Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang cefaclor stada 250 sản xuất tại việt nam

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng thuốc trong dịch s

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Tạ Mạnh Hùng

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

VIÊN NANG CEFACLOR STADA® 250

SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

Luận văn Thạc sỹ Dược học

Hà Nội - 2006

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Tạ Mạnh Hùng

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

VIÊN NANG CEFACLOR STADA® 250

SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

MÃ SỐ: 60.73.15 Luận văn Thạc sỹ Dược học

NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1- TS Phùng Thị Vinh 2- PGS.TS Trần Tử An

Hà Nội - 2006

LỜI CẢM ƠN

Tụi xin chõn thành bày tỏ lũng kớnh trọng và biết ơn sõu sắc tới T.S Phựng Thị Vinh - Trưởng phũng Dược lý - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương và PGS.TS Trần Tử An -

Trưởng bộ mụn Phõn tớch - Đại học Dược Hà Nội, đó tận tỡnh hướng dẫn, quan tõm giỳp

đỡ tụi trong suốt quỏ trỡnh thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này

Tụi xin tỏ lũng biết ơn chõn thành tới Ban Giám đốc cựng toàn thể cỏn bộ, nhõn viờn Phũng Dược lý - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương và Cụng ty Dược VTYT Phỳ Yờn

đó tạo điều kiện và giỳp đỡ tụi trong suốt quỏ trỡnh thực hiện đề tài để hoàn thành luận văn này

Tụi chõn thành cảm ơn cỏc thầy, cỏc cụ ở Phũng đào tạo sau đại học, Bộ mụn Phõn tớch - Đại học Dược Hà Nội, đó tạo điều kiện, giỳp đỡ tụi trong quỏ trỡnh học tập và

nghiờn cứu

Tụi xin tỏ lũng biết ơn tới những người thõn trong gia đỡnh, cựng toàn thể bạn bố đồng nghiệp đó động viờn giỳp đỡ tụi trong quỏ trỡnh học tập và nghiờn cứu

Một lần nữa tụi xin chõn thành cảm ơn!

Tạ Mạnh Hựng

TĐSH : Tương đương sinh học

T max : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa

ANOVA : Phân tích phương sai (Analysis of Variance)

AUC : Diện tích dưới đường cong (Area Under Curve)

C max : Nồng độ thuốc tối đa (Maximum Concentration)

FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food

and Drug Admistration)

GCP : Thực hành lâm sàng tốt (Good Clinical Practice)

GLP : Thực hành phòng thí nghiệm tốt (Good Laboratory Practice)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

HQC : Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High Quality Control sample)

IS : Nội chuẩn (Internal Standard)

LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification )

LQC : Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control sample)

MQC : Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Middle Quality Control

sample)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối ( Relative Standard Deviation)

SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

ULOQ : Giới hạn định lượng trên (Upper limit of Quantification)

USP : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia)

WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)

MỤC LỤC

Trang

1.1 Sinh khả dụng và tương đương sinh học 3

1.1.1 Khái niệm sinh khả dụng và tương đương sinh học 3

1.1.2 Đánh giá sinh khả dụng - tương đương sinh học 3

1.1.3 Tình hình nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH trên thế giới

1.2.3 Các phương pháp HPLC định lượng cefaclor 15

Phần 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 20

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi 20

2.2.1 Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân

2.2.1 Trong đánh giá TĐSH hai chế phẩm viên nang cefaclor

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 23

2.4.2 Đánh giá TĐSH viên nang Cefaclor Stada 250 27

3.1 Kết quả xây dựng - thẩm định phương pháp phân tích 30

3.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích 30

3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích 36

3.2 Kết quả đánh giá TĐSH viên nang Cefaclor Stada 250 50

3.2.1.Tuyển chọn nguời tình nguyện 50

3.2.3 Định lượng cefaclor trong máu người tình nguyện

sau khi uống thuốc thử và thuốc chứng

54

3.2.4 Phân tích DĐH và đánh giá TĐSH 57

3.3.1 Về phương pháp phân tích cefaclor trong huyết tương NTN 61

3.3.2 Về đánh giá TĐSH viên nang Cefaclor Stada 250 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

1.1 Một số công trình định lượng cefaclor bằngHPLC 16

3.1 Kết quả kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký 37

3.2 Diện tích pic mẫu trắng tại thời điểm trùng với Rt của CEF và ACE 39 3.3 Sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội và nồng độ cefaclor chuẩn pha trong huyết tương 40

3.4 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 41

3.5 Kết quả khảo sát độ đ úng, độ lặp lại trong ngày 42

3.6 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày 43

3.7 Hiệu suất chiết nội chuẩn 44

3.8 Kết quả xác định hiệu suất chiết cefaclor 45

3.9 Độ ổn định thời gian ngắn của dung dịch chuẩn, nội chuẩn gốc 46

3.10 Độ ổn định dài ngày của dung dịch chuẩn, nội chuẩn gốc 47

3.11 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu sau3 chu kỳ đông–rã đông 48 3.12 Xác định độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu 48

3.13 Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 49

3.14 Kết quả xét nghiệm huyết học của người tình nguyện 51

3.15 Kết quả xét nghiệm sinh hoá, miễn dịch của người tình nguyện 51

3.16 Kết quả khám lâm sàng tổng quát, đánh giá sức khoẻ NTN 52

3.17 Quá trình dùng thuốc của người tình nguyện 52

3.18 Nồng độ cefaclor trong huyết tương của từng cá thể sau khi uống liều đơn thuốc thử Cefaclor Stada 250mg x 2 viên 55

3.19 Nồng độ cefaclor trong huyết tương của từng cá thể sau khi uống liều đơn thuốc chứng Ceclor 250mg x 2 viên 56

3.20 Các thông số dược động học Cmax, AUC và Tmax của NTN sau

khi uống liều đơn 500mg của 2 thuốc thử và thuốc chứng 57

3.21 Hằng số tốc độ thải trừ và thời gian bán thải của NTN sau khi uống liều đơn của 2 thuốc thử và thuốc chứng 57

3.22 Phân tích phương sai với biến phụ thuộc là ln[Cmax] 58

3.23 Phân tích phương sai với biến phụ thuộc là ln[AUC 0-∞] 59

3.24 So sánh giá trị Tmax theo phương pháp thống kê không tham số 60

3.25 DĐH của Ceclor trên 12 NTN Việt Nam và số liệu DĐH đã được công bố của một số tác giả 63

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn xử lý tủa protein bằng HClO4 31

3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn xử lý tủa protein bằng MeOH 31

3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn xử lý tủa protein bằng HClO 4 và loại tạp bằng dicloromethan 31

3.4 Sắc ký mẫu chuẩn với cột Gemini 33

3.5 Sắc ký mẫu chuẩn với cột LiChrospher 33

3.6 Sắc ký mẫu chuẩn và thông tin về pic cefaclor (cột Gemini– MeCN/MeOH/ Đệm phos phat pH3,1 tỷ lệ 10:14:76) 34

3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn CEF và nội chuẩn trong pha động 35

3.8 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng 37

3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (R t≈ 5,8 phút - nồng độ 0,25µg/mL) 37

3.10 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có nội chuẩn (Rt ≈ 7,1 phút) 38

3.11 Sắc ký đồ huyết tương NTN tại thời điểm trước khi uống thuốc 38

3.12 Sắc ký đồ huyết tương NTN trước khi uống thuốc có thêm nội chuẩn 38

3.13 Sắc ký đồ huyết tương NTN 2,5 giờ, sau khi uống 500mg cefaclor 39

3.14 So phổ UV của pic có Rt = 5,88 phút trong sắc ký đồ mẫu thử 39

3.15 Lấy máu người tình nguyện 53

3.16 Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian của 12 NTN sau khi uống liều đơn hai mẫu thuốc thử và chứng 54

cơ sở để chọn thuốc thay thế hay hiệu chỉnh liều dùng cho phù hợp với từng bệnh nhân trong thực hành lâm sàng

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu

và phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,…) Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thường rất thấp; nền mẫu có nhiều thành phần; tạp chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích thuốc Hơn nữa, sau khi vào cơ thể hoạt chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau Chất chuyển hoá thường có cấu trúc và tính chất hoá lý tương tự với hoạt chất nên việc phân tách để định lượng hoạt chất gặp nhiều khó khăn [28], [31] Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được thẩm định rất chặt chẽ theo những qui định riêng để đảm bảo kết quả thử nghiệm đúng và chính xác [28], [38]

Hiện nay, qui chế đăng ký thuốc của nhiều nước trên thế giới, qui định đối với các thuốc mới hồ sơ đăng ký phải có đầy đủ kết quả nghiên cứu SKD; đối

với các thuốc generic phải có kết quả đánh giá TĐSH [11], [26], [32], [36] Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, mới chỉ có một số đề tài nghiên cứu về SKD và TĐSH được thực hiện [1], [4], [5], [7], [9]; tuy nhiên khi Việt Nam đã trở thành thành viên của WTO thì yêu cầu sớm ban hành qui chế cũng như tổ chức đánh giá TĐSH ngày càng trở nên cấp thiết

Xuất phát từ nhu cầu triển khai đánh giá TĐSH cho chế phẩm thuốc sản xuất trong nước cũng như để góp phần xây dựng, ban hành các qui chế, hướng dẫn thử SKD và TĐSH ở Việt Nam; triển khai đánh giá SKD và TĐSH tại các

cơ sở nghiên cứu Y – Dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang Cefaclor Stada 250mg sản xuất tại Việt Nam” với các nội dung sau:

1 Nghiên cứu xây dựng qui trình xử lý mẫu và định lượng cefaclor trong huyết tương người tình nguyện (NTN) bằng phương pháp HPLC

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng cefaclor trong huyết tương NTN, từ đó xác định các thông số dược động học và đánh giá TĐSH chế phẩm viên nang cefaclor 250mg sản xuất trong nước

Chúng tôi hy vọng, kết quả nghiên cứu cùng với việc xác định TĐSH của 1 dược phẩm sản xuất trong nước so với thuốc nước ngoài, sẽ cung cấp các dữ liệu cần thiết cho các nhà quản lý để có thể sớm ban hành hướng dẫn, qui chế đánh giá TĐSH cho các chế phẩm generic ở Việt Nam đồng thời giúp các doanh nghiệp dược trong nước nâng cao chất lượng thuốc của mình

Phần 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

1.1.1 Khái niệm sinh khả dụng và tương đương sinh học

Sinh khả dụng : là đại lượng chỉ tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ một chế

phẩm bào chế vào tuần hoàn chung và đưa đến nơi tác dụng [2], [17], [19], [40]

Trong đó, mức độ hấp thu được biểu thị bằng diện tích dưới đường cong nồng độ – thời gian (AUC) và nồng độ thuốc tối đa (Cmax); tốc độ hấp thu được xác định bằng thời gian đạt đến nồng độ thuốc tối đa (Tmax)

Sinh khả dụng in vivo được biểu thị dưới 2 khái niệm: SKD tuyệt đối và SKD tương đối, trong đó SKD tương đối thường được dùng nhiều hơn trong nghiên cứu

phát triển các sản phẩm thuốc generic

Tương đương sinh học: là khái niệm được sử dụng để chỉ các sản phẩm cùng

dạng bào chế, chứa một lượng dược chất như nhau có SKD tương tự nhau trong cùng điều kiện thử nghiệm [17], [19], [40]

TĐSH là cơ sở cho việc chọn lựa và thay thế thuốc trong lâm sàng, hai chế phẩm đạt TĐSH có thể được sử dụng thay thế nhau trong điều trị Kết quả đánh giá TĐSH, khẳng định chất lượng đích thực của sản phẩm thuốc [8], [19]

1.1.2 Đánh giá sinh khả dụng – tương đương sinh học

Đánh giá TĐSH là so sánh khả năng sinh học của chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu trong cùng điều kiện thử Có hai phương pháp đánh giá TĐSH:

− Đánh giá TĐSH in vitro: thường dùng phép thử độ hoà tan; so sánh tốc độ

và mức độ hoà tan hoạt chất của thuốc thử với thuốc chứng Đối với một số dược chất có độ tan thấp, tính thấm kém phải chứng minh có sự tương quan giữa độ hòa tan với các dữ liệu SKD in vivo trên người [19], [40], [43]

− Đánh giá TĐSH in vivo: So sánh một số thông số DĐH hoặc hiệu quả sinh học trên cơ thể sống, có thể thực hiện trên NTN hoặc trên động vật thí nghiệm (ĐVTN) [19], [29], [40]

Hiện nay có 5 mô hình đánh giá TĐSH đang được áp dụng:

+ Thử in vivo trên NTN ;

+ Thử in vivo trên ĐVTN có tương quan với các dữ liệu in vivo trên người; + Thử in vivo trên ĐVTN không có tương quan với các dữ liệu in vivo trên người;

+ Thử in vitro mà có tương quan với các dữ liệu SKD in vivo trên người;

+ Thử in vitro không có tương quan với các dữ liệu SKD in vivo trên người; Thứ tự ưu tiên được xếp theo mức độ có ý nghĩa trên người Có thể áp dụng

mô hình thử tiếp sau nếu vì một lý do nào đó mô hình đã nêu trước không thực hiện được [19], [29], [40]

Đánh giá TĐSH in vitro có thể được sử dụng đối với những chế phẩm có chứa dược chất có độ tan cao, tính thấm tốt (thuộc nhóm I trong hệ thống phân

loại sinh dược (Biopharmaceutical Clasification System – BCS) [36], [43]

Đánh giá TĐSH in vivo là thực hiện so sánh sự đáp ứng sinh học của thuốc cần nghiên cứu với một thuốc đối chứng trên cơ thể người hoặc sinh vật sống Nói một cách cụ thể hơn, phương pháp đánh giá là so sánh các thông số dược động học (Cmax, AUC, Tmax ) của thuốc nghiên cứu với thuốc đối chứng hoặc đánh giá so sánh hiệu quả sinh học của các thuốc trong cùng điều kiện [17], [19], [40]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu đánh giá SKD - TĐSH trên thế giới và ở Việt Nam

Ở các nước phát triển và một số nước đang phát triển việc đánh giá SKD và TĐSH là rất phổ biến, vì kết quả nghiên cứu SKD và TĐSH là một trong những nội dung cần có trong hồ sơ đăng ký cấp phép sản xuất và lưu hành thuốc Từ

năm 1977, cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ đã ban hành qui chế về SKD

và TĐSH của thuốc, trong đó qui định:

− Những chế phẩm bắt buộc phải có hồ sơ đánh giá SKD và TĐSH khi đăng

ký xin phép lưu hành

− Những trường hợp được miễn thử TĐSH

− Hướng dẫn về thực hành TĐSH và các tiêu chuẩn đánh giá

Hiện nay các nước và khu vực như Mỹ, EU, Nhật Bản, Brazil, Australia, Canada,… và ngay cả một số nước trong khu vực như Thái Lan, Singapore, Philippin, Malaysia, đều có qui chế đánh giá SKD và TĐSH [11], [26], [27], [30], [32], [33], [36] Trong những năm gần đây, tổ chức Y tế Thế giới đã và đang xây dựng các hướng dẫn cho nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH [42], [43] Các bản dự thảo của hướng dẫn đã khuyến cáo cần thử nghiệm TĐSH in

vivo trong một số trường hợp như:

− Thuốc giải phóng kéo dài có tác dụng toàn thân

− Thuốc giải phóng nhanh tác dụng toàn thân, nhưng:

+ Có khoảng điều trị hoặc khoảng an toàn hẹp

+ Có dược động học phức tạp do hấp thu, DĐH không tuyến tính, chuyển hoá cao (lớn hơn 70%), đào thải trước khi vào máu

+ Tính chất hoá lý của dược chất không thuận lợi cho sự hấp thu hoạt chất (độ tan thấp, không ổn định, tính thấm kém…)

+ Có vấn đề về SKD do cấu trúc hoặc công thức bào chế

+ Tỷ lệ dược chất/tá dược nhỏ hơn 5%

− Thuốc tác dụng toàn thân đưa vào cơ thể qua các đường khác nhau như qua da, trực tràng

Đồng thời, WHO cũng đang xây dựng những chỉ tiêu để xem xét miễn thử TĐSH in vivo cho một số trường hợp như thuốc có các hàm lượng khác nhau với cùng một tỷ lệ, công thức bào chế của cùng một nhà sản xuất [43]

*Tình hình nghiên cứu trong nước:

Hiện nay ở Việt Nam chưa có văn bản chính thức nào hướng dẫn về việc đánh giá TĐSH đối với các chế phẩm thuốc Hồ sơ đăng ký thuốc chưa yêu cầu cung cấp kết quả nghiên cứu về TĐSH

Khoảng 2 – 3 năm trở lại đây, những nghiên cứu về lĩnh vực này đã được quan tâm nhiều hơn Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu cũng mới chỉ được thực hiện tại các trường đại học và một số viện nghiên cứu với mục đích đào tạo [1], [5], [7], [9] Việc ứng dụng các qui trình phân tích cũng như tiến hành các đánh giá thử nghiệm theo nhu cầu thực tế (doanh nghiệp, cơ sở điều trị) còn rất hạn chế Một trong những nguyên nhân là do chưa có qui chế, hướng dẫn; cán bộ được đào tạo chuyên sâu về nghiên cứu, đánh giá SKD và TĐSH còn thiếu Một khó khăn nữa khi thực hiện những nghiên cứu SKD và TĐSH là nồng độ thuốc trong các dịch sinh học thường rất thấp nên đòi hỏi cơ sở nghiên cứu phải có đủ các phương tiện phân tích hiện đại, có độ nhạy cao; cán bộ phân tích phải được đào tạo và có kinh nghiệm chuyên sâu Phòng thí nghiệm phải được quản lý theo

các tiêu chuẩn thực hành phòng thí nghiệm tốt (GLP) và ISO để đảm bảo chất

lượng trong nghiên cứu

Cho tới nay, cơ sở tham gia nghiên cứu phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học cũng như đánh giá TĐSH chưa nhiều Một số đề tài nghiên cứu xác định nồng độ thuốc trong dịch sinh học thì phần thẩm định phương pháp phân tích chưa được thực hiện một cách đầy đủ Quá trình nghiên cứu, chưa tuân

thủ đầy đủ các qui chế về thực hành lâm sàng tốt (GCP) trong lấy mẫu và GLP

trong phân tích mẫu Vì vậy, các kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệm trong nước, khó có thể được công nhận và chấp thuận bởi các nước trong khu vực cũng như trên thế giới

1.1.4 Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

Tổ chức Y tế thế giới, hiệp hội các nước Đông Nam Á, và một số nước đã có ban hành tài liệu hướng dẫn, quy định chung cho việc đánh giá SKD và TĐSH [11], [27], [30], [33], [36], [42]

Nói chung, các nghiên cứu SKD và TĐSH in vivo phải tuân thủ theo các qui chế GCP; GLP và phải đảm bảo vấn đề đạo đức trong khi tiến hành Nghiên cứu chỉ được bắt đầu khi được sự chấp thuận của hội đồng đạo đức [40], [41]

Hội đồng đạo đức (HĐĐĐ) bao gồm các chuyên gia đầu ngành, các nhà khoa học độc lập với nhóm nghiên cứu, bác sỹ lâm sàng và người đại diện cho quyền lợi của NTN Hội đồng được thành lập để đảm bảo nghiên cứu đánh giá SKD và

TĐSH nếu được tiến hành, sẽ tuân thủ đầy đủ ‘đạo đức trong nghiên cứu Y –

Sinh học’ Hội đồng xem xét các khía cạnh đạo đức và khoa học của nghiên cứu

như mục đích, sự cần thiết phải tiến hành nghiên cứu; tính khoa học của đề cương nghiên cứu; sự đảm bảo quyền lợi và các biện pháp phòng ngừa các nguy

cơ có thể xảy ra đối với NTN của nhóm nghiên cứu, …Vì vậy, trước khi tiến hành đánh giá SKD và TĐSH, nhóm nghiên cứu phải xây dựng đề cương nghiên cứu, nộp đơn xin đánh giá SKD và TĐSH lên thường trực HĐĐĐ

Ngoài vấn đề đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu, các qui định; hướng dẫn

về đánh giá SKD và TĐSH bao gồm những nội dung cơ bản và cụ thể sau:

1.1.4.1 Quy định về chế phẩm thử và đối chứng

– Thuốc đối chứng: Thuốc đối chứng được chọn nên là thuốc phát minh hoặc

một chế phẩm có uy tín đang lưu hành trên thị trường [11], [17], [43] FDA, quy định khi đánh giá chế phẩm viên nang CEF, thuốc đối chứng là Ceclor

(Lily&Lily) [34]

– Thuốc thử (thuốc generic): Thuốc nghiên cứu phải được sản xuất từ lô nghiên

cứu sản xuất công nghiệp với cỡ lô bằng khoảng 10% cỡ lô sẽ được thiết kế cho

sản xuất hoặc tối thiểu 100.000 viên [11], [17], [43]

1.1.4.2 Thiết kế nghiên cứu

Trong đánh giá TĐSH, để hạn chế sự ảnh hưởng của yếu tố cá thể, thường áp dụng thiết kế nghiên cứu chéo Thiết kế chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn (ô vuông la tinh 2 x 2)

áp dụng khi cần so sánh 1 thuốc thử với 1 thuốc chứng; hoặc chéo, 3 thuốc, 3 giai đoạn (3 x 3) khi cần so sánh 2 thuốc thử với 1 thuốc đối chứng [19], [40]

Đánh giá SKD và TĐSH có thể thực hiện theo mô hình thiết kế đơn liều hoặc

đa liều Với CEF, USP 26 hướng dẫn thử đơn liều, 2 giai đoạn [34]

1.1.4.3 Đối tượng thử (subjects)

Nghiên cứu SKD và TĐSH in vivo tốt nhất là được đánh giá trên NTN Với các thuốc có độc tính cao, thuốc có nồng độ trong máu thấp hoặc khi thăm dò trong quá trình nghiên cứu phát triển sản phẩm, đánh giá SKD in vivo có thể được tiến hành trên động vật thí nghiệm [17], [29], [40]

Trong nghiên cứu SKD và TĐSH, đa số trường hợp thường chọn NTN là nam giới khoẻ mạnh (một số trường hợp đặc biệt có thể dùng nhóm đối tượng khác), tuổi thông thường từ 18 – 40 tuổi Trọng lượng, chiều cao nằm trong khoảng tiêu chuẩn trung bình ± 10% NTN khoẻ mạnh, không có tiền sử về bệnh tim mạch, bệnh gan, bệnh đường tiêu hoá, bệnh chuyển hoá hoặc bệnh về hệ thần kinh NTN được kiểm tra sức khoẻ trước khi tham gia vào thử nghiệm bao gồm các chỉ tiêu: khám lâm sàng tổng quát, huyết áp, nhịp tim, chức năng gan, thận, phổi và công thức máu, tất cả các chỉ số phải trong giới hạn bình thường và các xét nghiệm HbsAg, HIV cho kết quả âm tính Khi thử những thuốc đặc biệt,

có thể phải kiểm tra thêm một số chỉ tiêu khác, ví dụ như đường huyết khi thử nghiệm những thuốc có ảnh hưởng đến đường huyết NTN không có tiền sử về

dị ứng thuốc và hạ huyết áp tư thế; không được dùng bất kỳ thuốc gì trong vòng

2 tuần trước và trong quá trình thử nghiệm; không nghiện rượu, bia, thuốc lá; không sử dụng chất gây nghiện Trong quá trình thử nghiệm không được sử dụng thuốc lá, rượu và những thức uống khác có chứa cafein NTN được thông

tin đầy đủ về quá trình nghiên cứu; mục đích của nghiên cứu; tác dụng dược lý của thuốc; các rủi ro có thể xảy ra khi sử dụng thuốc, khi lấy máu; quyền lợi và trách nhiệm khi tham gia nghiên cứu NTN tự nguyện tham gia nghiên cứu và ký

vào Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu theo mẫu đã được Hội đồng

đạo đức thông qua Các thông tin về NTN cùng kết quả xét nghiệm, nghiên cứu

sẽ được giữ bí mật trong hồ sơ nghiên cứu Tên, địa chỉ, hình ảnh NTN sẽ không được công bố trong các bản báo cáo kết quả, báo, tạp chí nếu không được sự đồng ý của NTN [11], [17], [27], [30], [33], [37], [40], [42]

Hầu hết các tài liệu đều hướng dẫn đối tượng thử phải nhịn đói khoảng 10 giờ trước khi uống thuốc Tuy nhiên, trong một số trường hợp cần phải thực hiện trên cả tình trạng no và nhịn đói [11], [36]

Số lượng NTN phải đủ theo yêu cầu và được tính theo nguyên tắc dùng với

số lượng nhỏ nhất cá thể mà vẫn đảm bảo yêu cầu mức độ tin cậy trong tính thống kê của phép thử Số lượng có thể thay đổi tuỳ từng thuốc và các quy định

liên quan nhưng không nên ít hơn 12 [30] USP 26 qui định, với chế phẩm viên

nang CEF thử TĐSH trên 24 NTN, các tình nguyện viên tham gia thử nghiệm phải nhịn đói qua đêm và ăn sau khi uống thuốc 4 giờ [34]

1.1.4.4 Thời điểm lấy mẫu

Thiết kế thời điểm lấy mẫu có ý nghĩa quan trọng để thu được đường cong SKD đáp ứng yêu cầu Đường cong SKD phải thể hiện rõ pha hấp thu và pha thải trừ Trong đó, nên có ít nhất 3 điểm ở pha hấp thu, 3 điểm xung quanh Cmax

và trên 6 điểm ở pha thải trừ Tổng số điểm lấy mẫu nên nhiều hơn 12 Thời gian lấy mẫu phải kéo dài tới 3 – 5 lần thời gian bán thải của thuốc hoặc khi nồng độ trong máu thấp hơn 1/10 – 1/30 nồng độ Cmax Quá trình lấy mẫu máu phải được thực hiện trong phòng có bác sĩ lâm sàng và đủ điều kiện chăm sóc y tế, nếu có phản ứng phụ xảy ra, cần phải xử trí và điều trị kịp thời [41] Toàn bộ quá trình lấy mẫu phải tuân thủ GCP

Với chế phẩm viên nang CEF, USP 26 hướng dẫn lấy máu 12 điểm bao gồm

1 điểm tại thời điểm ban đầu (ngay trước khi uống) và 11 điểm sau khi uống [34]

1.1.4.5 Tiêu chuẩn đánh giá TĐSH [11], [27], [30], [33], [34], [37], [42]:

* Xác định các thông số DĐH cơ bản:

– Cmax và Tmax: Số liệu thu được trực tiếp từ kết quả thí nghiệm

– AUC0-tn (diện tích dưới đường cong nồng độ – thời gian từ thời điểm 0 đến thời điểm t) được tính theo phương pháp hình thang, với tn là thời điểm lấy mẫu cuối cùng có thể định lượng được

– AUC0-∞ (diện tích dưới đường cong nồng độ – thời gian từ thời điểm 0 đến vô cùng) được tính toán theo công thức:

AUC0-∞ = AUC0-tn + Ctn/λz

Trong đó:

+ Ctn : Nồng độ của thuốc tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng

+ λz : Hằng số tốc độ thải trừ (hệ số góc đường hồi qui giữa lg[nồng độ]

và thời gian)

* Tiêu chuẩn đánh giá TĐSH đối với nghiên cứu chéo, đơn liều, hai thuốc, hai giai đoạn, hai trình tự thử thuốc:

– Với Cmax và AUC (số liệu có thể chuyển logarit):

+ Phân tích phương sai đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố như trình tự, giai đoạn, thuốc, cá thể tới kết quả thử nghiệm

+ Tính khoảng tin cậy 90% của sự chênh lệch giữa giá trị trung bình của thuốc thử và thuốc đối chứng Nếu giới hạn khoảng tin cậy nằm trong khoảng 80 – 125 % thì hai chế phẩm được coi là TĐSH

– Với Tmax: Đánh giá theo phương pháp thống kê không tham số [11], [13], [19]; yêu cầu giá trị Tmax của thuốc thử và thuốc chứng sai khác nhau không có ý nghĩa thống

kê

1.1.4.6 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Phân tích hàm lượng dược chất trong dịch sinh học là phương pháp đánh giá SKD trực tiếp và chính xác nhất [28] Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp chất, lượng mẫu ít và nồng độ chất phân tích thường rất thấp [28], [31] Do vậy, phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu

Nội dung thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được qui định trong các Dược điển [27], [28], [34], [38]:

a Tính chọn lọc – đặc hiệu (selectivity – specificity):

Tính chọn lọc, hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể là tạp chất, hoặc các thành phần cản trở khác Nói cách khác tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có khả năng nhận diện ‘chất cần phân tích’ và không bị ‘nhầm lẫn’ bởi các chất khác Do vậy, kết quả phải thể hiện trên sắc đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha trong mẫu trắng chất cần phân tích phân tách hoàn toàn với các pic tạp

b Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính (Linearity):

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (Diện tích hay chiều cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất)

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Đường chuẩn phải có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học

Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu cần phân tích Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và

có hệ số R2 ≥ 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:

– Độ lệch so với giá trị thực của các nồng độ phải ≤ 15%, trừ điểm gần LLOQ được chấp nhận ≤ 20%

– Có ít nhất 4/6 điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả LLOQ và nồng độ cao nhất

c Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):

Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ nếu thoả mãn:

– Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng – Pic của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm tách riêng và có thể tái lập với độ đúng từ 80 – 120 %

d Độ đ úng – độ chính xác:

– Độ đúng (accuracy): giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với

giá trị thực của mẫu đã biết Giá trị này phải nằm trong khoảng 85 – 115 %, nhưng có thể là 80 – 120 % đối với điểm gần giới hạn định lượng dưới

– Độ chính xác (precision) của phương pháp: là mức độ thống nhất giữa các

kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng độ lệch RSD hoặc CV (%)

Trong đánh giá TĐSH, độ chính xác của phương pháp bao gồm độ lặp lại

(repeatability) ở những thời điểm khác nhau (trong ngày và khác ngày) và độ tái lặp (reproducibility) Phương pháp xác định độ lặp lại là thực hiện phân tích trên

một mẫu thử đồng nhất n lần (n ≥ 5) cùng một lúc và trong cùng một thời điểm hoặc khác ngày Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các lần thử Nói chung, RSD không nên vượt quá 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng dưới cho phép không vượt quá 20%

e Hiệu suất chiết:

Tỷ lệ thu hồi hoạt chất sau khi mẫu được chiết tách theo qui trình đã chọn so

với có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách (mẫu pha trong pha động)

Hiệu suất chiết của phương pháp không bắt buộc phải đánh giá Tuy nhiên, nên tiến hành đánh giá hiệu suất chiết đặc biệt với các trường hợp xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) Để xác định hiệu suất chiết của phương pháp nên tiến hành trên 3 mẫu có nồng độ nằm trong khoảng đường chuẩn đã khảo sát, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần Hiệu suất chiết không nên vượt quá 110% và không nên quá thấp; giá trị RSD < 15% đối với mỗi nồng

độ và hiệu suất chiết trung bình tại mỗi nồng độ không khác nhau quá ± 15%

f Độ ổn định (Stability of the samples):

Quá trình phân tích đánh giá SKD và TĐSH thường kéo dài vì số lượng mẫu lớn Do vậy, cần nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong mẫu sinh học

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử Trong thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định sau:

– Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở điều kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện bảo quản dài ngày,

độ ổn định của dung dịch pha loãng (nếu có)

– Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông – rã đông

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi đã xử lý (chiết tách)

+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian dự định

Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trên các mẫu tự tạo, bảo quản ở điều kiện lạnh (thường ở –20 đến –80 oC) Trong hướng dẫn đánh giá TĐSH in vivo

cho chế phẩm CEF, USP 26 cũng qui định phương pháp định lượng phải thoả

mãn các tiêu chí thẩm định như trên

– Tính chất:

+ Bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, khó tan trong nước (10 g/L), thực

tế không tan trong methanol, dicloromethan, cloroform (< 0,5 g/L) [14], [34] Hệ số phân bố dầu nước logP = 0,35 [24] Do đó khó chiết CEF trong dịch sinh học bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với dung môi hữu cơ

+ CEF có pKa = 1,5; 7,2 (trong nước) CEF không bền trong môi trường kiềm [28], do đó không nên kiềm hoá môi trường khi chiết tách CEF

+ Trong dung dịch HCl 0,1M CEF có hấp thụ tử ngoại cực đại ở 265 nm [24] Vì vậy, có thể định lượng CEF bằng phương pháp HPLC với detector

tử ngoại

1.2.2 Tác dụng dược lý và dược động học

1.2.2.1 Dược lý và cơ chế tác dụng:

CEF là một kháng sinh cephalosporin dùng đường uống, bán tổng hợp, thế hệ

II, có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp thành tế bào CEF có tác dụng in vitro đối với cầu khuẩn Gram (+) tương tự cefalotin, nhưng có tác dụng

mạnh hơn đối với các vi khuẩn Gram (–), đặc biệt với Haemophilus influenzae

và Moraxella catarrhalis ngay cả với các chủng sinh β–lactamase [3], [10]

1.2.2.3 Chỉ định và chống chỉ định [3], [10]:

– Chỉ định: Điều trị các nhiễm khuẩn đường hô hấp do các vi khuẩn nhạy cảm như viêm xoang cấp, viêm tai giữa cấp, viêm amidan tái phát; viêm phổi, đợt cấp của viêm phế quản mạn; nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng,… – Chống chỉ định: Dị ứng với cephalosporin hoặc các thuốc cùng nhóm

1.2.3 Định lượng cefaclor bằng HPLC

Để định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu) thường sử dụng các phương pháp phân tích hoá lý (điện di mao quản, sắc ký khí, sắc ký lỏng, ) [6], [28] Đối với một số hoạt chất có tác dụng dược lý đặc hiệu

có thể định lượng bằng phương pháp vi sinh (một số chất kháng sinh/kháng khuẩn) hoặc phương pháp miễn dịch đặc hiệu [28], [31] So với các phương pháp vi sinh, miễn dịch; phương pháp phân tích hoá lý có phạm vi ứng dụng rộng hơn và thường cho kết quả ổn định cũng như dễ triển khai hơn Trong các

phương pháp phân tích hoá lý, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được

sử dụng trong nghiên cứu SKD và TĐSH [28], [31] Phương pháp HPLC dùng

để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha động Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích được tiêm vào cột sắc ký, chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc bản chất hạt nhồi và chất cần phân tích Khi bơm dung môi pha động qua cột thì tuỳ thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách Các chất sau khi đi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ phận xử lý kết quả [6], [28] Do đặc điểm này

có thể dùng HPLC để định lượng được một và/hoặc vài chất trong một hỗn hợp mẫu phức tạp Chính vì vậy, hiện nay để định lượng CEF có trong chế phẩm hay trong dịch sinh học thường sử dụng các phương pháp HPLC Một số công trình nghiên cứu định lượng CEF bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.1:

Bảng 1.1: Một số công trình định lượng cefaclor bằngHPLC

Nồng độ 0,2 mg/mL trong đệm phosphat

pH 2,5) = 22 : 78

Tốc độ 1,5 mL/phút

UV: 265 nm viên nang,

nén, bột thuốc, siro

Nồng độ 0,3 mg/mL trong pha động

Na.heptansulfonat1

5 mL T.E.A trong 1 lit nước, chỉnh pH 2.3) tỉ lệ 16 : 4 : 80

Tốc độ dòng: 1,4 mL/phút

UV: 265 nm Máu hoặc

huyết tương

Chiết SPE, Pak C18 Hoạt hóa: 2 mL MeOH + 2 mL nước Rửa giải: MeOH Bốc hơi dung môi Hoà tan cắn trong pha động

Sep-4 [25] C18 (Sep-4,6 x 250

mm; 5 μm) MeOH : TBAH/MeOH :

acetic Tỉ lệ 60 : 40 : 0,5 Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút

UV: 262 nm Máu hoặc

huyết tương

Chiết SPE, cột Bond - Elute C18 và cột NH 2

10 : 90 Tốc độ dòng: 1,0 mL/ phút

Fl.: Ex 385

nm, E m 485

mn

Tạo dẫn xuất sau cột với Fluorescamin trong MeCN

Máu hoặc huyết tương

1 mL máu + 1

mL acid tricloracetic 6%, lắc, ly tâm 4000 vòng/phút x 10 phút Lấy dịch nổi Tiêm sắc ký

= 35 : 65 Tốc độ dòng: 0,6 mL/ phút

Quang hoá

Tạo dẫn chất trước cột với

CIPIC Phản

ứng sau cột với H 2 O 2

Huyết tương 40 μL mẫu + 20

μL IS + 25 μL pyridine + 50 μL

35 mM CIPIC/80 °C Ly tâm Lọc Tiêm

MS/MS:

ESI (+) ; m/z

368 (mảnh mẹ); m/z 174 (mảnh con)

Huyết tương

*Tủa protein với hỗn hợp acid formic: MeOH

* Chiết SPE: 0,5mL plasma +100 μL IS… Chiết SPE

30 : 70 Tốc độ dòng: 1,0 mL/ phút

UV: 265 nm Máu Tủa protein bằng

MeOH Ly tâm, lấy dịch nổi Bốc hơi thu cắn, hoà tan trong pha động Lọc tiêm sắc ký

Nhận xét:

– Phương pháp 1, 2: Chương trình sắc ký tương đối đơn giản, phương pháp

thích hợp để định lượng CEF trong các chế phẩm Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp khoảng 0,2 – 0,3 mg/mL, không thích hợp để định lượng CEF

trong huyết tương do nồng độ cực đại trong huyết tương của CEF sau khi uống liều đơn 250 – 500mg chỉ vào khoảng 7 – 13 μg/mL [3], [10]

– Phương pháp 3, 4: Được sử dụng để định lượng CEF trong huyết tương Tuy

nhiên, qui trình xử lý mẫu bằng SPE tương đối phức tạp và chi phí cao Trong điều kiện các phòng thí nghiệm ở nước ta hiện nay, việc áp dụng phương pháp này trong thực tế còn gặp nhiều khó khăn do rất ít phòng thí nghiệm có đủ kinh phí để mua cột chiết, trang thiết bị chiết pha rắn

– Phương pháp5: Độ nhạy cao, thích hợp để định lượng CEF trong dịch sinh học

(giá trị LOD rất nhỏ ≈ 1,3 ng/mL), qui trình xử lý mẫu tương đối đơn giản Tuy nhiên, áp dụng qui trình ở các phòng thí nghiệm ở nước ta gặp nhiều khó khăn

do phát hiện bằng detector huỳnh quang, tạo dẫn xuất sau cột là một kỹ thuật tương đối mới ở nước ta chỉ có rất ít phòng thí nghiệm có trang bị thiết bị

– Phương pháp 6: Phương pháp có LLOQ nhỏ (50 ng/mL), thích hợp để định

lượng CEF trong huyết tương với một lượng mẫu rất nhỏ Tuy nhiên, nhiên phương đòi hỏi thiết bị hiện đại và đặc biệt (detector quang hoá –

Chemiluminescence detector) mà rất ít phòng thí nghiệm có, đồng thời khi phân

tích mẫu lại áp dụng cả kỹ thuật tạo dẫn chất trước và sau cột, đòi hỏi phải có thiết bị đồng bộ đi kèm

– Phương pháp 7: LLOQ của phương pháp với kỹ thuật xử lý mẫu bằng tủa

protein khoảng 100 ng/mL, LLOQ đối với xử lý mẫu bằng chiết SPE là 2 ng/mL Giới hạn này là thích hợp để định lượng CEF trong huyết tương NTN

Tuy nhiên, phương pháp phổ khối (mass spectrum) là một phương pháp mới với

thiết bị hiện đại và đắt tiền mà hiện nay có rất ít phòng thí nghiệm ở Việt Nam

có thiết bị này

– Phương pháp 8, 9: Giá trị LOD của phương pháp khoảng 0,5 – 1 μg/mL,

phương pháp xử lý mẫu cũng như điều kiện sắc ký không đòi hỏi các trang thiết

bị đặc biệt, có thể áp dụng để định lượng CEF trong huyết tương NTN Tuy vậy,

thông tin về hai phương pháp không đầy đủ và các phương pháp này cũng mới chỉ thẩm định một vài chỉ tiêu chưa đáp ứng qui định của FDA – Mỹ về phương pháp phân tích dùng trong nghiên cứu SKD và TĐSH

Trên cơ sở tham khảo các phương pháp định lượng đã được công bố, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng CEF trong huyết tương NTN với detector mảng diod có độ đúng, độ chính xác, …phù hợp trong nghiên cứu đánh giá TĐSH và phù hợp với điều kiện trang thiết bị và khả năng kinh phí của nhiều phòng thí nghiệm trong cả nước để có thể triển khai đánh giá cho các chế phẩm thuốc của các doanh nghiệp Dược Việt Nam

Phần 2.

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN - VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi

– Chất chuẩn và nội chuẩn (IS):

+ Cefaclor (CEF) – Viện Kiểm nghiệm thuốc TW; hàm lượng: 100,23% (khan), độ ẩm: 5,25% SKS: 0201042

+ Acetanilid (ACE) – Viện Kiểm nghiệm thuốc TW; hàm lượng: 99,98% (nguyên trạng), SKS: 0010516

– Dung môi, hoá chất:

Dicloromethan, acid pecloric, đạt tiêu chuẩn PA; MeCN, MeOH loại tinh khiết HPLC dùng trong chiết tách xử lý mẫu và khai triển sắc ký – Huyết tương trắng:

Viện Huyết học và Truyền máu TW Chọn các lô huyết tương không có nhiều pic lạ rải rác trong khoảng thời gian 4 – 10 phút (lô HH 041–05/2006; HH 042–05/2006; HH 043–05/2006)

bơm mẫu bằng tay; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả Merck - Hitachi

Model D - 7000 Chromatography Data Station Software Version 4.1

+ Cân phân tích sartorius (d = 0,1mg; e = 0,1mg)

+ Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 – 16K

+ Tủ lạnh sâu (– 40 0C), Sanyo MDF – 236

+ Micropipet eppendorf 1 – 10 μl, 10 – 100 μl, 100 – 1000 μl

+ Bình định mức, dụng cụ thuỷ tinh (class A) dùng trong phân tích

– Dụng cụ thiết bị dùng trong lâm sàng (xét nghiệm, lấy mẫu máu NTN):

+ Các xét nghiệm lâm sàng (sinh hoá, huyết học, nước tiểu, miễn dịch) tiến hành tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Việt Nam – Cuba

+ Các dụng cụ lấy mẫu: kim luồn, bơm và kim tiêm vô khuẩn dùng 1 lần

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

– Mẫu trắng: Huyết tương trắng – Viện Huyết học và Truyền máu TW

– Mẫu chuẩn hay mẫu thử tự tạo: Hoà tan CEF chuẩn trong huyết tương trắng

với các nồng độ thích hợp

– Mẫu thử: Huyết tương của NTN sau khi uống thuốc CEF chứng hoặc thử

2.2.2 Trong đánh giá TĐSH hai chế phẩm viên nang Cefaclor 250mg

– Thuốc thử:

Viên nang Cefaclor Stada250 (Cefaclor 250mg) – Công ty Dược VTYT Phú Yên SKS: 030705, NSX: 07/07/05, HD: 07/07 SĐK:V919–H08–05

– Thuốc đối chứng:

Viên nang Ceclor (Cefaclor 250mg) – Eli Lilly Italia Lot: 432N2Y8,

Mfg.date: 18 Dec.2003, Exp.date: 18 Dec.2006 SĐK: VN–7124–02

– Người tình nguyện:

14 nam giới khỏe mạnh, bình thường; tuổi từ 20 – 40 Chỉ số tương quan chiều cao – cân nặng từ 0,80 – 1,20 Các xét nghiệm thực thể (tim mạch, huyết áp, nhịp thở) và các xét nghiệm lâm sàng (công thức máu, chức năng gan – thận) cho kết quả nằm trong giới hạn bình thường NTN không dị ứng với CEF và các cephalosporin; không nghiện thuốc lá, rượu; không sử

dụng các chất gây nghiện; không mắc các bệnh mạn tính: cao huyết áp, đái đường; bệnh tim mạch, suy giảm chức năng gan, thận; bệnh di truyền, bệnh lao; không nhiễm HIV/AIDS, HbsAg; không đang mắc các bệnh truyền nhiễm Trong vòng 2 tuần trước khi tham gia vào các thử nghiệm, NTN phải đảm bảo không sử dụng bất kỳ một loại thuốc nào

Sau khi được tuyển chọn theo tiêu chuẩn; được đọc và nghe phổ biến, giải thích các thông tin liên quan đến nghiên cứu: NTN phải tự nguyện cam kết tham gia nghiên cứu và ký vào Bản cam kết theo mẫu đã được HĐĐĐ thông qua

– Các mẫu huyết tương của NTN sau khi uống thuốc thử hoặc thuốc đối chứng được sử dụng để xác định nồng độ CEF trong mẫu

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

™ Xây dựng phương pháp định lượng CEF trong huyết tương NTN bằng HPLC: – Qui trình chiết tách CEF: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn, tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu

tự tạo để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp

– Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách CEF khỏi các thành phần tạp trong huyết tương cho phép xác định được lượng CEF có trong mẫu với độ chính xác thích hợp

– Thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ tiêu: tính đặc hiệu – chọn lọc,

độ đúng, độ lặp lại trong ngày, độ lặp lại khác ngày, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết, độ ổn định …[28], [38]

™ Ứng dụng phương pháp đã xây dựng xác định nồng độ CEF trong máu NTN sau khi uống chế phẩm viên nang CEF 250mg thử hoặc đối chứng Kết quả định lượng được sử dụng để đánh giá TĐSH viên nang Cefaclor Stada 250 sản xuất tại Việt Nam, theo qui định của Dược điển Mỹ 26 [34]

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

2.4.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích

– Xây dụng qui trình xử lý mẫu huyết tương:

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu, chiết tách CEF từ huyết tương trên các mẫu chuẩn CEF hoà tan trong pha động; mẫu huyết tương trắng và các mẫu chuẩn CEF hoà tan trong huyết tương trắng

có nồng độ xấp xỉ Cmax, bằng các phương pháp như:

+ Tủa protein với các tác nhân gây tủa có thể là acid (percloric, tricloracetic, trifluoracetic), hoặc dung môi (MeOH, MeCN)

+ Tủa protein kết hợp với chiết loại tạp bằng chiết lỏng – lỏng

+ Lựa chọn chất thích hợp làm nội chuẩn

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng CEF trong huyết tương NTN bằng phương pháp HPLC với detector mảng diode

2.4.1.2 Thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát, theo các chỉ tiêu qui định của dược điển và hướng dẫn về thẩm định phương pháp tích trong dịch sinh học [28], [34], [38] để đảm bảo phương pháp nghiên cứu là phù hợp

Tiến hành thẩm định trên các mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu QC

(quality control sample)

– Mẫu chuẩn:

+ Dung dịch chuẩn gốc: Nồng độ chính xác khoảng 500 μg CEF/mL MeOH + Dung dịch chuẩn làm việc (50 μg/mL): Lấy 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc, bốc hơi dung môi (40 0C, khí N2) Hoà tan cắn trong 10,0 mL huyết tương trắng + Mẫu chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ CEF từ 1/20 hoặc 1/40 Cmax (mẫu LLOQ); tới 2 – 3 lần Cmax (mẫu ULOQ)

– Mẫu trắng: Huyết tương trắng không chứa CEF

– Mẫu thử : Huyết tương NTN sau khi uống CEF

– Mẫu QC: Chuẩn bị tương tự như các mẫu chuẩn Mẫu QC chuẩn bị từ dung

dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc dùng để pha mẫu chuẩn Theo qui định của hướng dẫn, mẫu QC gồm 3 loại: Mẫu LQC có nồng độ = 3 lần nồng

độ mẫu LLOQ; mẫu MQC có nồng độ = 50 – 80 % nồng độ Cmax và mẫu HQC

b Đường chuẩn và khoảng tuyến tính:

Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn CEF trong huyết tương có nồng độ tương ứng từ 1/20 hoặc 1/40 Cmax tới 2 – 3 lần nồng độ Cmax Từ đáp ứng pic của CEF

và IS tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi qui giữa tỷ lệ đáp

ứng pic của CEF/IS và nồng độ CEF có trong mẫu Đường chuẩn phải có hệ số tương quan > 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai

số không quá 20%

c Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):

Tiến hành sắc ký các mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ 1/10 – 1/30 nồng

Cmax (khoảng 0,1 – 0,5 µgCEF/mL huyết tương) Ghi lại đáp ứng pic của mẫu trắng và mẫu chuẩn

Nồng độ được coi là giới hạn định lượng dưới của phương pháp nếu trên sắc

ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho pic CEF tách biệt với các pic tạp, có độ đúng

từ 80 – 120 %; độ lặp lại với giá trị RSD ≤ 20% và đáp ứng pic CEF ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

d Độ đúng – độ lặp lại trong ngày, độ lặp lại khác ngày:

– Độ đúng: Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập có cùng nồng độ Xác định kết quả định luợng các mẫu QC theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trong cùng điều kiện Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị trung bình của các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lượng chuẩn đã cân và thể tích đã pha Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%

– Độ lặp lại trong ngày: Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa

giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày Giá trị RSD phải ≤ 15%

– Độ lặp lại giữa các ngày: Tiến hành tương tự như xác định độ lặp lại trong ngày, sắc ký các mẫu QC Tính giá trị RSD của kết quả định lượng cho mỗi nồng độ trong ít nhất 3 ngày phân tích khác nhau Giá trị RSD phải ≤ 15%

e Hiệu suất chiết:

Tiến hành sắc ký các mẫu LQC; MQC và HQC theo qui trình đã xây dựng Song song tiến hành định lượng với các mẫu chuẩn pha trong pha động, có nồng độ tương ứng Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kết quả định lượng CEF của mẫu QC

có qua chiết tách – với mẫu chuẩn pha trong pha động (không qua chiết tách) Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi hiệu suất chiết không quá 110%

và không thấp hơn 30%; RSD của giá trị hiệu suất chiết tại các nồng độ không quá 15% và hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ± 15 %

để ở nhiệt độ phòng và mẫu bảo quản lạnh Kết quả phải sai khác nhau không có

ý nghĩa thống kê

– Độ ổn định dài ngày của dung dịch chuẩn gốc và nội chuẩn gốc:

Tiến hành nghiên cứu trên dung dịch chuẩn gốc CEF bảo quản ở nhiệt độ –20 oC và dung dịch nội chuẩn gốc ACE bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 oC Phân tích

xác định nồng độ khi bắt đầu và sau 10 – 15 ngày bảo quản So sánh thống kê

(t-test) để đánh giá mức độ ổn định của mẫu ở điều kiện bảo quản tương ứng

* Độ ổn định của cefaclor trong huyết tương:

Xác định độ ổn định của CEF sau ba chu kỳ đông – rã đông; trong quá trình

xử lý mẫu và trong quá trình bảo quản dài ngày trên các mẫu LQC và HQC

– Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông:

Bảo quản các mẫu ở nhiệt độ –20 oC trong 24 giờ, lấy ra và để tan ở nhiệt độ phòng Sau khi đã tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24

giờ Lặp lại chu kỳ đông – rã đông 2 lần nữa Tiến hành phân tích mẫu sau lần

để rã đông thứ 3 Kết quả lượng CEF có trong mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã đông phải tương đương với lượng CEF có trong mẫu phân tích ngay sau khi để rã đông

– Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu:

So sánh lượng CEF có trong mẫu được chiết tách ngay sau khi rã đông và mẫu có nồng độ tương ứng chỉ được chiết tách sau khi đã rã đông và để ở nhiệt

độ phòng tối thiểu 4 giờ Kết quả phải sai khác không có ý nghĩa thống kê

– Độ ổn định dài ngày:

Bảo quản mẫu trong điều kiện –20 oC Phân tích xác định nồng độ CEF trong các mẫu sau từng khoảng thời gian: bắt đầu và sau 15 đến 35 ngày So sánh kết quả định lượng của các mẫu tại từng thời điểm trong quá trình theo dõi với giá trị định lượng ban đầu Mẫu phải ổn định tại điều kiện bảo quản trong khoảng thời gian tối thiếu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương của NTN (khoảng 4 tuần)

2.4.2 Đánh giá tương đương sinh học viên nang Cefaclor Stada 250

2.4.2.1 Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu chéo, đơn liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn, mù đơn đối với NTN Thử trên NTN đủ tiêu chuẩn, chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn là 1 tuần Lấy máu tại các thời điểm trước và sau khi dùng thuốc để phân tích xác định nồng độ thuốc trong máu

Đánh giá mức độ tương đương theo các hướng dẫn về đánh giá tương đương

sinh học qui định trong USP 26 [34]

2.4.2.2 Cho uống thuốc, lấy mẫu máu:

– Liều dùng: uống 1 lần 2 viên Cefaclor 250 mg thuốc chứng hoặc thuốc thử – Cách dùng: Bữa tối trước ngày dùng thuốc, NTN ăn nhẹ trước 10 giờ đêm;

nước uống theo nhu cầu Ngày dùng thuốc, NTN không ăn sáng, uống thuốc thử

hoặc chứng với 200 mL nước, dưới sự giám sát của bác sỹ và người nghiên cứu sau khi đã được kiểm tra sức khoẻ Sau 4 giờ, NTN ăn bữa chính theo khẩu phần

ăn qui định Trong suốt thời gian tiến hành lấy máu, NTN không được uống sữa, nước chè, cà phê, coca, nước tăng lực…, chỉ uống nước tinh khiết theo nhu cầu

– Lấy mẫu máu: Dùng kim luồn tĩnh mạch vô khuẩn lấy máu tĩnh mạch cẳng tay

NTN Lấy máu vào các ống nghiệm đã đánh số có chứa chất chống đông tại các thời điểm: thời điểm 0 (ngay trước lúc uống thuốc) và các thời điểm sau khi dùng thuốc 15; 30; 45; 60; 90 phút và 2, 2,5; 3; 4; 6; 8 giờ Mỗi lần lấy khoảng 4

mL máu Các mẫu máu được ly tâm lạnh, tách lấy phần huyết tương và bảo quản

ở điều kiện nghiên cứu cho đến khi tiến hành phân tích Quá trình lấy mẫu tuân thủ theo GCP của WHO tại cơ sở lâm sàng có đủ điều kiện [41]

2.4.2.3 Định lượng Cefaclor trong huyết tương

Định lượng CEF trong các mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc bằng phương pháp phân tích đã được thẩm định Phân tích mẫu được bắt đầu ngay sau khi lấy đủ các mẫu Quá trình phân tích tuân thủ theo hướng dẫn về phân tích

mẫu trong dịch sinh học (bioanalytical runs) của US – FDA [38]

2.4.2.4 Phân tích dược động học và đánh giá kết quả

Từ nồng độ thuốc đã định lượng được trong các mẫu huyết tương, vẽ đường cong nồng độ thuốc – thời gian của từng cá thể Xác định các thông số DĐH của thuốc thử và thuốc chứng [3], [17], [19] :

– Cmax và Tmax xác định trực tiếp từ các số liệu thực nghiệm

– AUC0-t xác định bằng phương pháp hình thang:

1 1

0

2

n i

i i

i i

Đánh giá TĐSH viên nang Cefaclor Stada 250 thông qua so sánh các thông

số Cmax, AUC0-∞ và Tmax của thuốc thử với thuốc chứng (Ceclor) theo qui định trong dược điển USP 26 [34]:

– Với Cmax và AUC: Phân tích phương sai (ANOVA), xác định khoảng tin cậy 90% (CI) của sự sai khác giữa hai giá trị trung bình thuốc thử và thuốc đối chứng (số liệu đã chuyển dạng logarit) [13], [19], [39]:

N

EMS N

t R

T

CI = ln( ) ± ( 0 , 1 ; ' ) 2 ×

Trong đó: + T: Giá trị Cmax hoặc AUC 0-∞ của thuốc thử

+ R: Giá trị Cmax hoặc AUC 0-∞ của thuốc chứng + N’: Bậc tự do của sai số xác định bằng ANOVA (N’=N-2) + ESM: Trung bình bình phương của sai số xác định bằng ANOVA + N: Tổng số NTN tham gia đánh giá TĐSH

– Với Tmax: So sánh theo phương pháp thống kê không tham số (Wincoxon

signed rank test) [13], [19]

Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu khoảng tin cậy 90% của

tỷ lệ các giá trị trung bình của Cmax và AUC0-∞ (đã chuyển logarit) giữa thuốc thử và thuốc chứng nằm trong khoảng từ 0,8 – 1,25 và Tmax khác nhau không có

ý nghĩa thống kê

2.4.2.5 Thông qua hội đồng đạo đức

Để đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y – sinh học, toàn bộ nội dung đề tài bao gồm đề cương nghiên cứu và các biểu mẫu liên quan, sẽ được nhóm nghiên cứu và nhà tài trợ đệ trình lên HĐĐĐ theo đúng các qui định và hướng dẫn về GCP Nghiên cứu chỉ được tiến hành sau khi nhận được sự chấp thuận của HĐĐĐ

Phần 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG - THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu huyết tương:

Chuẩn bị các mẫu chuẩn CEF trong pha động, mẫu chuẩn CEF trong huyết

tương và mẫu huyết tương trắng như mục 2.4.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu,

chiết tách CEF từ huyết tương bằng các phương pháp như chiết lỏng – lỏng; tủa

protein hay chiết pha rắn:

– Với phương pháp chiết lỏng – lỏng bằng dung môi hữu cơ:

Do CEF dễ tan trong nước, ít tan trong dung môi và không bền trong môi trường kiềm, nên hiệu suất chiết thấp Vì vậy, không áp dụng phương pháp này để xử lý mẫu

– Với phương pháp tủa protein: Nghiên cứu xử lý mẫu với các tác nhân gây tủa

khác nhau như acid hay dung môi hữu cơ:

+ Với acid: lấy 1,0 mL mẫu, thêm 0,25 Æ 0,5 mL một trong các acid: HClO4/ CCl3-COOH hoặc CF3-COOH Lắc, ly tâm Lấy dịch, lọc 0,45 μm Tiêm sắc ký + Với dung môi: lấy 1,0 mL mẫu vào ống ly tâm, thêm 2 Æ 5 mL MeOH hoặc MeCN Lắc, ly tâm Lấy dịch, lọc 0,45 μm Tiêm sắc ký

- Với phương pháp tủa protein và chiết loại tạp: 1,0 mL mẫu thêm 0,25 Æ 0,5 mL

acid để tủa protein và 1 Æ 3 mL dung môi hữu cơ (dicloromethan) để chiết loại tạp Lắc, ly tâm Lấy dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,45 μm Tiêm sắc ký

Kết quả khảo sát cho thấy, cả 3 phương pháp xử lý mẫu đã khảo sát đều có thể

áp dụng để xử lý mẫu huyết tương chứa CEF nếu lựa chọn được điều kiện sắc ký phù hợp Sắc ký đồ mẫu trắng, không xuất hiện các pic có cùng thời gian lưu với

pic CEF có trong mẫu chuẩn Hình 3.1; 3.2, và 3.3 là sắc ký đồ mẫu chuẩn CEF trong huyết tương xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein với acid; tủa protein với dung môi và tủa protein với acid – chiết loại tạp với dicloromethan (điều kiện sắc ký đã được điều chỉnh phù hợp với từng phương pháp xử lý mẫu)

Hình 3.1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn xử lý

tủa protein bằng HClO 4

Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn xử lý

tủa protein bằng MeOH

Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn xử lý tủa protein bằng HClO 4 và loại tạp bằng dicloromethan