Đinh minh nhật xác định ethylene glycol và diethylene glycol trong thực phẩm bằng kĩ thuật sắc ký lỏng khối phổ khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH MINH NHẬT XÁC ĐỊNH ETHYLENE GLYCOL VÀ DIETHYLENE GLYCOL TRONG THỰC PHẨM BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH MINH NHẬT MÃ SINH VIÊN: 1801516 XÁC ĐỊNH ETHYLENE GLYCOL VÀ DIETHYLENE GLYCOL TRONG THỰC PHẨM BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS VŨ NGÂN BÌNH ThS BÙI CAO TIẾN Nơi thực hiện: Khoa Hóa phân tích kiểm nghiệm thuốc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Đề tài thực hoàn thành hướng dẫn dạy nhiệt tình anh chị Viện Kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia thầy Trường đại học Dược Hà Nội Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Cao Tiến trực tiếp hướng dẫn dạy cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn TS Vũ Ngân Bình định hướng góp ý cho em q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội, ban lãnh đạo đặc biệt anh chị khoa Độc học – Dị nguyên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt quãng thời gian nghiên cứu đê thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên em sẻ chia khó khăn, động viên giúp đỡ em học tập sống Trong thời gian thực đề tài, nỗ lực cố gắng không tránh khỏi thiếu sót, em kính mong nhận ý kiến góp ý q thầy Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 02 tháng năm 2023 Sinh viên Đinh Minh Nhật i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ethylene glycol 1.1.1 Khái quát chung 1.1.2 Định danh tính chất lý hóa .2 1.1.3 Độc tính 1.2 Tổng quan Diethylene glycol 1.2.1 Khái quát chung 1.2.2 Định danh tính chất lý hóa .4 1.2.3 Độc tính 1.3 Tổng quan phương pháp xác định EG DEG 1.3.1 Một số phương pháp xác định EG DEG giới 1.3.2 Phương pháp LC-MS/MS CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 11 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.2.1 Lựa chọn chất chuẩn nội 12 2.2.2 Khảo sát điều kiện xác định EG LC-MS/MS .12 2.2.3 Khảo sát trình dẫn xuất 13 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 13 2.2.5 Thẩm định phương pháp 13 2.2.6 Ứng dụng phương pháp .13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến 13 2.3.2 Phương pháp thẩm định quy trình phân tích [2,5] .15 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Lựa chọn chất chuẩn nội 21 3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 21 3.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 21 3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 22 3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 22 3.3.1 Khảo sát thể tích benzoyl clorid 24 3.3.2 Khảo sát thời gian tạo dẫn xuất 25 3.3.3 Khảo sát nồng độ NaOH 25 3.4 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 26 ii 3.5 Thẩm định phương pháp phân tích 28 3.5.1 Tính tương thích hệ thống .28 3.5.2 Độ chọn lọc phương pháp .29 3.5.3 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ .30 3.5.4 Đường chuẩn khoảng tuyến tính .30 3.5.5 Độ lặp lại độ thu hồi .31 3.5.6 Độ tái lặp .32 3.6 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng EG DEG thức ăn cho mèo 33 3.7 Bàn luận 33 KẾT LUẬN 34 Kết luận: 34 Kiến nghị: 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 Tiếng Việt 35 Tiếng Anh 35 PHỤ LỤC 37 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt ACN Acetonitrile AOAC Association of Official APCI Atmospheric pressure chemical ionization Acetonitril Hiệp hội cộng đồng phân tích Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí CE Collision energy Năng lượng va chạm CUR Curtain gas Áp suất khí màng CXP Collision cell exit potential Thế khỏi va chạm DEG Diethyelene glycol Diethylene glycol EC European Communities Cộng đồng châu Âu EG Ethylene glycol Ethylene glycol EP Entrance potential Thế cổng vào ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử Cục quản lý Thực phẩm Dượcphẩm Hoa Kỳ FDA Food and drug administration FIA The flow injection analysis Kỹ thuật phân tích dịng chảy Gas chromatography – Flame ionization detector Gas chromatography- Mass spectrometry Sắc ký khí với đầu dị ion hóa lửa GS Ion source gas Áp suất khí nguồn HEAA 2-hydroxyethoxyacetic acid High performance liquid chromatography High resolution gas chromatography – Massspectrometry axit 2-hydroxyethoxyacetic GC-FID GC-MS HPLC HRGCMS Sắc ký khí ghép khối phổ Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký khí độ phân giải cao ghép khối phổ IS Ionspray Voltage Thế ion hóa LCMS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng iv Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt MS Mass spectrometry Khối phổ PD PRSDR PRSDr Reproducibility predicted relative standard deviation Repeatability predicted relative standard deviation Chứng chảy nước mắt Độ lệch chuẩn tương đối tái lập ước tính Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại ước tính Chứng đa niệu nặng PU Q Quadrupole Bộ tứ cực RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN TEM Nhiệt độ nguồn ion Temperature Tài liệu tham khảo TLTK v DANH MỤC BẢNG Bảng - 2: Tính chất lý hóa EG .2 Bảng - Định danh hóa học DEG Bảng - Tính chất lý hóa DEG Bảng - Một số phương pháp dùng xác định EG DEG Bảng - Ưu nhược điểm số phương pháp sử dụng để định lượng EG DEG: .7 Bảng - Danh mục hóa chất thuốc thử 11 Bảng - Quan hệ kỹ thuật phân tích số điểm IP đạt .15 Bảng - Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần 15 Bảng - Tỷ lệ ion kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 15 Bảng - Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác 19 Bảng - Các điều kiện phân tích EG, DEG, EG-D4 ESI (+) - MS/MS 21 Bảng - Các thông số tối ưu thiết bị MS/MS 21 Bảng - Kết tương thích hệ thống .29 Bảng - Kết tính tốn giá trị LOD EG DEG 30 Bảng - Đường chuẩn EG dung môi 30 Bảng - Đường chuẩn DEG dung môi 31 Bảng - Kết độ lặp lại độ thu hồi EG .31 Bảng - Kết độ lặp lại độ thu hồi DEG 31 Bảng - Độ tái lặp EG mẫu thực 32 Bảng - 10 Độ tái lặp DEG mẫu thực .32 Bảng - 11 Bảng kết phân tích mẫu thực thu thập 33 vi DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình - Mơ hình hệ thống LC-MS .9 Hình - Sơ đồ xử lý mẫu dự kiến .15 Hình - Sơ đồ quy trình khảo sát dẫn xuất .23 Hình - Biểu đồ khảo sát lượng benzoyl clorid EG 24 Hình - Biểu đồ khảo sát lượng benzoyl clorid DEG 24 Hình - Biểu đồ khảo sát thời gian dẫn xuất EG .25 Hình - Biểu đồ khảo sát thời gian dẫn xuất DEG 25 Hình - Biểu đồ khảo sát nồng độ NaOH phân tích EG 26 Hình - Biểu đồ khảo sát nồng độ NaOH phân tích DEG 26 Hình - Đồ thị đường chuẩn dung môi DEG .27 Hình - Đồ thị đường chuẩn mẫu thực DEG .27 Hình - 10 Đồ thị đường chuẩn dung mơi EG 28 Hình - 11 Đồ thị đường chuẩn mẫu thực EG 28 Hình - 12 Sắc ký đồ EG, DEG mẫu 29 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, đời sống ngày phát triển, người quan tâm đến vấn đề thực phẩm bẩn, nhiễm độc, chí thức ăn cho động vật Cần phải có biện pháp phù hợp để kiểm tra, quản lý vấn đề nhức nhối Ethylene glycol (EG) Diethylene glycol (DEG) chất độc cần quản lý công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm, đặc biệt thức ăn,… Ngưỡng gây độc DEG người ước tính 1mL/kg DEG ngun chất [22] Cịn EG, ngộ độc EG gây suy gan, suy thận, ảnh hưởng tới tính mạng nồng độ cao Riêng với loài mèo, nhiều nghiên cứu hai chất sử dụng lâu ảnh hưởng đến sức khỏe mèo, chí gây ngộ độc cấp, dẫn tới tử vong Như vậy, hai chất hai chất có độc tính mạnh, gây ảnh hưởng lớn tới sức khoẻ mèo, chí tử vong Vì vậy, cần phải kiểm soát chất thức ăn mèo Hiện có nhiều phương pháp sử dụng để định lượng EG DEG thức ăn cho mèo phương pháp sắc ký khí – khối phổ (GC – MS), sắc ký khí – ion hóa lửa (GC – FID), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC),… Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm định, nhiên phương pháp GC cần thời gian phân tích lâu hơn, khơng phù hợp EG DEG chất có độc tính, cần phân tích nhanh, phương pháp HPLC có LOD LOQ cao, độ đặc hiệu lại kém, cần có phương pháp phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát nồng độ EG DEG thức ăn cho mèo Xuất phát từ nhu cầu đặc tính ưu việt kỹ thuật LC-MS/MS phân tích, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài: “Xây dựng thẩm định phương pháp xác định Ethylene glycol Diethylene glycol thực phẩm sắc ký lỏng khối phổ”, chủ yếu nhóm nghiên cứu hướng tới xác định chất thức ăn cho mèo với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định Ethylene glycol Diethylene glycol thực phẩm cho mèo kỹ thuật LC-MS/MS Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng Ethylene glycol Diethylene glycol số mẫu thực phẩm cho mèo thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt PGS.TS Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2, Nhà xuất Y học Hà Nội, tr.107-122, 168-112 Trần Cao Sơn (2021), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.16-59 Tiếng Anh ACGIH (2001), 2001 TLVs and BEIs: threshold limit values for chemical substances and physical agents and biological exposure indices., American Conference of Governmental Industrial Hygienists, Cincinnati, OH Allison R T., Garratt N J (1989), Solvent systems for thin layer chromatography of biological dyes, Med Lab Sci, pp.113-122 AOAC (2016), Guidelines for Standard Method Performance Requirements Ardrey Robert E (2003), Liquid Chromatography - Mass Spectrometry: An Introduction, UK Band 158, Heft 2, Februar 2016, 109–114 Bonser G M., Clayson D B., et al (1956), The induction of tumours of the subcutaneous tissues, liver and intestine in the mouse by certain dye-stuffs and their intermediates Celeiro, M.; Rubio, L.; Garcia-Jares, C.; Lores, M Miniaturized Sample Preparation Methods to Simultaneously Determine the Levels of Glycols, Glycol Ethers and Their Acetates in cosmetics Cosmetics Cosmetics 2021, 8, 102 10 EC (2021), "Commission implementing regulation (EU) 2021/808", Communities European 11 Fu Wan, Shuping Liu, Li Wang, Shihui Si, A novel salting-out extraction system for determination of ethylene glycol and diethylene glycol in liquid samples followed by GC-FID, Microchemical Journal, Volume 179, 2022, 107491, ISSN 0026-265X, 12 Galina Holloway, Ragine Maheswaran, Alan Leeks, Sanford Bradby, Samir Wahab, Screening method for ethylene glycol and diethylene glycol in glycerin-containing products, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 51, Issue 3, 2010, Pages 507-511, ISSN 0731-7085, 13 Holčapek M., Virelizier H., et al (1999), Trace determination of glycols by HPLC with UV and electrospray ionization mass spectrometric detections, Anal Chem, pp.2288-2293 35 14 Jeanna M Marraffa, Michael G Holland, Christine M Stork, Christopher D Hoy, Michael J Hodgman, Diethylene Glycol: Widely Used Solvent Presents Serious Poisoning Potential11Please see Authors' Note at the end of this article., The Journal of Emergency Medicine, Volume 35, Issue 15 Journal of Analytical Toxicology, Volume 17, Issue 4, July-August 1993, Pages 218–221, 16 Journal of Analytical Toxicology, Volume 24, Issue 7, October 2000, Pages 621– 626, 17 Journal of separation science , Volume31, Issue22, December 2008, Pages 38573863 18 Leila Rodrigues Caldeira, Fernando Diniz Madureira, Thalita De Faria Maia, Carlos Vitor Muller, Christian Fernandes, Simultaneous quantification of ethylene glycol and diethylene glycol in beer by gas chromatography coupled to mass spectrometry, Food Chemistry, Volume 346, 2021,128871, ISSN 0308-8146, 19 Leo J Schep, Robin J Slaughter, Wayne A Temple & D Michael G Beasley (2009) Diethylene glycol poisoning, Clinical Toxicology, 47:6, 525-535 20 Nitschke, L., Huber, L Determination of glycols by HPLC with refractive index detection Fresenius J Anal Chem 349, 451–453 (1994) 21 Pubchem (2022), 1,2-Ethanediol 22 Pubchem (2022), Diethylene glycol 36 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ ảnh hưởng mẫu EG Phụ lục 2: Sắc ký đồ ảnh hưởng mẫu DEG Phụ lục 3: Sắc ký đồ khảo sát lượng benzoyl clorid EG 37 Phụ lục 4: Sắc ký đồ khảo sát lượng benzoyl clorid DEG 38 Phụ lục 5: Sắc ký đồ khảo sát thời gian tạo dẫn xuất EG Phụ lục 6: Sắc ký đồ khảo sát thời gian dẫn xuất DEG 39 Phụ lục 7: Sắc ký đồ khảo sát nồng độ NaOH EG 40 Phụ lục 8: Sắc ký đồ khảo sát nồng độ NaOH 4M DEG Phụ lục 9: Sắc ký đồ độ ổn định hệ thống 41 Phụ lục 10: Sắc ký đồ độ lặp lại độ thu hồi DEG 42 43 Phụ lục 11: Sắc ký đồ độ lặp lại độ thu hồi EG 44 45 Phụ lục 12: Sắc ký đồ đường chuẩn EG Phụ lục 13: Sắc ký đồ đường chuẩn DEG Phụ lục 14: Sắc ký đồ mẫu thực tế thu thập địa bàn thành phố Hà Nội EG 46 47 Phụ lục 15: Sắc ký đồ mẫu thực tế thu thập địa bàn thành phố Hà Nội DEG 48 49