta đã nghiên cứu bào chế dược chất này dưới dạng tác dụng kéo dài Hiện nay, trên thị trường thuốc, các nhà sản xuất đã đưa ra rất nhiều biệt dược theophylin tác dụng kéo dài

ở nước ta những nghiên cứu về theophylin tác dụng kéo dài vẫn còn nhiều hạn chế Cho đến nay chưa có chế phẩm nào được các đơn vị trong nước đăng kí sản xuất lưu hành Những năm vừa qua, Bộ môn Bào chế trưòìig Đại học Dược

Hà nội đã nghiên cứu bào chế viên nang “Theophylin 200 mg TDKD” Để góp

phần hoàn thiện chế phẩm này, chúng tôi tiến hành đề tài: '"Đánh giá sinh khả

dụng và tương đương sinh học của viên nang Theophylin TDKD” với các mục

1.1 VÀI NÉT VỂ THUỐC TÁC DỤNG KÉO DÀI

1.1.1 Khái niệm [11], [12], [23]

Thuốc tác dụng kéo dài (TDKD) là những chế phẩm, khi sử dụng, dược chất được giải phóng đều đặn, liên tục để duy trì nồng độ điều trị trong một thời gian dài theo ý muốn Theo qui định của Mỹ, thuốc TDKD ít nhất phải giảm được một nửa số lần dùng thuốc cho người bệnh.

Hình 1.1 Đồ thị biến thiên nồng độ dược chất trong máu

theo thời gian của các dạng thuốc uống.

1, Dạng quy ước 3 Dạng giải phóng nhắc lại

2 Dạng tác dụng kéo dài 4 Dạng giải phóng có kiểm soát

1.1.2 ưu nhược điểm [9], [11], [12]

1.1.2.1 ư u điểm

• Duy trì nồng độ dược chất trong máu trong vùng điều trị trong thời gian

dài, tránh được hiện tượng đỉnh- đáy, do đó:

- Cải thiện điều trị các bệnh mạn tính hay có cơn bột phát mới khi nồng độ thuốc trong máu hạ thấp

- Giảm tác dụng không mong muốn của thuốc khi nồng độ tăng cao

• Giảm số lần dùng thuốc cho người bệnh, do đó đễ đảm bảo sự tuân thủ chế độ điều trị

• Nâng cao sinh khả dụng do dược chất được hấp thu đều đặn, triệt để hơn tại vị trí hấp thu tối ưu

• Giảm tổng liều cho cả đợt điều trị

1.1.2.2 N h ư ợc điểm

• Nếu có hiện tượng ngộ độc hoặc tác dụng không mong muốn thì khó

xử lý hơn thuốc qui ước

• Đòi hỏi kỹ thuật bào chế cao

• Chỉ một số dược chất chế được dưới dạng TDKD.

1.1.3 Các dược chất thường chế dưới dạng tác dụng kéo dài [11], [14]

Những dược chất có tác dụng điều trị những bệnh mạn tính, bệnh nhân phải dùng thuốc dài ngày mà thòi gian bán thải của dược chất ngắn thì thường

được chế dưới dạng thuốc TDKD Để có thể chế thành dạng thuốc TDKD các

dược chất phải đạt các yêu cầu sau:

- Có chỉ số điều trị lớn

- Tác dụng phụ nhỏ khi liều cao

Không sử dụng để chế dạng thuốc TDKD các dược chất có đặc điểm :

- Liều đơn rất cao (vì chế phẩm có khối lượng quá lớn sẽ khó nuốt)

- Liều rất chính xác Liều tác dụng gần liều độc

- Sự hấp thu biến thiên trong bộ máy tiêu hoá hoặc chỉ hấp thu ở phần

trên của bộ máy tiêu hoá.

1.1.4 Các hệ tác dụng kéo dài dùng đường uống [9], [11], [12], [23]

> Hệ khuếch tán:

- Hệ màng bao khuếch tán

- Hệ cốt trơ khuếch tán

> Hệ hoà tan:

- Hệ màng bao hoà tan

- Cốt thân nước và cốt sơ nước ăn mòn

> Hệ trao đổi ỉon

> Hệ thẩm thấu

ĐƯƠNG SINH HỌC

1.2.1 Thiết k ế nghiên cứu

1.2.1.1 K h á i niệm v ề sinh kh ả dụ n g và tương đư ơng sinh học [4], [11],

[2 4 ], [3 9 ]

Sinh khả dụng (SKD) là khả năng đặc trưng cho quá trình sinh dược học

của dạng thuốc, phản ánh tốc độ và mức độ hấp thu của dược chất còn nguyên

Tương đương sinh học (TĐSH): hai chế phẩm được coi là TĐSH nếu giữa chúng không có sự khác nhau có ý nghĩa về tốc độ và mức độ xuất hiện của dược chất, chất chuyển hóa có hoạt tính hoặc những chất thay thế tại đích tác dụng khi được dùng với liều như nhau dưới những điều kiện như nhau trong một nghiên cứu được thiết kế một cách thích hợp [24].

1.2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến thiết k ế nghiên cứu sinh khả dụng và

tương đương sinh học [24], [39]

a Sự dao động các thông số dược động học trong từng cá thể và giữa các

cá thể

Không có 2 cá thể nào hoàn toàn giống nhau về đáp ứng thuốc Trong cùng một cá thể thì các thông số dược động học cũng khác nhau ở từng thời điểm do chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: enzym, chất ức chế, pH nước tiểu Điều này ảnh hưởng đến thiết kế nghiên cứu SKD và TĐSH, đặc biệt đối với thuốc chuyển hoá nhiều qua gan

b Động học Michaelis-Menten

Thông thường sự khác nhau trong SKD là do khác nhau về hấp thu Tuy nhiên với những thuốc có động học hấp thu không tuyến tính thì ngay khi hấp thu giống nhau vẫn có thể tạo ra SKD khác nhau Với thuốc chuyển hoá nhiều qua gan thì bị chuyển hoá trước khi đến hệ tuần hoàn và chúng có các phương pháp riêng để đánh giá SKD

Đối vói thuốc tuân theo động học thải trừ không tuyến tính thì sử dụng động học Michaelis-Menten để xác định SKD của thuốc

khác trở nên bão hoà Vì vậy hai sản phẩm chứa cùng một lượng dược chất được hấp thu ở tốc độ khác nhau có thể tạo ra SKD giống nhau về dược chất

mẹ, do đồ thị nồng độ máu khác nhau của chất chuyển hoá Đặc biệt khi chất chuyển hoá có tác dụng dược lý Trong trường hợp này phải đánh giá SKD dựa trên nồng độ máu của thuốc không đổi và các chất chuyển hoá

Khi chất chuyển hoá là chất có hoạt tính thì phải đánh giá SKD và TĐSH thông qua nghiên cứu SKD của chất chuyển hoá

d Các dạng thuốc qui ước và dạng giải phóng kéo dài

Mỗi dạng thuốc khác nhau đòi hỏi một phương pháp thiết kế nghiên cứu SKD và TĐSH phù hợp Đối với thuốc TDKD phải chứng minh được tính chất kéo dài và duy trì được nồng độ máu của thuốc ở từng giai đoạn xác định

e Mối quan hệ nồng độ thuốc trong máu và đáp ứng lâm sàng

Nếu 2 chế phẩm có tốc độ và mức độ hấp thu vào vòng tuần hoàn như nhau thì chúng có khả năng cao sẽ tương đương về hiệu quả điều trị Nhưng nếu 2 chế phẩm có SKD khác nhau thì độ an toàn và hiệu quả điều trị có thể khác nhau ít hoặc rất nhiều Điều này phụ thuộc vào mối quan hệ tự nhiên giữa nồng độ thuốc và đáp ứng của cơ thể

1.2.1.3 N h ữ n g chú ý tron g th iết k ế nghiên cứu sình k h ả dụn g và tương

đư ơng sin h học [39]

a Lựa chọn thiết k ế đơn liều hay đa liều

Đối với dạng thuốc TDKD, sử dụng thiết kế đa liều là thích hợp

- Thiết kế đa liều nên thực hiện trên bệnh nhân Ngược lại, thiết kế đơn liều được thực hiện trên người tình nguyện (NTN) khoẻ mạnh

chú ý trong thiết kế đa liều vì cần giai đoạn thải trừ dài hơn thiết kế đơn liều.

- Để giảm dao động giữa các cá thể, cần chọn người có thông số động học gần như nhau, sử dụng thiết kế cần số lượng cá thể tối thiểu

- Phải phát hiện sự bão hoà dược động học khi nghiên cứu trạng thái cân bằng trong thiết kế đa liều

b Thực hiện nghiên cứu trên người tình nguyện khoẻ mạnh hay bệnh nhân

Vì bệnh nhân là đối tượng điều trị nên nghiên cứu trên bệnh nhân sẽ phản ánh đúng hiệu quả điều trị hơn Tuy nhiên, do sai số lớn nên bệnh nhân chỉ được nghiên cứu trong thiết kế đa liều NTN khoẻ mạnh là nhóm người có tình trạng sức khoẻ ổn định, do đó tránh được ảnh hưcmg của vấn đề thuốc dùng kèm và tình trạng bệnh, đồng thời đảm bảo mô hình hấp thu của thuốc

c Định lượng chất mẹ hay chất chuyển hoá

Khi đánh giá TĐSH, cần nghiên cứu sự chuyển hoá của thuốc trong cơ thể và cần quan tâm định lượng cả chất mẹ và chất chuyển hoá có hoạt tính để thu được kết quả chính xác

d Lựa chọn sử dụng phương pháp thống kê đ ể đánh giá tương đương sinh học

Do có sự dao động trong từng cá thể và giữa các cá thể trong quá trình nghiên cứu nên kết quả thực nghiệm phải được phân tích bằng các test thống

kê thích hợp.

Ib) Thử in vitro đã được chứng minh là tưcỉng quan tỉ lệ thuận với số liệu sinh khả dụng in vivo trên người.

2) Thử in vivo ở người bằng cách đo dược chất hoặc chất chuyển hoá bài tiết nước tiểu theo thời gian

3) Thử in vivo trên người bằng cách đo tác dụng dược lý của dược chất hoặc chất chuyển hoá theo thời gian nếu tác dụng đó có thể đo được một cách đủ chính xác, đủ nhạy và lặp lại

4) So sánh tác dụng lâm sàng một cách thích hợp

1.2.2.2 Q u ỉ định vê đán h giá sinh k h ả dụ n g và tương đương sinh học

Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) đã đưa ra những qui định về đánh giá TĐSH, tiêu chuẩn công nhận kết quả đánh giá, các nguyên tắc trong xác định TDSH Sau đây là một số nội dung chứih:

a Thiết kếnghiên cứu [18], [39], [45]

> N g h iên cứu đơn liều

- Thực hiện trên NTN khỏe manh

o Chính xác hơn đa liều (sai số trong từng cá thể nhỏ hơn sai số giữa các cá thể).

o Là một dạng của ô vuông la tinh Nói chung dễ diễn đạt bằng hình ảnh

o Kinh tế

- Tuy nhiên nghiên cứu đơn liều có nhược điểm sau:

o Tốn nhiều thời gian

o Nếu sót một vài số liệu thì sai số lớn

o Không đánh giá được ảnh hưởng của sự tương tác giữa các nguồn biến thiên đến đại lượng nghiên cứu

Để hạn chế sai số, chia nhóm phải đảm bảo tính ngẫu nhiên

- Thời gian lấy mẫu phải bao gồm giai đoạn thải trừ: thời gian lấy mẫuphải lớn hơn 3 lần thời gian bán thải

- Thời điểm lấy mẫu phải đảm bảo:

o Xác định đầy đủ các giai đoạn tăng, giảm của đường cong nồng độ thời gian (ít nhất phải có 4 điểm ở pha hấp thu, 4 điểm ở khoảngnồng độ 4 điểm ở đoạn cuối pha thải trừ)

- Được sử dụng k h i:

o Hai chế phẩm có sự khác nhau về tốc độ hấp thu, nhưng giống nhau

về mức độ hấp thu

o Có sự dao động lớn về SKD giữa các cá thể

o Nồng độ thuốc trong máu khi nghiên cứu đơn liều quá thấp

o Khi chế phẩm nghiên cứu là dạng bào chế giải phóng có kiểm soát

o Khi thuốc tuân theo động học không tuyến tính

- FDA cũng có những qui định riêng cho thiết kế nghiên cứu đa liều

b Người tình nguyện [4], [12], [45]

NTN trong nghiên cứu TĐSH là những người khỏe mạnh, tuổi từ 20 đến

40, không có tiền sử về bệnh đường tiêu hoá, gan, thận, Trước khi lựa chọn cần được kiểm tra về các hằng số huyết học, nước tiểu để loại bỏ những tnrcmg hợp bất thường Để giảm bớt dao động giữa các cá thể, nên chọn những người

có ngoại hình tưcmg đối giống nhau, cân nặng cơ thể không nên chênh lệch quá 10% so với khối lượng tiêu chuẩn Việc chọn nam giới khoẻ mạnh cũng

là khía cạnh đạo đức để tránh thử thuốc trên trẻ em, người già, phụ nữ có thai, Không có qui định cụ thể về số lượng NTN dùng trong đánh giá SKD,

vì số lượng này phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu, đánh giá vào mô hình thiết kế và nhiều yếu tố khác Vì lí do nhân đạo và kinh tế, người ta khuyến cáo chỉ nên dùng NTN với số lượng tối thiểu đủ đảm bảo độ tin cậy của số liệu theo phương pháp thống kê Đồng thời nên kết hợp giữa số liệu in vitro, giữa mô hình động vật trong nghiên cứu thăm dò và sàng lọc để giảm bớt việc thử nghiệm thuốc trên ngưòi

Ngoài NTN khoẻ mạnh, trong những trường hợp nồng độ máu không phản ánh chính xác hiệu quả điều trị của thuốc hoặc cần đánh giá ảnh hưởng của trạng thái bệnh đến SKD, người ta còn dùng bệnh nhân để nghiên cứu

SKD Tuy nhiên việc nghiên cứu SKD trên bệnh nhân có những khó khăn như: khó kiểm soát chế độ ăn uống sinh hoạt của bệnh nhân như đối với NTN khoẻ mạnh, tình trạng bệnh và các thuốc dùng kèm có thể ảnh hưởng đến SKD của thuốc đánh giá

Trong từng trường hợp cụ thể có thể có qui định riêng

Mục đích chính khi lựa chọn NTN là giảm tối đa sự khác nhau về dược động học giữa các cá thể [1 2], [29]

c Thời điểm lấy mẫu

Trong thiết kế chéo, thông thường lấy 10 - 15 mẫu, thời điểm lấy mẫu phải lựa chọn phù hợp sao cho thể hiện được đầy đủ quá trình hấp thu, phân

bố, thải trừ [18], [45]

d C hế phẩm đối chiếu [3], [45]

Trước hết chọn chế phẩm đối chiếu là thuốc phát minh (thuốc gốc) nếu

có thể Tuỳ từng điều kiện có thể chọn chế phẩm đối chiếu là chế phẩm đã được công nhận về an toàn và hiệu quả điều trị, có uy tín từ lâu trên thị trường

và đã có đầy đủ thông tin lâm sàng [3],[ 12], [45] Thuốc đối chiếu và thuốc thử nghiệm không nên quá khác nhau về cơ chế giải phóng dược chất Hàm lượng của thuốc đối chiếu phải gần với hàm lượng ghi trên nhãn Hàm lượng của thuốc đối chiếu và hàm lượng thuốc thử nghiệm không nên khác nhau quá 5% Đối với thuốc TDKD, lượng dược chất giải phóng tại các thời điểm tương ứng vói 30%, 50%, 80% cỡ liều của thuốc thử nghiệm không được lệch quá 5% so với thuốc đối chiếu

e Thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng dược chất trong dịch sinh học [25]

Một qui trình phân tích bị ảnh hưởng bỏd rất nhiều yếu tố Để đảm bảo độ tin cậy cho kết quả phân tích thì phải thẩm định phương pháp phân tích Thẩm

định phương pháp phân tích sinh học gồm có thẩm định đầy đủ, thẩm định từng phần và thẩm định chéo.

độ và mẫu thử nên làm tại mỗi phòng thí nghiệm để thiết lập độ tin cậy giữa các phòng thí nghiệm Theo FDA, các phòng thí nghiệm phải có các qui trình thao tác chuẩn (SOPs)

Quá trình phân tích mẫu sinh học đặc biệt phải được qua thẩm định, thường được dùng làm các mẫu phân tích thường qui và chia thành các bước sau:

- Chuẩn bị mẫu chuẩn

- Phát triển phưcfng pháp phân tích và thiết lập phương pháp định lượng.

- Áp dụng các phương pháp thẩm định sinh học cho các mẫu phân tích thuốc thường qui và các tiêu chuẩn chấp nhận cho lô mẻ phân tích.

> Mẫu chuẩn

Việc phân tích các thuốc và các chất chuyển hoá của chúng trong mẫu sinh học được thực hiện bằng cách dùng các mẫu chuẩn và mẫu thử, Ba kiểu chuẩn thưòỉng được sử dụng là: chuẩn được cấp chứng chỉ (USP), chuẩn thương mại, chuẩn phòng thí nghiệm Tất cả các chuẩn trên phải có nguồn gốc, số lô, thời hạn, độ tinh khiết, lí tính phải được ghi rõ cho từng chất

> T hẩm định p h ư ơ n g p h á p định lượng dược ch ấ t tron g dịch sinh học

Để xây dựng một phương pháp định lượng cần qua các bước:

- Xác định độ ổn định của mẫu:

Chất phân tích phải được nghiên cứu xem có bị biến đổi không trong thời gian bảo quản mẫu (thường ở - 20°C), qua quá trình kích thích làm tan băng và thời gian làm thí nghiệm ở nhiệt độ phòng

Nghiên cứu độ ổn định bằng cách so sánh nồng độ của mẫu trước và sau quá trình bảo quản

- Xác định đường chuẩn:

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ thuốc trong dịch sinh học Pha các mẫu trong dịch sinh học trong khoảng khảo sát, bao gồm 6 - 8 mẫu pha ở các nồng độ trong khoảng khảo sát trong đó có giới hạn định lượng thấp nhất

- Xác định tính chọn lọc của phương pháp:

Là khả năng phân biệt và định lượng chất cần phân tích khi có mặt các chất khác trong mẫu

Để xác định tính chọn lọc cần lấy mẫu sinh học của ít nhất 6 người (khi chưa uống thuốc), xử lý và định lượng theo cùng quy trình với mẫu phân tích Phương pháp có tính chọn lọc cao khi khả năng phân biệt và định lượng chất phân tích phải không bị cản trở bởi sự có mặt của các chất khác.

Tính chọn lọc nên thực hiện tại giới hạn định lượng thấp nhất

- Xác định tính đúng:

Tính đúng của phuofng pháp là sự sai khác giữa nồng độ định lượng được

và nồng độ thực

Để xác định tính đúng, pha ít nhất 5 mẫu ở cùng nồng độ, làm ít nhất 3

nồng độ ở khoảng khảo sát (nên ở điểm đầu, điểm giữa, điểm cuối của đường

chuẩn) thì giá trị trung bình phải nằm trong 15% so vói giá trị thực, ngoại trừ tại giới hạn định lượng thấp nhất cho phép 2 0%

- Xác định độ chính xác:

Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ tái hiện

Độ lặp lại là sự sai khác nồng độ đo được khi thực hiện phép định lượng lại nhiều mẫu pha ở cùng nồng độ tại một thời điểm

Độ tái hiện là sự sai khác nồng độ đo được khi thực hiện phép định lượng lại nhiều mẫu pha ở cùng nồng độ tại các thời điểm khác nhau

Để xác định độ chính xác, pha ít nhất 5 mẫu ở cùng nồng độ, làm ít nhất

3 nồng độ ở khoảng khảo sát thì hệ số biến thiên (CV) không được quá 15%,

ngoại trừ tại giới hạn định lượng thấp nhất, c v không được quá 2 0%

- Xác định giới hạn định lượng:

Giói hạn định lượng thấp nhất là nồng độ thấp nhất thoả mãn :

o Đáp ứng pic tại giới hạn định lượng thấp nhất > 5 lần so sánh với đáp ứng pic tương ứng ở mẫu trắng (nếu có)

o Pic của chất phân tích tại giới hạn định lượng thấp nhất phải xác định, phân biệt, tái hiện với độ chính xác 2 0% và độ đúng 80 -

120%.

Đường chuẩn chứng tỏ được quan hệ tuyến tính khi ít nhất 2/3 số điểm (không kể điểm 0) phải thoả mãn:

o Tại giới hạn định lượng thấp nhất, độ lệch < 20%

o Tại các nồng độ khác giód hạn định lượng thấp nhất, độ lệch <15%.1.2.3 Áp dụng mô hình không ngăn trong nghiên cứu dược động học

[2], [5], [44]

Các dạng bào chế TDKD khác các dạng bào chế qui ước chủ yếu ồ tốc

độ hấp thu Do đó việc xác định chính xác phải dựa vào các phương

pháp đánh giá tốc độ hấp thu Các phương pháp hay sử dụng là:

- Phương pháp Wagner-Nelson

- Phương pháp Loo-Riegelman

- Phương pháp giải tích chập (deconvolution)

Những nghiên cứu về dược động học đều phải dựa trên những giả thuyết nhất định, điển hình là các mô hình dược động học:

1.2.3.1 P h ư ơ n g p h á p kh ôn g dựa trên m ô hình ngăn

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết thống kê thời điểm của biến ngẫu nhiên trong đó coi sự tồn tại của từng phân tử thuốc trong cơ thể

là độc lập vói nhau và thời gian tồn tại của một phân tử thuốc trong cơ thể được xem như là một biến ngẫu nhiên [44]

Nếu coi thời gian tiềm tàng bằng không thì phương trình nồng độ thuốc trong máu theo thời gian có dạng:

C { t) - A ^e + A j e + + A ^ e (Qui ước: x^> Ằ,ị)

Aị, A^, Xị, các tham số phụ thuộc vào thuốc nghiên cứu

Vói dạng TDKD, sau khi dùng thuốc một thời gian dài, phương trình trở thành:

Các thông số dược động học chính cần tính toán bao gồm:

• Tn,ax‘ Thòi gian đạt nồng độ dược chất cực đại trong dịch sinh học

• C^ax’ Nồng độ dược chất cực đại trong dịch sinh học

và Qax được xác định nhờ quan sát trực tiếp dữ liệu nồng độ dược chất trong dịch sinh học tại từng thòd điểm

• Hằng số tốc độ thải trừ, được tính từ độ dốc của đường thẳngbiểu diễn logarit nồng độ dược chất theo thòd gian tại các điểm lấymẫu cuối cùng của pha thải trừ

• T1/2Ỉ Thòi gian bán thải ^1/2 “

Với c, là nồng độ dược chất tại thời điểm tị, c„ là nồng độ dược chất tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng còn có thể định lượng chính xác được Thông thường Q rất nhỏ, khó định lượng chính xác; vì vậy thường tính theo C’n là nồng độ dược chất tại điểm lấy mẫu cuối cùng tính theo đồ thị InC theo t.

• AUMC: Diện tích dưới đường cong nồng độ X thời gian - thời gian

• MRT là một thông số dược động học tổng hợp bao gồm cả quá trình

hoà tan, hấp thu, phân bố và thải trừ

Việc tính toán MRT cho phép ứng dụng để so sánh tốc độ hấp thu của các dạng bào chế:

^ So sánh dạng uống với dạng tiêm tĩnh mạch:

MRTpj,: MRT của dạng thuốc uống

MRTj y! MRT của dạng thuốc tiêm

MAT: Thời gian hấp thu trung bình

Do đó, thòi gian hấp thu trung bình của dạng thuốc uống:

MAT = MRTp.,- MRTị,+ MAT là thời gian để thuốc hấp thu vào tuần hoàn từ dạng bào chế

A s

'r,

c

So sánh dạng thuốc rắn và dạng thuốc ỉỏng dùng qua đường uống

tìm ra được thòi gian hoà tan in vivo trung bình (MDT) theo công thức:

MDT = MAT,^-MAT„„,

+ Trong một nghiên cứu thử chéo để so sánh tương đưofng giữa hai chế phẩm, khi thời gian phân bố và thải trừ trên cùng một đối tượng được coi là không đổi thì sự chênh lệch giữa hai giá trị MRT chính là chênh lệch về thòd gian hấp thu MAT hay sự chênh lệch về tốc độ hấp thu

+ Khái niệm MRT trong in vivo là thời gian lưu trung bình của mỗi phân tử dược chất bên trong dạng bào chế từ khi bắt đầu cho vào môi trường hoà tan đến khi tan hết Nó được sử dụng để xác định tương quan giữa tốc độ hoà tan in vitro với tốc độ hấp thu in vivo

1.2.3.2 P hư ơng p h á p g iả i tích chập (deconvolution ) [44]

Theo phương pháp không dựa trên mô hình ngăn, tốc độ hấp thu thuốc có thể được tính toán nhờ phương pháp giải tích chập (deconvolution) [44].

Cơ sở của phương pháp này áp dụng cho thuốc TDKD như sau:

Nếu gọi:

• CôCt) là hàm số biểu thị nồng độ dược chất trong huyết tương theo

thời gian khi dùng thuốc ở dạng tiêm tĩnh mạch, dung dịch, hỗn dịch uống hay một dạng bào chế giải phóng dược chất nhanh

• C(t) là hàm số biểu thị nồng độ dược chất trong huyết tương theo thời gian khi dùng thuốc TDKD

• r^bsCt) là hàm số biểu thị tốc độ hấp thu dược chất theo thời gian

Thì:

C(t) là tích chập của hai hàm c§(t) và rabs(t);

C{t)= ịC s{t-u ).r^,^{u )d u

0

Nếu biết hai hàm C(t) và Cs(t), bằng phưoỉng pháp giải tích chập, sẽ tính được hàm r^bsCt) Kết quả có thể được tối ưu hoá thông qua tái tích chập (WLS Reconvolution)

Tổng lượng dược chất đã được hấp thu tới thời điểm t (A(t)) được tính theo công thức:

t

^ (0 =

Đối với thuốc TDKD, tương quan giữa tốc độ giải phóng dược chất in vitro và tốc độ hấp thu dược chất in vivo nhất thiết phải được thiết lập và chứng minh để có thể áp dụng trong kiểm soát chất lượng sản phẩm

o Việc đánh giá tốc độ và mức độ hòa tan in vitro rất có ý nghĩa trong

dự báo hấp thu và trong nghiên cứu TĐSH

o Định hướng trong nghiên cứu công thức, phương pháp sản xuất

o Là tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá sự đồng đều trong cùng một lô

và giữa các lô mẻ sản xuất

o Thông qua mối tương quan SKD in vitro-in vivo, sử dụng các chỉ tiêu

in vitro để triển khai, tối ưu hoá, đánh giá xây dựng công thức bào chế và qui trình sản xuất

1.3.2 Chỉ tiêu in vivo [42]

Chỉ tiêu in vivo là các thông số đáp ứng sinh học của chế phẩm, trong nghiên cứu SKD thưcmg sử dụng các thông số dược động học như AUC,

MRT thu được từ nghiên cứu in vivo

1.3.3 Tương quan in vitro - in vivo [3], [11], [24], [42], [44]

1.3.3.1 Khái niệm

Thuật ngữ tương quan in vitro- in vivo [11] lần đầu tiên xuất hiện trong y

văn do sự nhận thức về khái niệm SKD và việc xác định tốc độ hoà tan in vitro Tương quan in vitro- in vivo là xác lập quan hệ hợp lí giữa tính chất sinh học hoặc các thông số liên quan đến tính chất sinh học của dạng thuốc và tính chất lí hoá của dược chất trong dạng thuốc Tính chất sinh học gồm một hay nhiều thông số dược động học như AUC thu được sau khi dùng dạng thuốc Tính chất lí hoá biểu thị thông qua đặc tính hoà tan in vitro (có nghĩa

là % thuốc giải phóng ở những điều kiện đã cho) Quan hệ giữa 2 thuộc tính sinh học và lí hoá biểu thị về lượng

Với sự phát triển nhanh chóng của các chế phẩm thuốc TDKD, cần phải kiểm tra khái niệm tương quan in vitro - in vivo sâu hofn Không giống như thuốc giải phóng nhanh, thuốc TDKD không thể đặc trưng bằng các test hoà tan tại một thời điểm Hơn nữa , với thuốc TDKD, một bệnh nhân được theo dõi nồng độ máu đặc trưng trong một thời gian dài, thường là 12-24h Phải có một số trung bình in vitro để đảm bảo rằng mỗi mẻ của cùng một sản phẩm sẽ

có cùng một in vivo đồng nhất Đầu tiên khi xây tương quan in vitro- in vivo với thuốc TDKD người ta dùng khái niệm như với thuốc tác dụng nhanh Như

vậy việc so sánh một hoặc nhiều thông số dược động học với lượng dược chất giải phóng tại thời điểm đã cho và thu được tương quan theo từng điểm Mối tưcmg quan như thế cho thấy khi tăng hoặc giảm tốc độ hoà tan in vitro của dạng thuốc TDKD sẽ dẫn đến sự thay đổi trực tiếp tương ứng đặc tính của sản phẩm Tuy nhiên tương quan như vậy ít liên quan đến toàn thể đường cong nồng độ máu là yếu tố chính ảnh hưởng đến tác dụng của thuốc trên người bệnh.

Việc công nhận và sử dụng kĩ thuật tích chập cũng như tính toán mô men thống kê thể hiện ưu điểm vượt trội so với so sánh từng điểm Hai phương pháp này dùng tất cả các số liệu hoà tan và nồng độ máu có sẩn để xây dựng mối tương quan Như vậy ít nhất sẽ có 3 kĩ thuật xác định mối tương quan (tích chập, mô men thống kê và so sánh từng điểm) Có một sự khác nhau rõ rệt về lượng của tương quan thu được đối với mỗi phưcmg pháp Vì vậy, những phương pháp này đã được phân loại và thảo luận dựa trên ưu điểm của từng phương pháp về khả năng sử dụng như một công cụ dự báo

1.3.3.2 Các mức tương quan

Có 3 mức tương quan được xếp theo mức độ hữu ích giảm dần [11], [42] Khái niệm mức tương quan dựa trên khả năng phản ánh đường cong nồng độ máu sau khi dùng dạng thuốc Đó là quan hệ giữa đồ thị hoà tan và đồ thị nồng độ máu

trường hoà tan điển hình thường dùng trong bào chế Với cách tương quan này , đường cong hoà tan in vitro được so sánh với đưòfng cong hấp thu in vivo (có nghĩa là đường cong được tạo ra bằng giải tích chập của số liệu nồng độ máu) Điều này có thể được làm bằng việc dùng kĩ thuật mô hình phụ thuộc cân bằng khối như phưcmg pháp Loo- Riegelman hoặc bằng mô hình độc lập giải tích chập toán học (reconvolusion)

ư u điểm của tương quan mức A là:

- Tương quan được thiết lập giữa từng điểm với nhau, phản ánh toàn bộ đường cong nồng độ máu Điều này không có trong bất kỳ mức tương quan nào Do đó, trong tương quan mức A, đồ thị hoà tan in vitro có thể dùng thay thế cho đặc tính in vivo Vì vậy một sự thay đổi về nơi sản xuất, phương tiện sản xuất, nguồn cung cấp nguyên liệu, sự thay đổi chút ít về công thức và ngay cả hàm lượng của cùng một công thức có

thể điều chỉnh mà không cần nghiên cứu thêm ở người.

- Xác định được phương pháp kiểm soát chất lượng quan trọng (dự báo in vivo) cho dạng thuốc

- Giói hạn trên và giới hạn dưới của chuẩn kiểm soát chất lượng in vitro

có thể được điều chỉnh bằng phương pháp tích chập hoặc giải tích chập

b M ứcB

Dùng nguyên tắc thời điểm để so sánh thời gian hoà tan in vitro trung bình với thời gian lưu trú trung bình hoặc thời gian hoà tan in vivo tmng bình Giống như mức A, mức B dùng tất cả số liệu in vitro và in vivo nhưng không được xem như là tưofng quan từng điểm bởi vì không phản ánh đường cong nồng độ máu in vivo hiện tại (đồ thị in vivo có một số khác nhau vẫn tạo ra được thòi gian lưu trú trung bình như nhau) Vì vậy người ta không thể dựa trên một mình tương quan mức B để điều chỉnh việc sửa đổi công thức, thay đổi nơi sản xuất, thay đổi nguồn tá dược, Hơn nữa, số liệu in vitro trong

tương quan này cũng không thể điều chỉnh giới hạn trên và giới hạn dưới của chuẩn kiểm soát chất lượng.

c Mức c

So sánh từng điểm đcín giữa thời gian hoà tan in vitro có nghĩa (T50%, Tọộ ) với một thông số dược động học (như thể hiện tươngquan điểm đơn lẻ, không phản ánh toàn bộ đường cong nồng độ máụ Vì vậy tương quan này không dự đoán được đặc tính in vivo của chế phẩm và chỉ có ích như là một hưófng dẫn trong phát triển công thức hoặc là phương pháp quản lí chất lượng sản xuất Do những hạn chế của nó, tương quan mức c chỉ

có ích trong việc dự đoán đặc tính in vivo của thuốc và vai trò dự đoán cũng như là mức B trong việc điều chỉnh sản xuất và kiểm soát chất lượng

Mức A cung cấp nhiều thông tin nhất nên thường được ứng dụng để xác định mối tương quan SKD cho một công thức thuốc TDKD

Để xem xét mối tương quan có tuyến tính hay không có thể dùng phương trình : A = mB+C

Trong đó: A là các thông số hoà tan in vitro, ví dụ: % được chất hoà

tan tại thời điểm t

B là các thông số về SKD in vivo, ví dụ: mức độ hấp thu in vivọ

c , m là các hằng số

Ị3 3 3 M ụ c đích

Nghiên cứu tương quan in vitro - in vivo là để xác định có hay không một tương quan định lượng in vitro - in vivo, mà nếu có thì có thể sử dụng những thông số thu được từ kết quả nghiên cứu in vitro thay thế cho những nghiên

cứu in vivo vốn tiêu tốn rất nhiều tiền của, thời gian, nhân lực và làm tăng giá

thành sản phẩm của thuốc.

Một tưofng quan đã được xác định phải có tính chất dự đoán khả năng hấp thu in vivo một cách chính xác và ổn định từ những số liệu in vitro thu được Chỉ khi khả năng dự đoán được xác định mới có thể dùng các số liệu thu được thử nghiệm độ giải phóng dược chất in vitro thay cho thử nghiệm in vivo trong kiểm tra chất lượng thuốc TDKD Do đó, một tương quan in vitro- in vivo phải được chứng minh rằng có khả năng dự đoán các số liệu in vivo từ các kết quả thử nghiệm in vitro FDA qui định phải đánh giá khả năng dự đoán, hoặc ngược lại phải đánh giá sai số dự đoán Tuỳ thuộc vào phạm vi áp dụng của tưofng quan và tuỳ thuộc vào chỉ số trị liệu của dược chất, có hai phương pháp đánh giá chính là đánh giá nội suy và đánh giá ngoại suy.

Đánh giá nội suy chủ yếu dựa vào các số liệu thu thập được từ chính lô thuốc dùng trong thử nghiệm in vivo để xác định tương quan Đánh giá ngoại suy cần phải xác định trên các lô thử nghiệm bổ sung (lô thuốc không tham gia thử nghiệm in vivo)

Các thuốc có chỉ số trị liệu hẹp Ngoài các số liệu thu được trong thử nghiệm xây dựng tương quan, sai số dự đoán cần phải được đánh giá thêm trên số liệu in vitro của một lô bổ sung (đánh giá ngoại suy)

Các thuốc không thuộc loại có chỉ số trị liệu hẹp Trong nhiều trường hợp chỉ cần đánh giá sai số nội suy, sự đánh giá sai số dự đoán ngoại suy có thể thực hiện nhưng không bắt buộc, trong trường hợp này kết quả dự đoán từ lô thử nghiệm bổ sung không quan trọng lắm

Phương pháp đánh giá khả năng dự đoán: Mục tiêu của đánh giá khả

năng dự đoán là xem xét mức độ sai lệch giữa số liệu dự đoán vói số liệu thực nghiệm Mức độ sai lệch này được thể hiện bằng sai số dự đoán phần trăm

%PE được tính theo công thức:

13.3.4 Đánh giá khả năng dự đoán [3]

_ Giá trị thực - giá trị dự đoán

%PE = - — - -X 100

Giá trị thực

Dự đoán nội suy: Tất cả các tương quan cần phải được đánh giá khả năng

dự đoán nội suy Sự dự đoán này được thực hiện bằng cách xây dựng lại đường biểu diễn đồ thị nồng độ máu, hoặc tính toán lại tỷ lệ phần trăm thuốc được hấp thu tại mỗi thòi điểm (đối với tương quan mức A) hoặc tính toán lại và/hoặc AUC (đối với tương quan mức C), sau đó so sánh với giá trị thực nghiệm và đánh giá sai số dự đoán phần trăm %PE của các số liệu phải nhỏ hơn hoặc bằng 10%, %PE không đạt thì phải thực hiện dự đoán ngoại suy, nghĩa là dùng số liệu của một thử nghiệm giải phóng in vitro của một lô bổ sung để đánh giá %PE

Đánh giá khả năng dự đoán ngoại suy: Sự tương quan in vitro- in vivo có tầm quan trọng trong dự đoán hấp thu của các lô khác nhau trong quá trình sản xuất sản phẩm, do đó nên đánh giá khả năng dự đoán của các lô bổ sung, tuy nhiên sự đánh giá này chỉ bắt buộc đối với các thuốc chứa dược chất có chỉ số điều trị hẹp

Trên thực tế có khi không tìm được sự tương quan hoặc có tương quan nhưng không đạt sai số dự đoán Trong những trường hợp này có thể thay đổi giải phóng dược chất để có được tương quan có ý nghĩa

1.4 THEOPHYLIN VÀ CHÊ PHẨM THEOPHYLIN t á c d ụ n g

Công thức cấu tạo:

• Tên khoa học : 1,3 - dimethyl xanthin

hoặc 1,3 - dimethyl purin - 2, 6 [3H, 1H] dion

• Khối lượng phân tử', dạng khan 180,2; dạng monohydrat 198,2

• Nguồn gốc theophylin được chiết xuất từ chè hoặc được tổng hợp từ

cafein, urea

• Tính chất: theophylin là bột kết tinh trắng, không mùi, khó tan trong nước

(1/125), ethanol (1/80), trong các dung môi hữu cơ, dễ tan trong dung dịch acid vô cơ, hydroxyd kim loại kiềm, amoniac

1.4.1.2 P hư ơng p h á p định lượng theophylin tro n g dịch sinh học [1], [6],

[20], [26], [3 8 ]

Một số phương pháp định lượng theophylin được sử dụng:

- Phương pháp quang phổ tử ngoại

- Phưofng pháp sắc ký khí

- Các phương pháp miễn dịch

- Phưcrng pháp sắc khí lỏng: Thường sử dụng phương pháp HPLC,phưoỉng pháp này cho phép phát hiện nồng độ rất nhỏ theophylin (0,0 1-0,05 |ig/ml)

Trong thử nghiệm in vivo người ta có thể dùng dịch sinh học như nước bọt, nước tiểu, huyết thanh, huyết tương phụ thuộc vào mỗi thuốc thử nghiệm [2 1].

1.4.1.3 M ố i tương quan giữa nồn g độ theophylỉn tron g nước b ọ t và trong

huyết tương [16], [21 ], [29], [30]

M Danhof và D D Breimer [21] cho rằng nồng độ của dược chất trong nước bọt (Cs) luôn có một tỉ lệ cân xứng với nồng độ dược chất trong huyết tương (Cp) đối với một số thuốc Từ đó có thể thay thế huyết tương bằng nước bọt trong trường hợp cần kiểm soát nồng độ dược chất trong máu hoặc trong nghiên cứu dược động học Theo 2 tác giả trên thì tỉ lệ trung bình nồng độ trong nước bọt và trong huyết tương (Cs/Cp) của một số dược chất khi nghiên cứu liều đơn như sau:

là 0,52 ± 0,03 Knop và cộng sự (1975) khi nghiên cứu liều đofn thì tỉ lệ Cs/Cp

= 0,85 còn nồng độ theophylin ở trạng thái cân bằng thì Cs/Cp là 0,77 ± 0,07 Các kết quả cho thấy tỉ lệ Cs/Cp nằm trong khoảng từ 0,52- 0,85

Dvorchik và Vesell (1976) Homing và cộng sự (1977) [30] cho rằng khi

sử dụng nước bọt thay cho huyết tương trong kiểm soát thuốc hoặc trong nghiên cứu dược động học có ưu điểm sau:

- Việc lấy mẫu nước bọt đơn giản hơn lấy mẫu huyết tương Đặc biệt là khi lấy mẫu tiến hành trên trẻ em và người cao tuổi Việc lấy mẫu có thể tiến hành tại nhà người bệnh.

- Có một số thuốc nồng độ trong nước bọt bằng nồng độ thuốc trong

huyết tương ở dạng tự do mà chính nồng độ thuốc ở dạng tự do này mới

cho tác dụng điều trị Ví dụ : barbital, theophylin, tolutamid

Tuy nhiên cần chú ý rằng nồng độ thuốc trong nước bọt thấp hơn nồng

độ thuốc trong huyết tương nên phương pháp định lượng phải đủ nhạy và có

độ chính xác cao

Reynolds và cộng sự [30 ] cho rằng khi lấy mẫu nước bọt có lợi thế sau: Trong một thời gian ngắn có thể lấy được một thể tích nước bọt lớn, pH của nước bọt hầu hết nằm trong khoảng 6,8- 7,0 (Feller và cộng sự 1975) Còn theo Jusko và cộng sự (1975) thì hệ số biến thiên giữa các cá thể của nước bọt giảm hơn trong huyết tương

ở Việt Nam tác giả Trần Văn Thiên và cộng sự (2000) [16] cũng tiến hành nghiên cứu phân tích nồng độ theophylin trong nước bọt và huyết tương trên 6 NTN Khi uống 10 ml dung dịch chứa 0,1 g theophylin Mẫu máu và nước bọt được lấy tai cùng một thời điểm sau khi uống thuốc 1 h ( lấy 1 thời điểm) Kết quả định lượng cho thấy nồng độ theophylin trong nước bọt đạt 62% so với nồng độ theophylin trong huyết tương Trên cơ sở đó đã sử dụng nồng độ theophylin trong nước bọt thay thế cho nồng độ theophylin trong huyết tương để nghiên cứu SKD

Các nhà nghiên cứu cho rằng việc lấy mẫu nước bọt để định lượng nồng

độ theophylin trong dịch sinh học thay cho mẫu huyết tương mang lại lợi ích kinh tế, khoa học và có rất nhiều thuận lợi trong khâu lấy mẫu, xử lý mẫu, không đau do không phải can thiệp vào cơ thể Mặt khác vì theophylin có

trong nước bọt không bị liên kết với protein như ở trong huyết tương nên việc chiết theophylin dễ dàng và triệt để hcm trong huyết tương [21], [30].

1.4.1.4 Tác d ụ n g dược lý của theophylin và áp d ụ n g điều trị [2], [8], [17],

- Kích thích hô hấp trong suy tim và phù phổi cấp

- Điều trị chứng ngừng thở ở trẻ sơ sinh

- Giảm co thắt phế quản và đề phòng cơn co thắt trong các chứng hen phế quản cấp và mãn tính là chỉ định chủ yếu

1.4.1.5 Tác dụng phụ và độc tính

- Tác dụng tại chỗ: kích ứng đường tiêu hoá gây đau bụng, ỉa chảy

- Kích thích thần kinh trung ương gây đau đầu, buồn nôn

1.4.1.6 Dược động học

> Hấp thu:

Theophylin được hấp thu nhanh và hoàn toàn từ các dạng bào chế qui ước dùng qua đường uống Dạng TDKD do thiết kế đặc biệt, theophylin được hấp thu từ từ Một chế phẩm TDKD có mức độ hấp thu 80% đã được coi là thành công về mặt bào chế

Thời gian đạt Qax là: dưới 2 h đối vói các dạng giải phóng nhanh, 5 - 7 h đối với dạng TDKD

> Phân bố:

Tỉ lệ liên kết với protein huyết tương ở người lớn khoẻ mạnh khoảng 60%, ở trẻ em khoảng 30%, bệnh nhân suy gan khoảng 35%

Thể tích phân bố biểu kiến 0,3 - 0,7 1/kg, trung bình 0,45 - 0,5 1/kg

Theophylin qua được hàng rào rau thai và có trong sữa mẹ

Theophylin phân bố trong nước bọt với tỉ lệ bằng khoảng 5 0 - 85% trong huyết tương [30]

1.4.2 C hế phẩm theophylin tác dụng kéo dài [9], [15], [16], [28]

Do đặc tính riêng, theophylin là một dược chất được bào chế dưới dạng TDKD nhiều hơn tất cả các dược chất khác So vói dạng thuốc qui ước, theophylin TDKD có nhiều ưu điểm như:

• Duy trì nồng độ dược chất trong máu ở trong vùng điều trị, do đó:

- Phòng các cơn hen đột ngột xuất hiện gây nguy hiểm cho người bệnh, đặc biệt là về đêm

- Giảm tác dụng không mong muốn của thuốc

• Nâng cao được SKD, đặc biệt có lợi đối với bệnh nhân có thời gian bán thải ngắn hoặc cơn hen hay xuất hiện

Hiện nay trên thị trường dược phẩm Mỹ có hơn 150 biệt dược chứa theophylin trong đó có trên 50 chế phẩm TDKD [9] ở nước ta, trên thị trường

đã có một số biệt dược theophylin TDKD của các hãng nước ngoài; một vài

chế phẩm theophylin TDKD trong nước còn đang ở trong giai đoạn nghiên

cứu in vivo và thử nghiệm lâm sàng Sau đây là một vài thông tin về các chế phẩm này:

• Theostat: dạng viên nén theophylin TDKD sử dụng ngày 2 lần của

hãng INAVA (Pháp) Chế phẩm này là một sản phẩm có uy tín trên thị trường

từ lâu

• E u p h yllin e L.A: đây cũng là một chế phẩm theophylin TDKD có uy tín

trên thị trường Euphylline L.A là dạng viên nang TDKD, sử dụng ngày 2 lần của hãng Byk France SA sản xuất với các tá dược chính là: polyvidon, ethyl cellulose, Eudragit L và s, acid stearic, triacetin

• Theo-KD: dạng viên nén theophylin TDKD, là sản phẩm của Bộ môn

Bào Chế Trường đại học Dược Hà Nội, đã được đánh giá SKD và TĐSH với chế phẩm Theostat và đã được thử nghiệm lâm sàng ở bệnh viện Bạch mai

• Viên nang theophylin TDKD: dạng viên nang được bào chế từ pellet

theophylin TDKD, do Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội nghiên cứu xây dựng công thức Kết quả khảo sát in vitro cho thấy: viên nang theophylin TDKD giải phóng dược chất khoảng 12 giờ, tốc độ giải phóng theophylin tương đối hằng định theo thời gian và giống với viên Euphylline L.A đối chiếu Nghiên cứu SKD và TĐSH cho viên nang theophylin TDKD đang được thực hiện Luận văn này đóng góp một phần nhỏ trong bước đầu nghiên cứu SKD của viên nang theophylin TDKD, dùng viên Euphylline L.A làm chế phẩm đối chiếu

PHẦN 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

• Theophylin monohydrat (Trung Quốc)

• Theobromin (Trung Quốc)

• Isopropanol (loại dùng cho HPLC - Prolabo)

• Diclomethan (loại dùng cho HPLC - Prolabo)

• Methanol (loại dùng cho HPLC - Merck)

• Acid acetic (loại dùng cho HPLC - Merck)

• Amoni clorid (loại dùng cho HPLC - Merck)

• Nang Theophylin 200 mg TDKD do Bộ môn Bào chế nghiên cứu (viên T)

• Nang Euphylline L,A 200 mg (Laboratoires Byk France S.A) (viên R)

> Máy ly tâm Jouan (Đan Mạch)

> Máy siêu âm Branson (Mỹ)

> Máy lắc Labinco

P T ủ siêu lạnh Frigos (Đan Mạch) để bảo quản mẫu sinh học

> Hệ thống thử độ hoà tan Valken- Varian (Mỹ)

18 NTN khoẻ mạnh, không hút thuốc lá, không có tiền sử dị ứng thuốc, tuổi từ 18 - 24, cân nặng 45 - 56 kg được dùng trong đánh giá SKD NTN được kiểm tra sức khoẻ trước khi thử thuốc và dùng thuốc thử nghiệm theo qui định

• 12 NTN chia làm hai nhóm một cách ngẫu nhiên vói 3 giai đoạn thử như sau:

R: viên nang Euphylline L.A 200 mg

T: viên nang theophylin TDKD 200 mg

O: dung dịch chứa 1 0 0 mg theophylin trong 1 0 0 ml nước

• Yêu cẩu đối với NTN: trước thời gian thử nghiệm một tuần không được

uống bất kỳ một loại thuốc nào Trong vòng 3 ngày trước và trong thời gian thử nghiệm không được uống các loại nước uống có chứa các hoạt chất nhóm xanthin (chè, cà phê, nước giải khát chứa cafein) NTN đã được phổ biến về mục tiêu nghiên cứu, cách cho uống thuốc, thời gian lấy mẫu máu, mẫu nước bọt, số lượng và lượng mẫu mỗi lần lấy và các tác dụng phụ có thể xảy ra khi tham gia thử nghiệm

NTN ăn nhẹ sau 2 giờ, ăn chính sau 4 giờ và 10 giờ Khoảng thời gian giữa 2 giai đoạn thử thuốc liên tiếp là 1 tuần

2.4.2 Lấy và bảo quản mẫu sinh học

2.4.2.1 M ẫu nước bọt

Mẫu nước bọt được lấy tại các thời điểm: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2; 3; 4; 6; 8; 12; 16; 24; 28; 32 giờ sau khi uống thuốc Mỗi lần lấy 2 ml nước bọt, bảo quản ở - 2 0° c , thời gian bảo quản mẫu không quá 1 tuần

2.4.2.2 M ẫu huyết tương

Mẫu máu (3ml) lấy từ tĩnh mạch khuỷu tay NTN, được chống đông bằng heparin, ly tâm 3000 vòng/phút trong vòng 15 phút để tách lấy huyết tương, bảo quản ở nhiệt độ - 20°c cho tới khi định lượng thời gian bảo quản không quá 1 tuần

2.4.3 Chiết xuất và định lượng theophylin từ dịch sinh học

2.4.3.1 Phương pháp chiết xuất

a Từ nước bọt

Lấy mẫu ra để tan băng, ly tâm lấy dịch trong Lấy 1 ml dịch trong nước bọt, thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn nội theobromin nồng độ 100 |j,g/ml Chiết bằng hỗn hợp dung môi isopropanol - diclomethan (5:95) Pha hữu cơ được