Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của viên nén bao phim Capecitabine 500 mg trên chó bằng máy sắc ký khối phổ siêu hiệu năng UPLC-MS/MS. Điều kiện của sắc ký khối phổ gồm cột sắc ký (C18; 50 × 2,1 mm; 1,7 µm), pha động MeCN – CH3 COONH4 5 mM (90:10), tốc độ dòng: 0,2 mL/ phút, thể tích tiêm: 5 µL. Phương pháp được áp dụng đánh giá dược động học của viên nén Capecitabine 500 mg trên chó thực nghiệm.
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Nghiên cứu sinh khả dụng viên nén Capecitabine 500 mg chó phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Nguyễn Thị Thanh Hằng1, Hồ Anh Sơn1, Đỗ Quyết1 Nguyễn Văn Chuyên1, Vũ Đình Tiến2, Chử Văn Mến1 Học viện Quân y Khoa Dược, Bệnh viện K TÓM TẮT Trong nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng viên nén bao phim Capecitabine 500 mg chó máy sắc ký khối phổ siêu hiệu UPLC-MS/MS Điều kiện sắc ký khối phổ gồm cột sắc ký (C18; 50 ì 2,1 mm; 1,7 àm), pha ng MeCN CH3COONH4 mM (90:10), tốc độ dòng: 0,2 mL/ phút, thể tích tiêm: µL Phương pháp áp dụng đánh giá dược động học viên nén Capecitabine 500 mg chó thực nghiệm Các giá trị Cmax,Tmax, AUC0-24h viên nén Capecitabine 500 mg (thuốc thử) chó thực nghiệm viên Xeloda (Capecitabine 500 mg) (thuốc chứng) lưu hành thị trường 6209,90 ± 2553,31 (ng/ml), 6033,20 ± 1960,53 (ng/ml); 1,69 ± 0,29 giờ; 1,63 ± 0,30 giờ; 12632,40 ± 3851,64 (ngh/ml) 12066,87 ± 3992,88 (ngh/ml) Khoảng tin cậy CI 90% giá trị Tmax, Cmax, MRT AUC0-∞ nằm khoảng cho phép, từ 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 % Như vậy, giá trị Cmax, MRT AUC0-∞ tương ứng thuốc thử T thuốc chứng R tương đương theo quy định FDA Từ khóa: Capecitabine, LC/MS/MS, huyết tương chó, sinh khả dụng ĐẶT VẤN ĐỀ Capecitabine hoạt chất nghiên cứu phát triển tập đoàn dược phẩm Hofmann-La Roche, dùng làm thuốc uống hóa trị, sử dụng điều trị ung thư đại trực tràng, ung thư dày ung thư vú di Tỷ lệ ung thư Việt Nam có xu hướng tăng năm gần đây, nhiên giá thành thuốc Xeloda nhập lại cao Ở Việt Nam nghiên cứu bào chế thành công viên nén chứa Capecitabine 500mg Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu điều trị cần phải có đánh giá so sánh với biệt dược gốc Xeloda để chứng minh thuốc đảm bảo chất lượng.Vì việc nghiên cứu định lượng Capecitabine huyết tương có ý nghĩa quan trọng Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS đánh giá phương pháp có độ nhạy cao, phân tích nhanh, xác ứng dụng nhiều phân tích, định lượng chất dịch sinh học [2,3] Trong nghiên cứu trước, xây dựng thẩm định phương pháp định lượng capecitabine huyết tương chó sử dụng phương pháp LC/ MS/MS cho kết tốt [1] Điều kiện khối phổ gồm cột sắc ký: (C18; 50 × 2,1 cm; 1,7 µm), pha động: MeOH –CH3COONH4 mM (90:10), Ngày nhận bài: 27/10/2020 Ngày phản biện: 02/12/2020 Ngày chấp nhận đăng: 16/12/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 61 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG tốc độ dòng: 0,2 mL/phút, thể tích tiêm: 5µL Phương pháp chúng tơi trình bày kết khả quan độ nhạy, độ xác độ thu hồi Capecitabine phân tích định lượng huyết tương Phương pháp nhanh chóng, độ tin cậy lặp lại tốt phân tích xác Capecitabine nghiên cứu dược động học Phương pháp ứng dụng nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học cho chế phẩm có chứa Capecitabine[1] Trong nghiên cứu này, áp dụng phương pháp xây dựng để đánh giá sinh khả dụng, so sánh thông số dược động học viên nén Capecitabine 500 mg Việt Nam sản xuất chế phẩm Xeloda (Capecitabine 500 mg) Roche sản xuất chó thực nghiệm Kết bước đầu đánh giá chất lượng chế phẩm viên nén Capecitabine Việt Nam sản xuất NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, thiết bị động vật nghiên cứu - Nguyên vật liệu: Mẫu trắng: Huyết tương chó - Ban Đợng vật, Học viện Quân y Chất chuẩn: Capecitabine chuẩn Công ty TNHH dịch vụ thương mại Phạm Nguyễn cung cấp Hãng SX: U.S Pharmacopeia, Số lô SX: R014M0, HSD: 30/04/2021; Độ tinh khiết: 100% Chuẩn nội Felodipin (99,30%) cung cấp Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Thuốc thử (T): viên nén Capecitabine 500 mg; Nơi SX: Công ty CP Dược - TTB Y tế Bình Định (BIDIPHAR); Số lô SX: 0118; Ngày SX: 26/09/2018; HSD: năm Thuốc đối chứng (R): viên nén bao phim Xeloda hàm lượng Capecitabine 500 mg; Nơi SX: Roche, Thụy Sỹ; Số đăng ký: VN- 17939-14; Số lô SX: X4893B03; NSX: 06/07/2017; HSD: 06/07/2020 62 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 Các dung môi bao gồm Methanol, Isopropanol, Ethylacetat, Acid formic…đạt độ tinh khiết theo tiêu chuẩn LC-MS mua từ công ty Merk (Đức) - Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LCMS Xevo TQD (Water – Mỹ), Cân phân tích MS 205 DU (Mettler Toledo – Thụy Sĩ), Thiết bị dung mơi có cấp khí N2 (Thermo – Mỹ), Máy sinh khí nitơ (PEAK – Mỹ), Máy lắc vortex (IKAlabdancer, Đức); Máy lắc ngang (IKA HS 260 basic, Đức) Tất thiết bị dụng cụ phân tích hiệu chuẩn theo quy định ISO/IEC 17025 GLP - Động vật thí nghiệm: chó giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 10 - 12 kg Phương pháp nghiên cứu Điều kiện sắc ký: Thiết bị phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Xevo TQD Water, CBIC/EQm.01.01, cột sắc ký: (C18; 50 × 2,1 mm; 1,7 µm), pha động: MeCN – CH3COONH4 mM (90:10), tốc độ dịng: 0,2 mL/phút, thể tích tiêm: µL Điều kiện khối phổ trình bày bảng Bảng Thông số detector khối phổ Chất phân tích IS Capecitabine Thơng số (Felodipin) Chế độ ion hoá ESI (+) ESI (+) Thế mao quản (kV) 4 Thế Cone (V) 24 20 Nhiệt độ khử solvat (oC) 350 350 Tốc độ khí khử solvat (L/H) 850 850 Tốc độ khí Cone (L/H) 60 60 Năng lượng va chạm (V) 12 10 Ion mẹ (Dalton) 360,5 384,10 Ion (Dalton) 244,02 352,18 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Phương pháp xử lý mẫu Lấy 0,5 mL mẫu huyết tương sau để rã đơng, thêm 20 µL dung dịch chuẩn nội làm việc Lắc xoáy Thêm hỗn hợp ethyl acetat Lắc phút Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút phút Hút 2,2 mL lớp dịch phía trên, bốc dung mơi dịng khí nitơ 400C, hịa tan cắn 0,5mL pha động, tiêm sắc ký Thiết kế nghiên cứu - Bố trí thí nghiệm Tiến hành nghiên cứu: thực 24 cá thể chó đực, khỏe mạnh chia ngẫu nhiên thành nhóm, nhóm 12 Bố trí thí nghiệm theo phương pháp chéo đơi, ngẫu nhiên, đơn liều, giai đoạn, bố đợt cách ngày (do thời gian bán thải Capecitabine 0,55-2,0 h, nên khoảng thời gian thuốc coi đào thải hoàn toàn khỏi thể 10 giờ) Động vật thí nghiệm Giai đoạn Giai đoạn Nhóm Thuốc thử T Thuốc đối chiếu R Nhóm Thuốc đối chiếu R Thuốc thử T + Chọn cá thể chó đực khỏe mạnh, cân nặng 10 - 12 kg/con, theo dõi trước tiến hành thí nghiệm tuần Bữa tối trước ngày dùng thuốc, cho chó ăn nhẹ trước đêm Ngày dùng thuốc, khơng cho chó ăn sáng, cho chó uống viên thuốc cịn ngun vẹn với 50 ml nước tình trạng khơng gây mê cho chó ăn vào thời điểm kể từ sau uống thuốc + Lấy máu bảo quản mẫu huyết tương: Dùng kim vô khuẩn lấy máu tĩnh mạch cẳng chân sau chó, lần lấy khoảng 3ml máu Lấy máu chó cho vào ống ly tâm đánh số có chứa chất chống đông Mẫu máu lấy trước cho chó uống thuốc (0 giờ) sau uống thuốc vào khoảng thời gian 10 phút; 20 phút; 30 phút; 40 phút; 50 phút; 60 phút; 65 phút; 90 phút; 105 phút; 100 phút; 140 phút, 160 phút, 3h, 3,5 h, 4h, 4,5h, 5h, 5,5h, 6h, 8h 9h sau uống thuốc Sau lần lấy máu cho chó uống khoảng 10ml nước dung dịch glucose 5% Sau lấy máu, mẫu máu ly tâm tách huyết tương với tốc độ 5000 vòng/ phút 10 phút nhiệt độ phòng Huyết tương bảo quản lạnh -40oC tiến hành phân tích Thời gian bảo quản huyết tương không 29 ngày Thời gian đợt thử thuốc cách ngày + Xác định thông số dược động học đánh giá kết quả: Định lượng Capecitabine mẫu huyết tương chó sau uống thuốc phương pháp phân tích thẩm định Phân tích mẫu bắt đầu sau lấy đủ mẫu Toàn lượng mẫu (mẫu thuốc thử/thuốc chứng) phân tích ngày Q trình phân tích tn thủ theo hướng dẫn phân tích mẫu học USA – FDA Từ nồng định lượng mẫu huyết tương, vẽ đường cong nồng độ thuốc – thời gian cá thể Xác định thông số dược động học (DĐH) thuốc thử thuốc chứng: Cmax Tmax xác định trực tiếp từ số liệu thực nghiệm thu AUC0-tn xác định gần phương pháp hình thang, tính từ thời điểm đến thời điểm tn (điểm cuối xác định nồng độ thuốc huyết tương cá thể) theo công thức: [AUC ]t0 = ∑ (Ci + Ci +1 )× (ti +1 − ti ) n −1 i =0 Với Ci nồng độ Capecitabine thời điểm lấy mẫu ti AUC0-∞ = AUC0-tn + Cn /Ke Với Cn nồng độ Capecitabine thời điểm lấy mẫu cuối Ke: Hằng số tốc độ thải trừ Đánh giá tương đương sinh học: Đánh giá SKD viên nén bao Capecitabine bào chế với viên đối chứng thông qua so sánh thơng số DĐH TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 63 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG như: Cmax, AUC0-∞, MRT Tmax theo quy định Hai chế phẩm coi tương đương sinh học khoảng tin cậy CI 95% tỷ lệ giá trị trung bình Cmax AUC0-∞ (đã chuyển logarit) thuốc thử thuốc chứng nằm khoảng từ 0,8 – 1,25 Tmax khác khơng có ý nghĩa thống kê Phương pháp xử lý số liệu Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy xác định phần mềm Microsoft Excel 2010 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết định lượng Capecitabine huyết tương chó sau uống thuốc thử thuốc đối chứng Tiến hành xác định nồng độ thuốc thời điểm trước cho chó uống thuốc (0 giờ) sau uống thuốc vào khoảng thời gian 15 phút, 30 phút; 60 phút; 90 phút; 120 phút; 3h, 4h, 5h, 6h, 8h, 10h, 12h 24 h Kết biến thiên nồng độ Capecitabine huyết tương chó thể hình Plasma concentration (ng/mL) 8000 VTB1 LTB1 6000 4000 2000 0 10 12 Time (h) Hình Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian 24 cá thể chó sau uống thuốc thử T thuốc chứng Nhận xét: - Đường cong biểu diễn nồng độ thuốc – thời gian thuốc thử thuốc chứng có điểm lấy mẫu phân bố phù hợp Nồng độ Capecitabine máu nhóm chó uống thuốc thử hầu hết thấp so với chó uống thuốc chứng Tại thời điểm 0,25 giờ, nồng độ Capecitabine định lượng hầu hết mẫu huyết tương chó Từ thời điểm 0,25-10 giờ, nồng độ Capecitabine trung bình huyết tương chó uống thuốc thử thấp thuốc đối chứng không đáng kể từ 10 64 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 đến trước 24 giờ, nồng độ Capecitabine huyết tương chó uống thuốc đối thuốc thử thấp rõ rệt Tại thời lấy mẫu, có dao động nhỏ cá thể, uống chế phẩm thử chế phẩm đối chứng Tất mẫu huyết tương chó uống thuốc có nồng độ Capecitabine nằm khoảng tuyến tính khảo sát, khơng điểm nằm ngồi đường chuẩn Như vậy, phương pháp xây dựng phù hợp với thực tế thử nghiệm đánh giá SKD NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Kết phân tích DĐH so sánh SKD thuốc thử thuốc đối chứng - Xác định thông số dược động học Từ kết định lượng nồng độ Capecitabine huyết tương chó dựa vào phương pháp xác định thông số DĐH ghi phần phương pháp, xác định số thông số DĐH Capecitabine Kết trình bày bảng Bảng Tóm tắt số liệu so sánh sinh khả dụng thuốc Thử so với thuốc Chứng Thơng số Giá trị trung bình thuốc Thử Giá trị trung bình thuốc Chứng Tỷ lệ giá trị trung bình thuốc Thử/Chứng (%) Khoảng tin cậy 90% Cmax 6209,90 6013,20 102,9 100,9 – 103,5 AUC0-t 12632,4 12066,9 104,7 100,2 – 100,8 AUC0-∞ 12632,6 12067,0 104,7 100,2 – 100,8 Kết bảng cho thấy: Giá trị Cmax huyết tương chó trung bình uống thuốc thử 6209,90 ± 2553,31 (ng/ml) thuốc chứng 6033,20 ± 1960,53 (ng/ml) Như vậy, Cmax dao động nhỏ nhóm chó uống thuốc thử (CV = 41,12 %) nhóm chó uống thuốc chứng (CV = 32,50%) Sự khác biệt nhóm khơng có ý nghĩa thống kê Giá trị AUC0-24 uống thuốc thử 12632,40 ± 3851,64 (ng.h/ml), uống thuốc chứng 12066,87 ± 3992,88 (ng.h/ml) Như vậy, giá trị AUC0-24 có dao động Giá trị CV AUC0-24 nhóm uống thuốc thử thuốc chứng 30,49 % 33,09% Tỷ lệ (%) AUC0-24/AUC0-∞ trung bình đạt 99% Như vậy, thời gian lấy mẫu cuối (24 giờ) thoả mãn yêu cầu đánh SKD theo quy định FDA Thời gian để đạt nồng độ cực đại huyết tương chó Tmax trung bình uống thuốc thử thuốc chứng 1,69 ± 0,29 1,63 ± 0,30 Tmax thuốc thử thuốc chứng dao động từ đến Từ kết thông số DĐH cho thấy: Các chó lựa chọn cho thí nghiệm tương đối đồng nhau, có dao động nhỏ cá thể Ảnh hưởng khác trình tự thử, nhóm cá thể chó lựa chọn ngẫu nhiên để nghiên cứu, mẫu thuốc thử mẫu thuốc chứng, giai đoạn thử thuốc đến biến phụ thuộc ln[AUC0-∞], ln[Cmax] ln[MRT] khác khơng có ý nghĩa thống kê với giá trị p > 0,05 Nghĩa là, mức độ hấp thu Capecitabine vào máu, nồng độ cực đại máu chó thực nghiệm thời gian lưu trú trung bình Capecitabine uống thuốc thử (T) thuốc chứng (R) tương đương nhau, khác khơng có ý nghĩa thống kê Khoảng tin cậy CI 90% giá trị Tmax, Cmax, MRT AUC0-∞ nằm khoảng cho phép, từ 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 % Như vậy, giá trị Cmax, MRT AUC0-∞ tương ứng thuốc thử (T) thuốc chứng (R) tương đương theo qui định FDA KẾT LUẬN Trong nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng viên nén bao phim Capecitabine 500 mg chó máy sắc ký khối phổ siêu hiệu UPLC-MS/MS Phương pháp áp dụng đánh giá dược học viên nén Capecitabine 500 mg chó thực nghiệm Các giá trị Cmax,Tmax, AUC0-24h viên nén Capecitabine 500 mg (thuốc thử) 24 chó thực nghiệm viên TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 65 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Xeloda (Capecitabine 500 mg) (thuốc chứng) lưu hành thị trường 6209,90 ± 2553,31; 6033,20 ± 1960,53 (ng/ml); 1,69 ± 0,29; 1,63 ± 0,30 giờ; 12632,40 ± 3851,64 12066,87 ± 3992,88 (ngh/ml) Khoảng tin cậy CI 90% giá trị Tmax, Cmax, MRT AUC0-∞ nằm khoảng cho phép, từ 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 % Các giá trị Cmax, MRT AUC0-∞ tương ứng thuốc thử (T) thuốc chứng (R) tương đương theo quy định FDA ABSTRACT Assessment of the bioavailability of capecitabine 500 mg tablet in canines using LC/MS/MS method In this study, we evaluated the bioavailability of a 500 mg Capecitabine film-coated tablet in canines using LC/MS/MS method Conditions of liquid chromatography-mass spectrometry include chromatographic column: (C18; 50 ì 2.1 mm; 1.7 àm), mobile phase: MeCN - CH3COONH4 mM (90:10), flow: 0.2 mL / min, injection volume: 5µL The method was applied on pharmacokinetic assessment of Capecitabine tablets 500 mg in canines Cmax, Tmax, and AUC0-24h values of Capecitabine 500 mg tablets (T) in canines and Xeloda tablets (Capecitabine 500 mg-R) that have been circulated in the market are 6209.90 ± 2553.31(ng/ ml), 6033.20 ± 1960.53 (ng/ml); 1.69 ± 0.29 hours; 1.63 ± 0.30 hours; 12632.40 ± 3851.64 (ng / ml) and 12066.87 ± 3992.88 (ng / ml), respectively Confident interval of 90% of Tmax, Cmax, MRT and AUC0-∞ values are within the allowed range, from 0.8 to 1.25 or 80 to 125% Thus, the values of Tmax, Cmax, MRT and AUC0-∞, respectively between T and R group are equivalent according to FDA regulations Keywords: Capecitabine, LC/MS/MS, canine plasma, bioavailability TÀI LIỆU THAM KHẢO Chử Văn Mến, Vũ Đình Tiến (2020), “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng capecitabine huyết tương chó phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, số 1&2 tháng 1, năm 2020, trang 120-124 Xiumei Lu., Lingyun Chen., Dong Wang., Juan Liu., Yanjuan Wang., Famei Li (2008), “Quantification of Clarithromycin in Human Plasma by UPLC - MS - MS”, Shenyang Pharmaceutical University, June 2008 Syed N Alvi., Saleh Al Dgither and Muhamad M Hammami (2016), “Rapid Determination of Clarithromycin in Human Plasma by LCMS/MS Assay”, Pharmaceutical Analytical Chemistry Open Access, pp 2471 - 2695 Guidance for industry - Bioanalytical method validation, FDA 2018 Guidance on Bioanalytical method validation, EMA 2012 66 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 ... Trong nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng viên nén bao phim Capecitabine 500 mg chó máy sắc ký khối phổ siêu hiệu UPLC-MS/MS Phương pháp áp dụng đánh giá dược học viên nén Capecitabine 500 mg chó. .. nghiên cứu này, chúng tơi áp dụng phương pháp xây dựng để đánh giá sinh khả dụng, so sánh thông số dược động học viên nén Capecitabine 500 mg Việt Nam sản xuất chế phẩm Xeloda (Capecitabine 500. .. pháp nhanh chóng, độ tin cậy lặp lại tốt phân tích xác Capecitabine nghiên cứu dược động học Phương pháp ứng dụng nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học cho chế phẩm có chứa Capecitabine[ 1]