Nguyễn nhật linh biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của xylanase d tái tổ hợp khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NHẬT LINH BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA XYLANASE D TÁI TỔ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NHẬT LINH Mã sinh viên: 1801391 BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA XYLANASE D TÁI TỔ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giảng viên hướng dẫn: TS Đào Thị Mai Anh PGS.TS Đỗ Thị Tun Nơi thực hiện: 1.1 Bộ mơn Hóa Sinh 2.1 Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người tâm huyết giảng dạy kiến thức quý báu cho em suốt thời gian năm năm học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa Sinh – khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội, anh chị phịng Cơng nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Đỗ Thị Tuyên định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình bổ sung cho em kiến thức chuyên môn cần thiết tạo điều kiện tốt giúp em học tập, rèn luyện thực khóa luận suốt q trình thực tập phịng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học Sự đồng hành quan tâm cô trở thành nguồn động lực lớn mà em nhận Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh, người giảng viên hướng dẫn đầy nhiệt huyết em Cô người thầy tận tâm lời giảng, định hướng nghiên cứu giúp em, mà cịn người chị, người mẹ gửi gắm cho em kỳ vọng, tiếp cho em niềm tin đưa em lời khuyên chân thành sống Đây hành trang quý giá để em vững vàng hơn, tự tin đường nghiệp sống mai Thêm vào đó, giúp đỡ nhiệt tình TS Nguyễn Thị Thảo, anh Tùng anh Hoàng tạo cho em nguồn cảm hứng vô lớn Cảm ơn anh chị cho em lời nhận xét dẫn chun mơn xác, lời động viên chân thành để em hồn thành khóa luận tốt khoảng thời gian bị giới hạn Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ba mẹ, người thân gia đình, bạn bè ln bên cạnh, động viên tiếp thêm niềm tin, động lực cho em đường học tập rèn luyện thân Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2023 Sinh Viên Nguyễn Nhật Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 EMZYM XYLANASE .3 1.1.1 1.1.2 Định nghĩa Phân loại .3 1.1.3 Nguồn gốc 1.2 XYLANASE TỪ CHI ASPEGILLUS 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 Các loại gen mã hóa xylanase Cấu trúc chế xúc tác Tính chất 10 Ứng dụng 11 1.3 XYLANASE D 13 1.3.1 Gen mã hóa từ chủng Aspergillus niger DMS1957 13 1.3.2 1.3.3 Đặc tính cấu trúc enzym xylanase D 13 Tình hình nghiên cứu 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 15 2.1.1 2.1.2 2.1.3 Chủng giống 15 Hóa chất 16 Môi trường 17 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 17 2.2 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase 19 Xác định hoạt tính enzym xylanase 19 Xác định hàm lượng protein 21 Tinh xylanase 21 2.3.5 Điện di SDS-PAGE 23 2.3.6 Nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase 24 2.3.7 Xử lý số liệu 25 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .26 3.1 KẾT QUẢ 26 3.1.1 3.1.2 Biểu hiện xylanase D từ chủng P.pastoris GS115 tái tổ hợp 26 Tinh xylanase D tái tổ hợp 28 3.1.3 Nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase D tái tổ hợp 33 3.2 BÀN LUẬN .37 3.2.1 3.2.2 3.3.3 Về kết biểu xylanase D tái tổ hợp 38 Về kết tinh xylanase D tái tổ hợp 38 Về kết nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase D tái tổ hợp 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 44 CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh AOX Alcohol oxidase APS Ammonium persulphat Bis-acrylamid N, N’-Methylen-bis-acrylamid bp Base pair Cặp base BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CBB Coomassie brilliant blue DNS Dinitro salysilic acid DEAE Diethylaminoethyl EC The Enzym Commission EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid GH Glycosid hydrolase kDa Kilo Dalton KP Kali phosphate MW Molecular weight NaP Sodium phosphate OD Optical density SDS Sodium dodecyl sulfat PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis TEMED Tiếng Việt Tiểu ban Enzym Khối lượng phân tử N,N,N’,N’Tetramethylethylenediamin Tris Tris –(hydroxymethyl)-aminomethan v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể thích DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phân loại enzym xylanase theo liên kết bị tác động Bảng 1.2 Đặc điểm họ GH có hoạt tính xylanase Bảng 1.3 Tính chất lý hóa số xylanase từ chi Aspergillus 10 Bảng 1.4 Tính chất số xylanase D 13 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 16 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 16 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 18 Bảng 2.4 Thành phần gel co gel tách 24 Bảng 3.1 Kết hoạt độ xylanase D tái tổ hợp từ chủng P.pastoris GS115 28 10 Bảng 3.2 Kết hoạt độ enzym tinh cột cut-off 10 kDa 28 11 Bảng 3.3 Hoạt tính phân đoạn sau qua cột DEAE-Sepharose 29 12 Bảng 3.4 Hoạt tính phân đoạn sau qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 30 13 Bảng 3.5 Tóm tắt q trình tinh xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 32 14 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 33 15 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 34 16 Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 35 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cơ chế trì cấu hình anomer đường khử Hình 1.2 Cơ chế đảo ngược cấu hình anomer đường khử Hình 1.3 Cấu trúc phân tử số dẫn xuất trung gian để tổng hợp thuốc điều trị ung thư, kháng virus điều chế từ xylose 12 Hình 1.4 Cấu trúc khơng gian enzym xylanase D 13 Hình 2.1 Cấu tạo vector biểu pPICZαA 15 Hình 2.2 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 19 Hình 2.3 Đường chuẩn xylose 20 Hình 2.4 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 21 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình tinh xylanase từ chủng P.pastoris GS115 tái tổ hợp 22 10 Hình 3.1 Ni cấy chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp YPD agar bổ sung zeocin 26 11 Hình 3.2 Định tính xylanase 24h 27 12 Hình 3.3 Định tính xylanase dịch thơ 27 13 Hình 3.4 Khả thủy phân agar xylanase D 27 14 Hình 3.5 Hoạt tính hàm lượng protein phân đoạn qua cột DEAESepharose 29 15 Hình 3.6 Điện di đồ SDS-PAGE qua cột DEAE-Sepharose 30 16 Hình 3.7 Hoạt tính hàm lượng protein phân đoạn qua cột Sephadex G-100 31 17 Hình 3.8 Điện di đồ phân đoạn 7-12 qua cột Sephadex G-100 31 18 Hình 3.9 Điện di đồ trình tinh xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 32 19 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 33 20 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 34 21 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 35 22 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH đến độ bền enzym xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 36 23 Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzym xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong kỷ 21, thay chạy theo hiệu kinh tế đơn thuần, sử dụng nhiều hóa chất độc hại sản xuất gây tổn hại trầm trọng đến mơi trường, “cơng nghiệp xanh” (green industry/sustainable development) xu ngày nhiều ngành sản xuất quan tâm ứng dụng Do biến đổi khí hậu tồn cầu ngày khắc nghiệt với hàng loạt thảm họa tự nhiên người gây nhận thức trách nhiệm bảo vệ môi trường nhà sản xuất người tiêu dùng tăng lên rõ rệt, các nhà sản xuất sẵn sàng thay đổi nắm bắt hội phát triển bền vững để có lợi cạnh tranh Thị trường công nghệ xanh bền vững toàn cầu dự báo phát triển từ 35,5 tỷ đô la Mỹ vào năm 2021 đến đỉnh 417,35 tỷ đô la Mỹ vào năm 2030 Tốc độ tăng trưởng kép hàng năm 21,6% từ năm 2022 đến năm 2030 [45] Một số quốc gia tồn giới sử dụng cơng nghệ xanh để quản lý tái chế chất thải từ ngành cơng nghiệp hộ gia đình Cơng nghệ xanh hỗ trợ doanh nghiệp tiết kiệm nước, giảm rác thải, sử dụng lượng so với cơng nghệ truyền thống Những lợi công nghệ bền vững có tác động đáng kể đến việc áp dụng tồn cầu [61] Để thực ngành công nghiệp xanh, cần giải số vấn đề như: nguồn lượng tái tạo, công cụ xanh, kỹ thuật thân thiện với môi trường Một giải pháp ưu việt việc ứng dụng enzym – công cụ xanh – vào sản xuất xử lý phế phẩm công nghiệp, nơng nghiệp Trong đó, xylanase, nhóm enzym có khả thủy phân polysaccharid mạch thẳng β-1,4-xylan thành oligosacharid ngắn (oligoxylose) xylose, biết đến phương pháp hữu hiệu việc xử lý chất thải công nghiệp, ứng dụng ngành công nghiệp giấy, sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất cồn nhiên liệu, [28, 58, 60, 70, 74] Nhiều dạng chế phẩm xylanase thương mại hóa bán thị trường giới Theo báo cáo, dù chịu ảnh hưởng COVID-19, thị trường xylanase toàn cầu tăng trưởng dự đoán tiếp tục xu hướng năm 2028 [66] Không vậy, ngày nay, xylanase cịn quan tâm đến cơng cụ hiệu sản xuất xylose xylooligosaccharid (XOs), hợp chất ngày có nhiều ứng dụng quan trọng ngành Dược, kể đến vai trị probiotic, chống oxy hóa, kháng khuẩn, giảm cholesterol máu thay glucose chế độ ăn cho người bị tiểu đường,… [14, 18, 40, 46] Đặc biệt, năm gần nhà Dược học ý tới ứng dụng tiềm khác xylose sử dụng chúng để tổng hợp dẫn xuất trung gian điều chế thuốc điều trị ung thư, kháng virus HIV [2] Tuy nhiên, enzym trở thành cơng cụ hữu dụng cho ngành cơng nghiệp địi hỏi phải hoạt động điều kiện khắc nghiệt nhiệt độ cao, pH acid hay kiềm Đây lý thước lỗ sàng phân tử nhỏ Chính vậy, ngun liệu thỏa mãn u cầu trình bày để đảm bảo cho việc tách protein enzym tốt Không thế, ưu điểm Sephadex DEAE-Sepharose vừa có khả phục hồi hoạt động cao, tái sử dụng bảo quản đơn giản ethanol [10, 22] Điều mang đến lợi lớn chi phí điều kiện thí nghiệm Việt Nam Sau q trình tinh sạch, chúng tơi thu hồi 16,8% hoạt tính dịch lên men độ 1,32 lần Kết qua cột DEAE, gộp phân đoạn có hoạt tính cao để đưa ml lên cột Sephadex G-100, sau đó, sử dụng lượng lớn đệm để rửa giải hết protein khỏi cột, đồng thời, xylanase D bị rửa giải protein khác phân đoạn 7, 12 nên thu hồi lượng nhỏ xylanase tinh Ngồi ra, thấy, hoạt tính phân đoạn 7-11 qua cột DEAE lớn hoạt tính xylanase tinh cuối Sau rà sốt yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase trình tinh sạch, chúng tơi nhận thấy bất thường kết đến từ hệ đệm dùng cho cột DEAE chứa thành phần muối NaCl 1M Rất có khả ion Cl- có khả tăng cường tác dụng xylanase D điều cần kiểm chứng nghiên cứu yếu tố hoạt hoá ức chế enzym Nghiên cứu xylanase D từ chủng Penicillium funiculosum biểu P.pastoris tinh sắc ký lọc gel, cột Sephacryl S-200, kết tinh cho thấy độ thu hồi 21% enzym tinh 1,9 lần [44] Độ thu hồi độ tinh cao nghiên cứu chúng tôi, nhiên, số khiêm tốn độ đặc hiệu phương pháp sắc ký lọc gel không cao Để nâng cao độ tỷ lệ thu hồi, sử dụng phương pháp tủa muối ammonium sulfat để cô đặc mẫu nhiều lần trước qua sắc ký trao đổi anion, sắc ký lọc gel, sắc ký tương tác kỵ nước (HIC),… và/hoặc dùng cột đặc hiệu Q-sepharose, Butyl-Toyopearl, monoQ-10/10 HR,…[24, 27, 53, 62], với hệ thống máy thu mẫu phân tích chất lượng cao sử dụng với lượng mẫu lớn Từ đó, độ lên đến 19 lần [62], chí 100 lần [53] độ thu hồi lên đến 43% [62] Tuy nhiên, phương pháp hệ thống tốn kém, chi phí cao gấp nhiều lần so với nghiên cứu Các cải tiến tối ưu phương pháp tinh tiến hành xylanase D thực mang đặc tính vượt trội dựa kết nghiên cứu tính chất lý hóa khả thủy phân enzym Kết tinh sau điện di băng đậm rõ vị trí 35 45 kDa (khoảng 41 kDa) Kết cao so với lý thuyết (khoảng 35,4 kDa) glycosyl hóa, điều phổ biến hydrolase glycosid nấm giàu dư lượng Ser Thr chúng thường bị O – glycosyl hóa, enzym bị N – glycosyl hóa [44] Trong nghiên cứu xylanase D Penicillium purpurogenum, 40 điện di đồ cho kết 60 kDa kích thước phân tử dự đốn gần 41 kDa [24]; Một nghiên cứu khác Penicillium funiculosum xylanase D cho kết điện di 64 kDa, cao nhiều so với khối lượng dự kiến 41 kDa [44] Để khẳng định khối lượng xác xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp, cần làm thêm phương pháp khối phổ kiểm tra glycosyl hóa cách dùng thuốc thử Schiff nhuộm đặc hiệu [44] Một giả thiết khác chúng tơi vấn đề lỗi sai lệch sau dịch mã ADN tái tổ hợp việc xử lý tín hiệu tiết α-factor (α-factor secretion signal) Tín hiệu gồm phần chính: vùng pre với 19 acid amin đóng vai trị quan trọng việc định protein có tiết khơng tiết theo chế nào; vùng pro gồm 67 amino acid chi phối gấp nếp protein [29, 47] Sau protein tổng hợp tế bào chất, q trình xử lý tín hiệu tiết α-factor gồm giai đoạn: Đầu tiên, tín hiệu loại bỏ phần pre peptidase lưới nội chất; tiếp phần pro bị cơng Kex2 endopeptidase; cuối cùng, Ste13 nhanh chóng cắt bỏ đoạn Glu-Ala lặp lại Golgi [47] Mặc dù α-factor chứng minh tín hiệu tiết mạnh, tồn đáng kể lượng protein tái tổ hợp khơng xảy q trình xử lý vị trí phân cắt Kex2 tín hiệu này, hậu protein tái tổ hợp mang phần tín hiệu tiết [20], từ dẫn đến thay đổi kích thước, cấu trúc, cách cuộn xoắn protein bậc cao,… Giả thiết tương đối hợp lý tình phân tử lượng enzym tái tổ hợp tăng đáng kể so với dự đoán ban đầu Bởi vậy, cần tiếp tục giải trình tự băng protein để hiểu rõ cấu trúc enzym 3.3.3 Về kết nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase D tái tổ hợp Việc xác định đánh giá tính chất lý hóa enzym vơ cần thiết lý quan trọng Trước hết, yếu tố thời gian, nhiệt độ pH phản ứng yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính enzym xúc tác Vì vậy, xác định giá trị tối ưu đánh giá ảnh hưởng yếu tố phản ứng thủy phân chất enzym giúp tìm điều kiện mà hoạt tính enzym thể mạnh nhất; từ đem lại hiệu suất cao cho phản ứng thủy phân Thứ hai, để sản xuất lượng enzym tinh sạch, không tốn thời gian mà chi phí kèm theo tốn kém, vậy, khảo sát độ bền enzym tác động nhiệt độ pH theo thời gian giúp ích cho khâu bảo quản cho hoạt tính enzym trì lâu bền vấn đề khơng thể xem nhẹ Cuối cùng, mục đích việc sản xuất loại xylanase thương mại hóa, đặc biệt thị trường Việt Nam, nhu cầu xylanase dần tăng lên xong phải nhập từ nước ngồi với tổng chi phí cao chi phí nguyên liệu lẫn chi phí vận chuyển quốc tế Do vậy, khảo sát 41 đặc tính loại xylanase phát tính chất vượt trội dựa vào tính chất lý hóa để ứng dụng vào ngành sản xuất phù hợp Trước tiên, khảo sát điều kiện tối thích cho phản ứng xylanase Kết cho thấy thời gian phản ứng tối ưu 20 phút, dài so với số nghiên cứu xylanase D [27, 44, 62], nhiên, có nghiên cứu ủ phản ứng lên đến [24] Dễ thấy rằng, thời gian phản ứng dài lượng sản phẩm tạo nhiều, thời gian phản ứng lâu khiến enzym giảm khả phản ứng phải ủ nhiệt độ cao Hơn nữa, hoạt tính xylanase phản ứng cao sau 20 phút ủ phản ứng, đó, chúng tơi lựa chọn 20 phút làm thời gian phản ứng cho nghiên cứu Về nhiệt độ tối ưu cho phản ứng, sau khảo sát dải nhiệt độ từ 37 đến 80°C, chúng tơi nhận thấy hoạt tính cao phản ứng 50°C, kết đồng thuận với số xylanase từ Aspergillus sp [13] Điều lại tạo khác biệt xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD so với xylanase D từ lồi khác nhiệt độ tối thích cho phản ứng chúng cao khoảng 60 – 80°C [24, 44, 62] Đây ưu điểm để thể cạnh tranh ứng dụng sản xuất nguyên liệu sản phẩm thủy phân xylan tiết kiệm lượng gia nhiệt trì phản ứng cho xylanase D mà nghiên cứu Thêm vào đó, việc hoạt tính ủ phản ứng sau 50 phút 50°C đạt khoảng 70%, tăng nhiệt độ phản ứng lên 60°C giữ hoạt tính lên đến 73% mở triển vọng ứng dụng ngành sản xuất công nghiệp điều kiện khắc nghiệt Cuối cùng, khảo sát phụ thuộc hoạt tính với yếu tố pH khoảng 5,0 đến 9,5 nhận hoạt tính cao pH 7,0, khoảng pH hoạt động tối thích 6,5 – 8,0, cao pH tối ưu đa số xylanase có nguồn gốc từ Aspergillus sp (trong khoảng 4,0 – 6,5) [13, 59] xylanase D sản xuất Clostridium stercorarium HX-1 (pH 6,5) [62], Penicillium funiculosum (pH 4,0 – 5,5) [44] Penicillium purpurogenum (pH 6,5) [24] Khoảng pH hoạt động rộng từ acid đến kiềm khả hoạt động nhiệt độ cao trở thành lợi cạnh tranh thị trường xylanase ngành sản xuất công nghiệp sản xuất giấy, thức ăn chăn nuôi, chất tẩy rửa,… [19, 41] Có thể thấy số sản phẩm xylanse thương mại có tính chất gần giống với enzym như: Bột đơn enzym xylanase Sunson hoạt động nhiệt độ cao 50°C – 65°C phạm vi pH 4,5 – 7,0, sử dụng cho thực phẩm, chế biến tinh bột, thức ăn chăn nuôi, sản phẩm chiết xuất từ thực vật, bột giấy giấy [69] Cũng với ứng dụng trên, xylanase từ Starzyme có tính chất nhiệt độ hoạt động 35- 55°C, pH từ 3,5 – 7,0 [65] Một sản phẩm khác Sunson chuyên ứng dụng cho sản xuất bột giấy – xyalanse tính kiềm X25 – ứng dụng cho nhiệt độ phản ứng từ 35 – 65 °C, pH từ 6,0 – 9,0 [68] 42 Độ bền pH độ bền nhiệt độ nghiên cứu nhằm xác định điều kiện bảo quản tốt định hướng số ứng dụng cho xylanase D P.pastoris GS115/pXlnD Có thể thấy ổn định enzym dải pH rộng từ 5,0 – 9,5 hoạt tính sau giữ 80%, chí tăng lên ủ với pH 6,0, chứng minh xylanase D bảo quản tốt điều kiện pH thơng thường, chí acid kiềm Kết hoàn toàn đồng thuận với nghiên cứu trước [24, 44, 62] xylanase D xylanase khác từ họ Aspergillus [13, 67] Độ bền pH mở kỳ vọng chế tạo nhiều dạng chế phẩm nguyên liệu xylanse pH khác Tuy nhiên, độ bền nhiệt độ hạn chế xylanase D sản xuất P.pastoris GS115/pXlnD enzym bền nhiệt độ thấp vừa, tăng nhiệt độ đến 45°C hoạt tính tương đối nửa sau ủ bị hoạt tính nhanh ủ nhiệt độ cao Kết khiêm tốn so với xylanase D khác nhiều độ ổn định chúng thường lên đến 70°C [24, 27, 62] làm cho ứng dụng bị hạn chế hơn, nhiên, đảm bảo bảo quản tốt nhiệt độ mát vừa Bên cạnh đó, việc hoạt động tốt nhiệt độ 50 - 60°C không bền ủ nhiệt độ cao vấn đề giải thích được: Xylanase D enzym khác, protein, vậy, nhiệt độ cao dễ dàng làm biến đổi cấu trúc gây hoạt tính nhanh chóng Mặt khác, xylanase D tiếp xúc với xylan, nhiệt độ lại đóng vai trò yếu tố làm tăng khả chuyển động va chạm hỗn hợp phản ứng, từ hình thành nhiều phức hợp enzym-cơ chất hơn, tăng tốc độ phản ứng tăng hoạt độ enzym xylanase D Như vậy, xylanase D tinh từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp nghiên cứu chúng tơi có số đặc điểm tiềm phản ứng hiệu nhiệt độ cao mơi trường pH trung tính – kiềm, bền dải pH rộng Trái lại, enzym bền với nhiệt độ cao đảm bảo hoạt tính bảo quản nhiệt độ thường Để xác định rõ độ khả thi định hướng ứng dụng xylanase, cần tiếp tục nghiên cứu thêm chất có khả ức chế tăng cường hoạt tính enzym 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Sau tiến hành biểu hiện, tinh đánh giá tính chất lý hóa enzym xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp, rút kết luận sau: Đã biểu xylanase D từ chủng P.pastoris GS115/pXlnD sau nuôi môi trường YP lỏng cảm ứng 1% methanol 24 h, với hoạt tính 3,093 ± 0.037 IU/ml Ngồi ra, kết cho thấy dịch ni cấy có khả thủy phân agar khơng có xylan Qua hai bước tinh cột sắc ký trao đổi anion DEAE cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100, chúng tơi bước đầu tinh xylanase có khối lượng phân tử khoảng 41 kDa, hoạt tính 0,982 ± 0,029 IU/ml, độ so với enzym thô ban đầu 1,32 lần, với hiệu suất thu hồi 16,8 % Xylanase D tinh hoạt động tốt pH 7,0 nhiệt độ 50°C, thời gian 20 phút; ổn định 37°C dải pH rộng từ 5,0 – 9,5 44 CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ Khảo sát khả thủy phân chất khác xylanase D Xác định định lượng số sản phẩm tạo xylanase D phương pháp sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng Giải trình tự băng điện di kích thước khoảng 41 kDa tiến hành nhuộm đặc hiệu điện di bổ sung chất xylan sau hồi tính 0,5% Triton X100 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Xuân Chiến (2022), Nhân dòng, thiết kế vector, biểu xylanase tái tổ hợp Pichia pastoris GS115, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Trương Thị Minh Hải and Lê Thanh Phước (2008), "Biến đổi vòng đường xylose thành chất trung gian cho trình tổng hợp thuốc trị ung thư, kháng virut HIV", Tạp chí Khoa học Đại học cần Thơ, (9), tr 220-226 Hoàng Thu Huyền (2019), Tinh đánh giá tính chất lý hóa enzym xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-187, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thạch Phong (2022), Nghiên cứu điều kiện biểu hiện, tinh đánh giá khả thuỷ phân arabinoxylan xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Thùy, Nguyễn Văn Thuật, et al., Biểu và đánh giá tính chất lý hóa lý xylanase tái tổ hợp từ chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-187 GS115., in Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009 2009, Công nghệ sinh học phục vụ nông - lâm nghiệp, thủy sản, công nghiệp, y dược bảo vệ môi trường: Thái Nguyên tr 710- 771 Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thu Ngân, et al (2021), "Tinh đánh giá khả thủy phân arabinoxylan xylanase tự nhiên tái tổ hợp", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 19(4), tr 741-748 Nguyễn Thanh Thủy, Đặng Thị Kim Anh, et al (2016), "Biểu gen mã hóa endo1,4-β-xylanase chịu nhiệt, hoạt động môi trường axit nhằm ứng dụng sản xuất thức ăn chăn ni", Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam, 14(3), tr 400-408 Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, et al (2009), "Biểu đánh giá tính chất hóa lý xynalase tái tổ hợp từ chủng Asprgillus niger DSM1957 Pichia pastoris GS115", Báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2009, tr 151-157 Tài liệu tiếng Anh 10 11 12 13 14 Aachary Ayyappan Appukuttan and Prapulla Siddalingaiya Gurudutt (2011), "Xylooligosaccharides (XOS) as an Emerging Prebiotic: Microbial Synthesis, Utilization, Structural Characterization, Bioactive Properties, and Applications", Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 10(1), pp 2-16 Aldrich Sigma (2022, 26/03/2022), "Safety data sheet", from https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/sds/sigma/g100120 Alvarez-Cervantes J., Diaz-Godinez G., et al (2016), "Phylogenetic analysis of betaxylanase SRXL1 of Sporisorium reilianum and its relationship with families (GH10 and GH11) of Ascomycetes and Basidiomycetes", Sci Rep, 6, pp 24010 Basit A., Jiang W., et al (2021), "Xylanase and Its Industrial Applications", Biotechnological Applications of Biomass, Peixoto Basso T., Olitta Basso T., and & Carlos Basso L., Intech, London-UK, pp 293-314 Beg Q K., Kapoor M., et al (2001), "Microbial xylanases and their industrial applications: a review", Appl Microbiol Biotechnol, 56(3-4), pp 326-38 Bhardwaj Nisha, Kumar Bikash, et al (2019), "A detailed overview of xylanases: an emerging biomolecule for current and future prospective", Bioresources and Bioprocessing, 6(1), pp 40 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Black G W., Hazlewood G P., et al (1995), "A modular xylanase containing a novel non-catalytic xylan-specific binding domain", Biochemical Journal, 307(1), pp 191195 Bradford M M (1976), "Arapid and sensitive method for quantitation of microgram quatities of protein utilizing the principle of protein -dye binding", Anal Biochem., 72:, pp 248-254 Chakdar H., Kumar M., et al (2016), "Bacterial xylanases: biology to biotechnology", Biotech, 6(2), pp 150 Chen Hua Han, Chen Yu Kuo, et al (2012), "Immunomodulatory Effects of Xylooligosaccharides", Food Science and Technology Research, 18(2), pp 195-199 Collins T., Gerday C., et al (2005), "Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases", FEMS Microbiol Rev, 29(1), pp 3-23 Cregg J M (2007), "Introduction: distinctions between Pichia pastoris and other expression systems", Methods Mol Biol, 389, pp 1-10 Cummins P M., Rochfort K D., et al (2017), "Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application", Methods Mol Biol, 1485, pp 209-223 Cytiva, "DEAE Sepharose™ Fast Flow Ion Exchange Chromatography Media, Cytiva", from https://us.vwr.com/store/product/11231597/deae-sepharosetm-fast-flow-ionexchange-chromatography-media-cytiva Duong-Ly K C and Gabelli S B (2014), "Gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) of proteins", Methods Enzymol, 541, pp 105-14 Echeverria V and Eyzaguirre J (2019), "Penicillium purpurogenum Produces a Set of Endoxylanases: Identification, Heterologous Expression, and Characterization of a Fourth Xylanase, XynD, a Novel Enzyme Belonging to Glycoside Hydrolase Family 10", Appl Biochem Biotechnol, 187(1), pp 298-309 Elgharbi F., Hmida-Sayari A., et al (2015), "Expression of an Aspergillus niger xylanase in yeast: Application in breadmaking and in vitro digestion", Int J Biol Macromol, 79, pp 103-9 Enzyme Carbohydrate Active, "Glycoside Hydrolase family classification", Enzyme Classes, from http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html Furniss Caroline S M., Williamson Gary, et al (2005), "The substrate specificity and susceptibility to wheat inhibitor proteins of Penicillium funiculosum xylanases from a commercial enzyme preparation", Journal of the Science of Food and Agriculture, 85(4), pp 574-582 Gawande P V and Kamat M Y (1999), "Production of Aspergillus xylanase by lignocellulosic waste fermentation and its application", J Appl Microbiol, 87(4), pp 511-9 Gene Snap (2023), "Alpha-factor secretion signal", from https://www.snapgene.com/plasmids/yeast_plasmids/alpha-factor_secretion_signal Henrissat B and Coutinho P M (2001), "Classification of glycoside hydrolases and glycosyltransferases from hyperthermophiles", Methods Enzymol, 330, pp 183-201 Henrissat B., Claeyssens M., et al (1989), "Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene, 81(1), pp 83-95 Howard B H., Jones G., et al (1960), "The pentosanases of some rumen bacteria", Biochem J, 74(1), pp 173-80 IUBMB (2005), "EC 3.2.1.156", Enzyme Database, from https://www.enzymedatabase.org/query.php?ec=3.2.1.156 IUBMB (1992), "EC 3.2.1.136", Enzyme Database, from https://www.enzymedatabase.org/query.php?ec=3.2.1.136 IUBMB (1990), "EC 3.2.1.131", Enzyme Database, from https://www.enzymedatabase.org/query.php?ec=3.2.1.131 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 IUBMB (1972), "EC 3.2.1.72", Enzyme Database, from https://www.enzymedatabase.org/query.php?ec=3.2.1.72 IUBMB (1965), "EC 3.2.1.32", Enzyme Database, from https://www.enzymedatabase.org/query.php?ec=3.2.1.32 IUBMB (1965), "EC 3.2.1.37 ", Enzyme Database, from https://www.enzymedatabase.org/query.php?ec=3.2.1.37 IUBMB (1961), "EC 3.2.1.8", Enzyme Database, from https://www.enzymedatabase.org/query.php?ec=3.2.1.8 Kallel F., Driss D., et al (2015), "Biological Activities of xylooligosaccharides generated from garlic straw xylan by purified xylanase from Bacillus mojavensis UEBFK", Appl Biochem Biotechnol, 175(2), pp 950-64 Kamal Kumar B., Balakrishnan H., et al (2004), "Compatibility of alkaline xylanases from an alkaliphilic Bacillus NCL (87-6-10) with commercial detergents and proteases", J Ind Microbiol Biotechnol, 31(2), pp 83-7 KEGG, "Enzyme: EC 3.2.1.8", from https://www.genome.jp/entry/3.2.1.8 Laemmli U K (1970), "Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227, pp 680-685 Lafond M., Tauzin A., et al (2011), "GH10 xylanase D from Penicillium funiculosum: biochemical studies and xylooligosaccharide production", Microb Cell Fact, 10, pp 20 Laricchia Federica (2023, 06/03/2023), "Green technology and sustainability market size worldwide from 2021 to 2030", Environmental Technology & Greentech, from https://www.statista.com/statistics/1319996/green-technology-and-sustainabilitymarket-size-worldwide/ Li Tuoping, Li Suhong, et al (2010), "Effects of haw pectic oligosaccharide on lipid metabolism and oxidative stress in experimental hyperlipidemia mice induced by highfat diet", Food Chemistry, 121(4), pp 1010-1013 Lin-Cereghino G P., Stark C M., et al (2013), "The effect of alpha-mating factor secretion signal mutations on recombinant protein expression in Pichia pastoris", Gene, 519(2), pp 311-7 Liu M Q and Liu G F (2008), "Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it", Protein Expr Purif, 57(2), pp 101-7 Lombard V., Golaconda Ramulu H., et al (2014), "The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013", Nucleic Acids Res, 42(Database issue), pp D490-5 Merck, "Ultra-15 Centrifugal Filter Unit", from https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/product/mm/ufc9010 Mewis K., Lenfant N., et al (2016), "Dividing the Large Glycoside Hydrolase Family 43 into Subfamilies: a Motivation for Detailed Enzyme Characterization", Appl Environ Microbiol, 82(6), pp 1686-1692 Miller G.L (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars", Anal Chem, 31, pp 426-428 Millward-Sadler S J., Poole D M., et al (1994), "Evidence for a general role for highaffinity non-catalytic cellulose binding domains in microbial plant cell wall hydrolases", Mol Microbiol, 11(2), pp 375-82 Motta F L., , , Andrade C C P., ,, et al (2013), "A Review of Xylanase Production by the Fermentation of Xylan: Classification, Characterization and Applications.", Sustainable Degradation of Lignocellulosic Biomass - Techniques, Applications and Commercialization, Anuj Chandel and Silva Silvio Silverio Da, InTech, Croatia, pp Nguyễn Sỹ Lê Thanh and Quyền Đình Thi (2008), "Aspergillus niger strain DMS1957 xylanase D (XlnD) mRNA, complete cds", Genbank (International Nucleotide Sequence Database Collaboration), from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU861039 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 Nguyễn Sỹ Lê Thanh and Quyền Đình Thi (2008), "xylanase D [Aspergillus niger]", Genbank (International Nucleotide Sequence Database Collaboration), from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ACF75334.1 O'Fagain C., Cummins P M., et al (2017), "Gel-Filtration Chromatography", Methods Mol Biol, 1485, pp 15-25 Oyeagu C.E., Mlambo V., et al (2019), "Effect of Dietary Supplementation of Aspergillus Xylanase on Broiler Chickens Performance %J Iranian Journal of Applied Animal Science", 9(4), pp 693-708 Polizeli M L., Rizzatti A C., et al (2005), "Xylanases from fungi: properties and industrial applications", Appl Microbiol Biotechnol, 67(5), pp 577-91 Prasertsan P., Kittikul A., et al (1997), "Optimization for xylanase and cellulase production from Aspergillus niger ATTC 6275 in palm oil mill wastes and its application.", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 13, pp 555–559 research Grand view, Green Technology And Sustainability Market Size, Share & Trends Analysis Report By Component (Solution, Services), By Technology (IoT, Digital Twin, Cloud Computing, Blockchain), By Application, By Region, And Segment Forecasts, 2022 - 2030, in Green Technology And Sustainability Market Size Report, 2030 2017 - 2022 Sakka Kazuo, Maeda Yoshitaka, et al (1991), "Purification and Some Properties of Xylanase from Clostridium stercorarium Strain HX-1", Agricultural and Biological Chemistry, 55(1), pp 247-248 Samanta A.K., Atul P Kolte, et al (2011), "A simple and efficient diffusion technique for assay of endo β-1,4-xylanase activity", Brazilian Journal of Microbiology 42(4), pp 1349-1353 Soni M., Mathur C., et al (2020), "Xylanase in Waste Management and Its Industrial Applications", Waste to Energy: Prospects and Applications, Kashyap B.K., Solanki M.K., Kamboj D.V., and Pandey A.K., Springer, Singapore, pp 393-414 Starzyme, "Xylanase Enzyme", from http://www.starbiozyme.com/product/xylanaseenzyme Store Market Research (2020), "Xylanase Market Research Report", Xylanase market, from https://www.marketresearchstore.com/market-insights/xylanase-market-798479 Subramaniyan S and Prema P (2002), "Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology, and application", Crit Rev Biotechnol, 22(1), pp 3364 Sunson, "Alkaline xylanase SX25 for paper industry", from http://www.sunsonenzyme.com/Products/Paper_enzymes/2020/0423/282.html Sunson, "Neutral xylanase powder for food feed brewing and starch processing", Single enzyme, from https://www.sunsonzymes.com/product/1/50/94/detail Taneja K., Gupta S., et al (2002), "Properties and application of a partially purified alkaline xylanase from an alkalophilic fungus Aspergillus nidulans KK-99", Bioresour Technol, 85(1), pp 39-42 UniProt, "Aspergillus xylanase", from https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=aspergillus%27s%20xylanase UniProt, "B5AMY9 · B5AMY9_ASPNG", from https://www.uniprot.org/uniprotkb/B5AMY9/entry Wong K K., Tan L U., et al (1988), "Multiplicity of beta-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications", Microbiol Rev, 52(3), pp 305-17 Wongwisansri S., Promdonkoy P., et al (2013), "High-level production of thermotolerant beta-xylosidase of Aspergillus sp BCC125 in Pichia pastoris: characterization and its application in ethanol production", Bioresour Technol, 132, pp 410-3 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Tính chất gen mã hóa cho xylanase lồi phổ biến thuộc chi Aspergillus TT Tên loài/chủng Mã Tên gen Aspergillus niger P553 30 XYNB_ASPNG (xlnB,xyn2,xynG1) Aspergillus niger O000 89 XYND_ASPNG (xlnD) Aspergillus niger P553 29 XYNA_ASPNG (xynA) Aspergillus niger Q125 50 XYN4_ASPNG (XYN4) Aspergillus niger (strain ATCC MYA4892 / CBS 513.88 / FGSC A1513) A2Q 7I0 XYNB_ASPNC (xylB,xynG1, An01g00780) Aspergillus niger (strain ATCC MYA4892 / CBS 513.88 / FGSC A1513) A2Q FV7 XYNC_ASPNC (xlnC, An03g00940) Aspergillus niger (strain ATCC MYA4892 / CBS 513.88 / FGSC A1513) Aspergillus niger (strain ATCC MYA4892 / CBS A2R 4D1 A2R 5W7 XYN5_ASPNC (XYN5, An14g07390) XLNR_ASPNC (xlnR, An15g05810) Chiều dài (bp) Protein mã hóa Phân loại Kích thước protein (kDa) 225 Endo-1,4-βxylanase B (Xylanase B) GH11 24,057 804 Exo-1,4-βxylosidase xlnD (Xylobiase xlnD) GH3 87,211 211 Endo-1,4-βxylanase A (Xylanase A) GH11 22,642 211 Endo-1,4-betaxylanase (Xylanase 4) GH11 22,669 225 Endo-1,4-βxylanase B (Xylanase B) GH11 24,057 327 Endo-1,4-βxylanase C (Xylanase C) GH10 35,486 211 Endo-1,4-betaxylanase (Xylanase 5) GH11 22,639 945 Yếu tố kích hoạt phiên mã xylanolytic (Xylanase regulator) XlnR/ xlr1 102,090 513.88 / FGSC A1513) Aspergillus niger C5J4 11 XYNC_ASPNG (xlnC) 10 Aspergillus niger O428 04 XLNR_ASPNG (xlnR) 11 Aspergillus niger Q125 49 XYN5_ASPNG (XYN5) 12 Aspergillus niger Q6Q J75 XYN6_ASPNG (XYN6) 327 Endo-1,4-βxylanase C (Xylanase C) GH10 35,476 945 Yếu tố kích hoạt phiên mã xylanolytic (Xylanase regulator) XlnR/ xlr1 102,073 211 Endo-1,4-betaxylanase (Xylanase 5) GH11 22,794 211 Endo-1,4-betaxylanase (Xylanase 6) GH11 22,561 PHỤ LỤC Chi tiết giải trình tự mRNA gen xlnD từ chủng Aspergillus niger DMS1957: ATGTCGCACC CCCAACAGAA TCTCCTCGCC ACCACAACCT CCAACACCAA 51 AGCAGGCAAT CCCGTCTTCC CCGGCTGGTA CGCCGACCCC GAAGCACGCC 101 TCTTCAACGC CCAGTACTGG ATCTACCCAA CCTACTCAGC CGACTACAGC 151 GAACAAACCT TCTTCGATGC CTTCAGCTCC CCCGATCTAC TCACTTGGAC 201 TCACTTGGAC ACCATCCTAA ACATCGCTAA TATCCCTTGG TCAACGAACC 251 GTGCCGCTTG GGCCCCGTCC GTGGGCCGGA AACTCCGCTC CTCCGCCAAC 301 GCCGAAGAAG AATATGACTA CTTCATGTAT TTCTCCGTTG GTGATGGAAC 351 TGGCATCGGT GTTGCGAAAT CGACCACGGG GAAACCTGAG GGTCCCTATG 401 AAGACGTCCT CGGTGAACCT CTAGTTAATG GCACAGTGTA TGGGGCGGAG 451 GCCATTGATG CCCAGATATT TCAAGATGAT GATGGCCGGA ATTGGTTGTA 501 TTTTGGGGGT TGGAGTCATG CAGTTGTTGT GGAATTGGGC GAGGATATGA 551 TTAGTCTGAA GGGGGATTAT TTGGAGATTA CCCCGGAGGG GTATGTGGAA 601 GGCCCGTGGA TGTTGAAGAG GAATGGGATT TATTATTATA TGTTTTCGGT 651 TGGGGGATGG GGCGATAATT CATACGGAGT CAGTTATGTC ACGGCTGATT 701 CGCCGACGGG GCCGTTCTCG AGTACACCAA AGAAGATTCT ACAAGGGAAT 751 GATGCCGTTG GCACGAGTAC TGGGCACAAT AGTGTGTTTA CGCCGGATGG 801 ACAAGATTAC TATATTGTCT ATCATCGTCG ATATGTCAAC GACACGGCCC 851 GGGATCATCG CGTGACTTGT ATAGATCGCA TGTACTTCAA TGAGGCTGGG 901 GAAATCCTAC CGGTGAATAT CACTCTAGAG GGTGTTGAGG GGAGGACTTT 951 ATCGTAG // PHỤ LỤC Trình tự suy đốn 318 acid amin xylanase D từ Aspergillus niger DMS1957: 10 20 30 40 50 MSHPQQNLLA TTTSNTKAGN PVFPGWYADP EARLFNAQYW IYPTYSADYS 60 70 80 90 100 EQTFFDAFSS PDLLTWTKHP 110 AEEEYDYFMY 120 FSVGDGTGIG 160 AIDAQIFQDD 170 DGRNWLYFGG 210 GPWMLKRNGI 220 YYYMFSVGGW 260 DAVGTSTGHN 310 EILPVNITLE 270 SVFTPDGQDY 318 GVEGRTLS // TILNIANIPW STNRAAWAPS 130 VAKSTTGKPE 180 WSHAVVVELG 230 GDNSYGVSYV 280 YIVYHRRYVN 140 GPYEDVLGEP 190 EDMISLKGDY 240 TADSPTGPFS 290 DTARDHRVTC VGRKLRSSAN 150 LVNGTVYGAE 200 LEITPEGYVE 250 STPKKILQGN 300 IDRMYFNEAG