Luận văn thạc sỹ xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn hà nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LCMSMS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ HỒNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRẦN THỊ HỒNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO Hà Nội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran ....................................................... 3 1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? ...................................................................................... 3 1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran ................................................................................. 3 1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran……………………… …….6 1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm ..................................... 6 1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV ....................................................... 6 1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assayELISA) ........................................................................................................................ 7 1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .............................................. 8 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 11 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu..................................................... 11 2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu...................................................................... 11 2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 11 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 12 2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 12 2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................................. 18 2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23 2.3.1. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 23 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................................ 24 2.3.3 Pha chế chất chuẩn ........................................................................................... 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27 3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS ......... 27 3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ ..................................................................... 27 3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29 3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient ....................................................................... 30 3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu .......................................................................... 33 3.2. Thẩ m đinh ̣ phƣơng pháp .................................................................................... 38 3.2.1 Tính đặc hiệu .................................................................................................... 38 3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn ............................................................................... 38 3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ......................... 43 3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................................... 46 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 1.1 Nội dung Cấ u trúc hóa ho ̣c của mô ̣t số chấ t nhóm nitrofuran Trang 4 đƣơ ̣c xác đinh ̣ trong đề tai Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 27 Bảng 3.2 Kết quả bắn phá các ion mẹ 28 Năng lƣợng bắn phá và các ion con của các chất 29 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 chuyển hóa nitrofuran Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 35 chiết lỏng – lỏng Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng 37 chiết pha rắn Bảng 3.6 So sánh độ thu hồi của 2 quá trình chiết 37 Bảng 3.7 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn 41 Bảng 3.8 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội 43 chuẩn Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của AOZ trên nền mẫu thịt 44 Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện của AMOZ trên nền mẫu thịt 45 Bảng 3.11 Giới hạn phát hiện của AHD trên nền mẫu thịt 45 Bảng 3.12 Giới hạn phát hiện của SEM trên nền mẫu thịt 46 Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 47 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 mẫu thịt lợn tại 1 ppb Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền 48 mẫu thịt lợn tại 1,5 ppb Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền mẫu thịt lợn tại 2 ppb 49 Bảng 3.16 Kết quả phân tích trên mẫu thực 51 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Nội dung Trang Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ 13 Hình 2.2 Sơ đồ phân tích khối phổ 3 tứ cực 16 Hình 2.3 Các bƣớc của quá trình chiết pha rắn 19 Hình 3.1 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 30 1 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.2 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 31 2 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.3 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 31 3 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.4 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 32 4 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.5 Sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 32 5 ở nồng đồ 20 ng/ml Hình 3.6 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 35 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng quy triǹ h chiế t lỏng - lỏng Hình 3.7 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 38 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/ml sƣ̉ du ̣ng quy trình chiế t pha rắ n Hình 3.8 Đƣờng chuẩn AOZ sử dụng nội chuẩn 39 Hình 3.9 Đƣờng chuẩn AMOZ sử dụng nội chuẩn 39 Hình 3.10 Đƣờng chuẩn SEM sử dụng nội chuẩn 40 Hình 3.11 Đƣờng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40 Hình 3.12 Đƣờng chuẩn AOZ không sử dụng nội chuẩn 41 Hình 3.13 Đƣờng chuẩn AMOZ không sử dụng nội chuẩn 42 Hình 3.14 Đƣờng chuẩn AHD không sử dụng nội chuẩn 42 Hình 3.15 Đƣờng chuẩn SEM không sử dụng nội chuẩn 43 Hình 3.16 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 47 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 1 ng/g Hình 3.17 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p 48 nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 1,5 ng/g Hình 3.18 Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p nitrofuran ta ̣i mƣ́c nồ ng đô ̣ 2 ng/g 49 DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt CAD Collision Gas Presure Áp suất khí mang trong tứ cực Q2 CE Collision Energy Thế áp vào tứ cực Q CUR Curtain Gas Khí mang CXP Collision Cell Exit Potential Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3 DP Declustering Potential Thế đầu vào áp vào màn chắn EP Entrance Potential Thế áp vào nguồn ion mẹ ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử EU European Union Liên minh châu Âu GS1 Ion Source Gas 1 Áp suất khí hai bên đầu phun GS2 Ion Source Gas 2 Áp suất của luồng khí nóng HPLC High performance liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu năng cao IP Identification point Điể m nhâ ̣n da ̣ng IS IonSpray Voltage Thế ion hóa LC – MS Liquid chromatography – mass spectrometry Sắc kí lỏng khối phổ LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quality Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol Methanol Minimum required Yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ nhất performance limit của phƣơng pháp Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối MRPL RSD% SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn TEM Temperature Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợc cả xã hội quan tâm, đặc biệt là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợc sử dụng cho vào thức ăn gia súc để kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điều trị dự phòng, điều trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản...Vì vậy sự tồn dƣ của chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợng chất chuyển hóa của nitrofuran trong số lƣợng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớc Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nƣớc này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại thực phẩm nhập khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lƣu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong đó có nitrofuran [9]. Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn 1 đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp “Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran 1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thƣờng đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣởng, chủ yếu đối với gia súc (nhƣ gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu [12]. 1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran Các chất nhóm n itrofuran bao gồ m Furazolidone, furaltadone, furazolidone, nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vâ ̣t nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kế t trong các mô tồ n ta ̣i trong nhiề u tuầ n sau khi sƣ̉ du ̣ng [12]. Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa của nitrofurazone nhƣ sau : 3 Bảng 1.1: Cấ u trúc hóa ho ̣c của mô ̣t số chấ t nhóm nitrofuran đƣơ ̣c xác đinh ̣ trong đề tài Khố i STT Các chất nitrofuran Công thƣ́c phân tƣ̉ lƣơ ̣ng phân tƣ̉ (g/mol) 1 AOZ 3-amoni-2-oxazolidinone C3H6N2O2 102,09 C10H9N3O4 235,2 C8H15N3O3 201,22 C15H18N4O5 334,33 C3H5N3O2 116,05 C10H8N4O4 248,19 NPAOZ 2 3-(2-nitrobenzylidenamino)2-oxazolidinone) AMOZ 3 3-amoni-5-morpholinomethyl -1,3-oxazolidinone NPAMOZ 5-(morpholinomethyl)-3-(2- 4 nitrobenzylidenamino)-2oxazolidinone 5 AHD 1-aminohydantoin NPAHD 6 [3-(2-nitrobenzylidenamino) -2,4-imidazolidinedione] 4 Công thƣ́c cấ u ta ̣o 7 SEM CH5N3O semicarbazide 75,08 NPSEM 8 3[(2-nitrophenyl)methylene]- C8H8N4O3 208,174 hydrazinecarboxamide 1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran McCracken và các cô ̣ng sƣ̣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng ứng liên kết trong các mô. Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ̀ nitrofuran đã kìm hãm hoặc phá hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không phát triển và không sinh sản đƣợc nữa. Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram dƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng tố t trong viê ̣c giê ̣t trƣ̀ giun đũa [7]. Với n ồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn. Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong viê ̣c diê ̣t khuẩ n salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡng. Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng nhanh. Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến [7], khi thƣ̣c phẩ m có tồ n dƣ nitrofuran và các dẫn xuấ t của nó . Do đó hầ u hế t các nƣớc trên thế giới đã cấ m sƣ̉ du ̣ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bô ̣ Nông nghiê ̣p và phát triể n nông thôn đã quyế t đinh ̣ cấ m sƣ̉ du ̣ng ni trofuran cho vào trong thƣ́c ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy 5 định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. 1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơ ̣c phát hiện thấ y trong thịt gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nƣớc EU từ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25]. Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấy trong sản phẩm gia súc và gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm tôm, mật ong và thịt hộp [25]. Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran trong tôm [11]. Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS . Nguyễn Quố c Ân , phó trƣởng phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lấ y tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lô ̣t) với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 0 – 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trắ ng ta ̣i Phú Mỹ – Bình Định nhiễm AOZ với hàm lƣơ ̣ng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lô ̣t ta ̣i Cầ n Guô ̣c – Long An nhiễm SEM với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 2 – 2,2 ng/g [1]. 1.4. Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran Hiê ̣n nay có nhiề u phƣơng pháp để xác đinh ̣ kháng sinh nhóm nitrofuran , bao gồ m: phƣơng pháp sắ c ký lỏng v ới detector UV , phƣơng pháp vi sinh (kỹ thuật Elisa), phƣơng pháp sắ c ký lỏng với detector MS/MS. 1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector tử ngoại khả kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của 6 nó trong một số đối tƣợng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC – UV. Phƣơng pháp dựa trên sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate, làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kế t hơ ̣p với detector UV ở bƣớc sóng 275nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 5 và 10 µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ với độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18]. Tác giả Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận của lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợc 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg [21]. Phƣơng pháp HPLC -UV có ƣu điể m là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng phân tić h rô ̣ng raĩ . Tuy nhiên phƣơng pháp la ̣i không đáp ƣ́ng đƣơ ̣c yêu cầ u về đô ̣ nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t tới (MRPL) là 1 µg/kg. 1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assayELISA) Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme, enzyme sẽ thủy phân thành một chất có màu . Phòng thí nghiệm randox của Anh đã nghiên cứu xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran sử dụng phƣơng pháp Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣờng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28]. Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng thể đặc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứng với quy trình xử lý mẫu: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA 7 trong môi trƣờng axit HCl , sau đó trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,13 µg/kg, CCα = 0,3 µg/kg [25]. Diblikova và cộng sự (2005) giới thiê ̣u kỹ thuật Elisa trực tiếp, sử dụng kháng thể đặc hiệu cho NPAOZ, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AOZ trong tôm, thịt gà, thịt lợn, thịt bò với CCβ là 0,4 µg/kg, độ thu hồi từ 66 – 119% [20]. Lui và cộng sự (2007) giới thiê ̣u kỹ thuật Elisa gián tiếp, sử dụng kháng thể NFT, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nƣớc. Giới hạn phát hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31]. Tƣơng tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà và cá với giới hạn phát hiện lần lƣợt là 0,19; 0,24; 0,18 µg/kg [15]. Phƣơng pháp Elisa đáp ƣ́ ng đƣơ ̣c yêu cầ u về đô ̣ nha ̣y , đơn giản dễ thƣ̣c hiê ̣n , tuy nhiên đô ̣ đă ̣c hiê ̣u bi ̣giới ha ̣n vì phải đánh dấ u cho tƣ̀ng kháng thể chuyên biê ̣t cho tƣ̀ng đố i tƣơ ̣ng. 1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời dƣ lƣơ ̣ng nitrofuran. Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dƣơng hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo khối lƣợng. Từ các tín hiệu thu đƣợc, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một cách chính xác. Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thủy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn) đã ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ phân tích dƣ lƣợng liên kết với mô của các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong sản phẩm thủy sản đƣợc thủy phân bằng axit clohydric loãng để thu đƣợc 8 mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyde, sau đó đƣa pH đến 7 và đƣợc chiết bằng ethyl axetat. Dịch chiết đƣợc thổi khô bằng N2 đến cạn, hòa tan cặn, sau đó đo dung dich ̣ mẫu này bằ ng hệ thống LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acetic , kênh B là acetonitril . Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 1 µg/kg [10]. Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi của Thái Lan đƣa ra quy trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) bằng LC/MS/MS giới hạn phát hiện lần lƣợt của từng chất là AHD 0,1 µg/kg; AOZ 0,04 µg/kg; SEM 0,15 µg/kg; AMOZ 0,02 µg/kg [29]. Tác giả Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acetic 0,025%, kênh B là acetonitril , sƣ̉ du ̣ng quy trin ̀ h làm sạch bằng cột chiết pha rắn polymeric trƣớc khi phân tích bằ ng LC/MS/MS và thu đƣợc CCα từ 0,11 – 0,21 µg/kg, CCβ từ 0,19 – 0,36 µg/kg [26]. Trong tài liê ̣u [25] của tác giả M.Vass, tác giả Boket và cộng sự (2007) xác định các chất chuyển hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CCα lần lƣợt của từng chất AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2. Độ thu hồi từ 95,2 – 102,1 %. Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt gia súc, gia cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là amoniacetat 10mM, kênh B là methanol, sƣ̉ du ̣ng quá trình làm sa ̣ch bằng cột chiết pha rắn SPE với chất hấp thụ polystyrene đƣợc kết hợp bằng cách thủy phân các chất chuyển hóa hình thành liên kết trong các mô và đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyde. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,5 – 5 ng/g; giới hạn định lƣợng từ 2,5 – 10 ng/g [12]. Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợn bằng LC/MS/MS với cô ̣t C 18, pha đô ̣ng kênh A là amonifomiat 1mM, kênh B là methanol, sử dụng phƣơng pháp chiế t lỏng – lỏng thu đƣơ ̣c CCα = 0,08 – 0,54 µg/kg và CCβ = 0,10 – 0,66 µg/kg [19]. 9 Tác giả C.Bock và cộng sự đã thẩm định phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS với CCα từ 0,03 – 0,22 µg/kg [14]. Các t ác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác định các chất chuyển hóa nitrofuran trên LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là amoniacetat 20mM, kênh B là methanol có giới hạn định lƣợng 1 µg/kg với CCα = 0,19 – 0,43 µg/kg. Khoảng tuyến tính từ 1 – 10 µg/kg [16]. Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyển hóa nitrofuran trong sữa bằng LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là amoniacet at 0,5mM, kênh B là methanol. Phƣơng pháp có hê ̣ số biế n thiên nhỏ hơn 9,3%, độ tái lập nội bộ nhỏ hơn 13%, CCα từ 0,12 – 0,29 µg/kg, CCβ từ 0,15 – 0,37 µg/kg [22]. Tác giả Caroline Douny và cộng sự (2012), đã xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran, nghiên cứu ứng dụng để đánh giá furanzolidone trong tôm sú ở Việt Nam. Mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte, chiết lỏng – lỏng bằng etylacetat trƣớc khi xác định bằ ng hệ thống LC/MS/MS với pha đô ̣ng kênh A là axit acet ic 0,1%, kênh B là acetonitril thu đƣơ ̣c CCα từ 0,08 – 0,36 µg/kg, CCβ từ 0,12 – 0,61 µg/kg [13]. Tóm lại: Các phƣơng pháp (phƣơng pháp sắ c ký lỏng với detector UV -VIS, phƣơng pháp hóa sinh Elisa , phƣơng pháp s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm chung là thủy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành các dẫn xuất tƣơng ứng. Các dẫn xuất này sau đó đƣợc chiết lỏng lỏng hoặc chiết pha rắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là có độ nhạy rất tốt, thƣờng từ 0,1 µg/kg có độ chọn lọc cao và có độ chính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm. Do đó trong nghiên cứu đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS với quá trình thủy phân bằng axit clohydric và dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran. 10 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu là các chất chuyển hóa của nitrofuran, bao gồm: AOZ, AMOZ, SEM và AHD. Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan của gia súc gia cầm. Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dƣ̣ng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS. - Ứng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp  Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:  Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,  Điều kiện tách chiết lấ y chấ t phân tić h.  Thẩm định phƣơng pháp:  Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ,  Khoảng tuyến tính,  Độ chụm (độ lặp lại),  Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch). 2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống đang bán trên địa bàn Hà Nội. 11 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ 2.2.1.1. Nguyên tắc chung về phƣơng pháp sắc kí lỏng HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn). Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách dƣới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phan tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau thành từng lớp của mỗi chất. 2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC [8] Trong LC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thƣớc hạt rất nhỏ, từ 3-7µm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết thƣờng chia làm 2 loại: sắc ký pha thƣờng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RPHPLC). Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đƣờng kính hạt 1,7 µm, chịu đƣợc áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tích đó là những ƣu điểm của sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). 2.2.1.3. Pha động trong HPLC [8] Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp. Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc dùng trong sắc ký pha ngƣợc. Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực nhƣ cychlorpentan, n-pentan, nheptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả năng rửa giải, ngƣời ta 12 thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trƣờng hợp này ngƣời ta gọi là chƣơng trình rửa giải gradient. 2.2.1.4. Detector trong HPLC [5] Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Đối với các chấ t chuyể n hóa nhóm nitrofuran có khố i lƣơ ̣ng phân tƣ̉ thấ p không có khả năng hấ p thu ̣ tia UV , có thể tạo dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde ta ̣o sản phẩ m có khả năng hấp thụ tia UV và đƣợc xác định bằng detector HPLC -UV. Hiê ̣n nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấu trúc của các chất phân tích là detector khối phổ. 2.2.1.5. Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry) Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này đƣợc tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất. Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích khối và bộ phận phát hiện. Trƣớc hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn ion, sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ. Ƣu điểm của phƣơng pháp là:  Giúp phát hiện hầu hết các chất tan 13  Độ nhạy cao  Có thể giúp xác định đƣợc các chất tan ngay khi độ phân giải chƣa tốt.  Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất. Cung cấp đầy đủ thông tin về cấu trúc và khối lƣợng 2.2.1.5.1. Bô ̣ nguồn ion (Ion sources) Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá của LC/MS, năng lƣợng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành ion ở thể hơi. Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách để ion hoá phân tử và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi. Sau đây là một số kỹ thuật thƣờng dùng: a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI): Trong phổ EI-MS, dòng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ sợi dây catot vonfram hoặc reni đƣợc đốt nóng sinh ra dòng electron chuyển động vuông góc với mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử hoặc ion mảnh. Thông thƣờng các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng 8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợc hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV . ABC + e → ABC+● + 2e (1) (ion phân tử) ABC+● → A+ + BC● (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa) ABC+● → A+ + B +C● Ƣu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ. Tuy nhiên, một số hợp chất dễ phân mảnh thì thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoặc không thu đƣợc ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dễ bay hơi. b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization- ESI) Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào điện trƣờng mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của bộ 14 phân tích khối phổ. Các giọt tích điện trƣớc khi vào bộ phân tích khối phổ sẽ kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi hết dung môi. Ƣu điểm của ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dƣơng và ion âm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng nhƣ phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, không bền nhiệt, phân cực và không phân cực. c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical Ionization-APCI) Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dƣơng hay âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion đƣợc tạo ra từ các chất khí nhƣ methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4+)... Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các quá trình ion hóa nhƣ sau: Quá trình 1: CH4 + e → CH4+● + CH3+ + CH2+ CH4+● + CH4 → CH5+ + CH3● CH3+ + CH4 → C2H5+ + H2 Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mẫu. CH5+ + M → CH4 + (MH)+ (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1) C2H5+ + M → (MH)+ + C2H4 (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1) C2H5+ + M → (MC2H5)+ (thêm ái lực điện tử thành dạng m/z = M+29) C2H5+ + M → (M-H)+ (hydrua chuyển thành dạng m/z = M-1) Sự thay đổi chất khí trong phản ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn lọc của sự ion hóa và mức độ phân mảnh. Đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao cho 15 phép phân tích định lƣợng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chất có phân tử khối 1000 đơn vị nhƣng đòi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi. 2.2.1.5.2. Bộ phận phân giải khối Sau khi đƣợc ion hóa, chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phân giải khối. Tại đây, các ion đƣợc tách ra khỏi nhau theo tỉ số m/z. Bộ phận phân tích khối đƣợc chia thành 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion tứ cực và bộ phân tích thời gian bay. Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser) và bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) đƣợc sử dụng phổ biến. a) Bộ phân giải tứ cực (Quadrupole Analyser) Tứ cực đƣợc cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể có thể đi qua đƣợc bộ lọc này. Bộ phân giải tứ cực đƣợc phát triển và cho ra đời bộ phận phân giải khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole). Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân giải khối phổ ba tứ cực 16 Bộ phân tích khối phổ ba tứ cực gồm một buồng va chạm (collision cell, đƣợc xem là tứ cực thứ hai Q2) đặt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).  Ở buồng Q1: Các ion đƣợc tách.  Ở buồng Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt nhƣ nitơ, argon, heli nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ion con).  Ở buồng Q3: Làm nhiệm vụ tách các ion con. b) Bộ phân giải bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái với lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờng cong ổn định đƣợc bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hƣớng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợc một phổ khối lƣợng đầy đủ Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợc chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đƣợc các mảnh ion con từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần). Về nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu để có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờng chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần. 2.2.1.5.3. Bộ phận phát hiện Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân giải khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang. Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron 17 thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ đập vào một màn chắn photpho và giải phóng ra các photon. Các photon này đƣợc phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân electron. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đặt trong chân không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn. 2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu 2.2.2.1. Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8] Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan vào 2 pha không trộn lẫn, từ đó tách chiết chất phân tích ra khỏi nền hoặc tách các tạp chất ra khỏi chất phân tích. Cho nên, nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là cho chất tan (chất phân tích) ƣu tiên tan vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạp chất hay các chất khác ở lại trong pha kia. Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo đƣợc các yêu cầu nhất định sau đây: - Dung môi chiết và dịch chấ t mẫu cầ n chiết gọi tắt là hai pha không đƣợc trộn lẫn vào nhau , trong đó dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích. - Hệ số tách   K DA  1 và hiển nhiên là α càng khác 1 càng tốt. Điều K DB kiện tối ƣu là KDA . KDB = 1. - Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để tách hai pha đƣợc tốt. - Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm: pH của dung dịch mẫu, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia… 2.2.2.2. Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn [8] 18 Chiết pha rắn là một phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để tách làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch mẫu bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn. Sau đó chất phân tích đƣợc rửa giải bằng một lƣợng nhỏ dung môi thích hợp. Các chất ảnh hƣởng đƣợc loại bỏ. Cột SPE đƣợc nhồi chặt bằng những vật liệu xốp, hạt nhỏ có các nhóm chức khác nhau. Chất lỏng qua cột dƣới tác dụng của áp suất hoặc chân không. Các bƣớc tiến hành trong quá trình chiết pha rắn: Hình 2.3: Các bước của quá trình chiết pha rắn 1. Hoạt hóa chất hấp phụ pha rắn  Làm ƣớt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ,  Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ,  Không đƣợc để chất hấp phụ bị khô. 1. Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột  Chất phân tích đƣợc làm giàu trên chất hấp phụ,  Một vài thành phần ảnh hƣởng khác cũng có thể bị giữ lại, 19  Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra làm sạch chất phân tích. 2. Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột  Giữ lại chất phân tích,  Nếu mẫu là dung dịch nƣớc, sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nƣớcdung môi hữu cơ,  Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng chính dung môi hữu cơ. 3. Giải hấp chất phân tích bằng dung môi thích hợp  Dung môi đƣợc chọn đặc trƣng đê phá vỡ tƣơng tác giữa chất phân tích và chất hấp phụ với mục đích rửa giải đƣợc chất phân tích với hiệu quả cao,  Dung môi sử dụng rửa giải đồng thời càng ít chất gây ảnh hƣởng tới phép phân tích càng tốt. Chất hấp phụ chiết pha rắn thƣờng đƣợc sử dụng gồm các loại: - Chất hấp thụ pha thƣờng: Các silica trung tính, oxit nhôm, - Chất hấp phụ pha ngƣợc: Các silica đã đƣợc ankyl hóa nhóm OH, - Chất có khả năng trao đổi ion, - Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thƣớc, - Chất hấp phụ pha khí-rắn, Hiện nay, phƣơng pháp chiết pha rắn ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến do những ƣu điểm vƣợt trội sau: - Hiệu suất thu hồi cao, - Khả năng làm giàu, làm sạch các chất phân tích lớn, - Giảm lƣợng dung môi sử dụng, - Có khả năng kết hợp các phƣơng pháp phân tích, - An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt, Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơ chế tƣơng tác pha đảo và tƣơng tác ƣa nƣớc. Pha tĩnh này đƣợc trùng hợp từ hai monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ƣa nƣớc và divinylbenzen 20 có tính kỵ nƣớc. Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là 1.3 cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lƣợng pha tĩnh cao (810 m2/g). Các nhóm chức phân cực của monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lƣu giữ tốt đối với các chất phân tích phân cực đồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng. 2.2.3. Thẩm định phƣơng pháp 2.2.3.1. Tính đặc hiệu Sƣ̉ du ̣ng các p hƣơng pháp xác nhâ ̣n (confirmation method ) là một cách rất tố t để đảm bảo tính đă ̣c hiê ̣u của phƣơng pháp . Hô ̣i đồ ng châu Âu quy đinh ̣ cách tính điểm IP (điể m nhâ ̣n da ̣ng – identification point) đố i với các phƣơng pháp khác nhau để khẳ ng đinh ̣ chắ c chắ n sƣ̣ có mă ̣t của các chấ t . Cách tính điểm IP đƣợc chỉ ra ở phu ̣ lục 3. 2.2.3.2. Khoảng tuyến tính Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn của chất phân tích . Xác định các giá trị đo đƣợc y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đƣờng biểu diễn là một phƣơng trình: y = ax + b và hệ số tƣơng quan: r   ( x  X )( y  Y )  (x  X )  ( y  Y ) i i 2 i Nếu i 0,995 < r2 ≤ 1 : Có tƣơng quan tuyến tính Khi đã xác định đƣợc khoảng tuyến tính, có thể xây dựng phƣơng trình hồi quy của khoảng này, tức là xác định hệ số a và b. Trên đƣờng hồi quy, lấy đoạn tuyến tính làm khoảng xác định (kể cả hai điểm đầu và cuối). 2.2.3.3. LOD, LOQ Tính LOD và LOQ theo biể u thƣ́c: 21  Tính giá trị trung bình x , và độ lệch chuẩn SD LOD = 3 x SD LOQ = 10 x SD Với SD   (x i  x) 2 n 1  Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R = x / LOD là hệ số đánh giá LOD  Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính đƣợc là đáng tin cậy.  Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.  Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R. 2.2.3.4. Độ lặp lại, đô ̣ thu hồ i Độ thu hồi và độ lặp lại đƣợc xác định theo các đại lƣợng SD và RSD nhƣ công thức dƣới đây: Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình. Si : Diện tích píc thứ i n: Số lần đo. SD: Độ lệch chuẩn RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (%). Độ thu hồi của phƣơng pháp theo công thức sau : 22 H%  (Cmc  Cm )  100 C Trong đó: Cm+c : nồng độ nitrofuran xác định đƣợc trong mẫu có thêm chuẩn (ng/g). Cm: nồng độ nitrofuran có trong mẫu (ng/g). C: nồng độ chuẩn nitrofuran đƣợc thêm vào (ng/g). H: độ thu hồi (%). 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các kết quả phân tích trên LC-MS/MS đƣợc tính toán và xử lý bằng phần mềm Analyst, Excel, origin 6.0. Các công thức thống kê tính đô ̣ lă ̣p la ̣i, đô ̣ thu hồ i, tính LOD, LOQ… 2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 2.3.1. Dụng cụ và thiết bị 2.3.1.1. Thiết bị - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt. - Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm). - Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB). - Máy lắc vortex VELP. - Máy đồng nhất mẫu. - Máy li tâm MIKRO 22R. - Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg). - Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g). - Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt. - Bể điều nhiệt 2.3.1.2 Dụng cụ - Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml. - Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml. - Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 µl; 1000 µl; 5 ml…đầu côn. 23 - Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm. - Vial loại 1,8 ml. - Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml. - Ống nghiệm thủy tinh… 2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích 2.3.2.1 Chất chuẩn - AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5% - d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99% - 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98% 2.3.2.2 Hóa chất - Methanol (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%) - Amoni acetate (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 98%) - 2-NBA (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%) - K2HPO4.3H2O (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%) - NaOH (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%) - HCl 37% (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%) - HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất. - 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng methanol. Dung dịch chuẩn bị hằng ngày. - K2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần. 24 - NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần. - CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần. 2.3.3 Pha chế chất chuẩn - Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. - Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lƣợt 1 ml chuẩn AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 3 tháng. - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 1 tháng. - d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. - d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. 25 - Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l: hút lần lƣợt 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l và 13 C15N2-SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 3 tháng. - Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 20 µg/l: hút lần lƣợt 200 µl hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, 13C15N2SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 1 tháng. 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS Phân tích dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran. Các chất chuyển hóa của nitrofuran có khối lƣợng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đặc hiệu cho sự phân mảnh (chủ yếu là mất nƣớc, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện bằ ng MS tƣơng đối thấp. Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran để có đƣợc các hợp chất dẫn xuấ t (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM) với nhiều đặc tính thuận lợi. 3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khố i 3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lƣợng phân tử nhỏ và phân cực. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chệ độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD, SEM 500 ng/ml đã đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đƣa vào detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất, tối ƣu hóa từng ion mẹ, thu đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Khí màn (CUR) 20 psi Khí va chạm (CAD) 8 psi Thế ion hóa (IS) 5000 V Nhiệt độ mao quản (TEM) 4000C Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi Áp suất của luồng khí nóng (GS2) 40 psi 27 Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dƣơng, các ion mẹ có dạng (MH)+ với số khố i m = (M+1) theo phản ƣ́ng: M0 + H+ → (MH)+ Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ Chuyển hóa nhóm Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+H) NPAOZ 235 236 NPAMOZ 334 335 NPSC 208 209 NPAHD 248 249 d4-AOZ 239 240 d5-AMOZ 339 340 211 212 250 251 nitrofuran 13 C-15N2 SEM.HCl D2-AHD.HCl 3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion me ̣ để thu đƣơ ̣c ion con Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê ̣ khối phổ 2 lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn đƣợc ion con là rất quan trọng. Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu đƣợc mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn đƣợc mức năng lƣợng bắn phá thích hợp. Dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn đã đƣợc dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion con đă ̣c trƣng có cƣờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lƣợng. Mảnh ion con m/z có cƣờng độ lớn nhất dùng để định lƣợng, mảnh ion con thứ 2 có cƣờng độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích. Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion con đặc trƣng có cƣờng độ cao nhất. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.3 28 Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất chuyển hóa nitrofuran Chuyển hóa nhóm nitrofuran Ion mẹ (M+H)+ Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V) 134 80 15 10 104 80 27 14 291 80 15 16 262 80 21 16 192 80 11 18 166 80 13 14 134 80 15 18 104 80 27 14 NPAOZ 236 NPAMOZ 335 NPSEM 209 NPAHD 249 d4-AOZ 240 134 80 17 16 d5-AMOZ 340 296 80 15 16 C-15N2 SEM.HCl 212 168 80 13 12 d2-AHD.HCl 251 134 80 15 14 13 Nhâ ̣n xét: Theo qui đinh ̣ của Châu Âu 2002/657/EC, số điể m nhâ ̣n da ̣ng (IP) đƣơ ̣c tin ́ h đố i với kỹ thuật LC/MS/M, tƣơng ƣ́ng với 1 ion me ̣ và 2 ion con, số điể m nhâ ̣n da ̣ng (IP) là 4. Nhƣ vâ ̣y phƣơng pháp đã đáp ƣ́ng đƣơ ̣c yêu cầ u của Châu Âu [phụ lục 4]. Phù hơ ̣p với các nghiên cƣ́u khác của mô ̣t số tác giả nhƣ tác giả Leitner , tác giả D.Tyler của phòng thí nghiệm của Anh… 3.1.2. Lựa chọn cột tách Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thời theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực trung bình nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớc, acid formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha đảo. Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 với các thông số dƣới đây cho các nghiên cứu tiếp theo: - Cột C18 của Agilent có: 29 - Chiề u dài 150mm, - Đƣờng kính 2,1mm, - Cỡ ha ̣t 3,5µm. 3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient pha đô ̣ng Các dẫn xuất của nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát một số chƣơng trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17, 24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol. Cố định các điều kiện sắc ký: - Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm), - Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol, - Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút, - Mẫu phân tích: hỗn hợp dẫn xuấ t nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml. Tiế n hành thí nghiệm theo: a) Chƣơng triǹ h Gradient 1, thu đƣơ ̣c sắ c đồ nhƣ trong hin ̀ h 3.1 : Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 12,00 90 14,00 90 15,00 20 20,00 20 Hình 3.1: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 1 ở nồ ng đô ̣ 20 ng/ml 30 b) Chƣơng trình Gradient 2, thu đƣơ ̣c sắ c đồ trong hình 3.2: Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 5 90 8 90 9 20 12 20 Hình 3.2: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml c) Chƣơng triǹ h Gradient 3, thu đƣơ ̣c sắ c đồ trong hin ̀ h 3.3 : Thời gian (phút) 0,01 % MeOH 20 8 90 10 90 13 20 13,01 20 Hình 3.3: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 3 ở nồng độ 20 ng/ 31 d) Chƣơng trình Gradient 4, thu đƣơ ̣c sắ c đồ trong hình 3.4: Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 10 90 12 90 15 20 15,01 20 Hình 3.4: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 4 ở nồng độ 20 ng/ml e) Chƣơng triǹ h Gradient 5, thu đƣơ ̣c sắ c đồ trong hin ̀ h 3.5: Thời gian (phút) % MeOH 0,01 20 12,00 90 13,00 90 13,01 20 16,00 20 Hình 3.5: sắ c đồ hỗn hơ ̣p chuẩ n khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 5 ở nồng độ 20 ng/ml 32 Bàn luận : - Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thời gian ngắn (chƣơng trin ̀ h gradient 1, gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc của AOZ rất xấu và bị chẻ píc. Hiê ̣n tƣơ ̣ng chẻ pic này là do hàm lƣợng MeOH cao , AOZ tồ n ta ̣i đồ ng thời ở hai da ̣ng là amin bâ ̣c nhấ t R -NH2 và dạng R -NH3+. Do đó , nồ ng đô ̣ MeOH cầ n phải đƣơ ̣c khố ng chế phù hợp, đồ ng nghiã với tăng nồ ng đô ̣ CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin thành dạng R-NH3+. - Chƣơng trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng và có tin ́ hiê ̣u pić rõ ràng . Do đó chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiếp theo. Tóm lại : Các thông số phù hợp cho quá trình tách sắc ký là : - Cột Agilent C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm) - Pha động kênh A (amoniacetat 10 mM) ; kênh B (methanol) theo chƣơng trình gradient 5: - Thời gian (phút) 0,01 12,00 % MeOH 20 90 Tốc độ pha đô ̣ng: 0,4 ml/phút, - Thể tích bơm mẫu : 10 µl, - Nhiệt độ cột: 300C. 13,00 90 13,01 20 16,00 20 3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có một số quy trình đã và đang đƣợc ứng dụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran bao gồm : quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây để tiế n hành thí nghiê ̣m. 3.1.4.1. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng Dự kiến quy trình xử lý mẫu nhƣ sau: 33 Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm  Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml  Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống  Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu  Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C  Trung hòa axit bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây  Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấ y dung dich ̣ mẫu  Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấy lớp trên thổi khô bằng N2  Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)  Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằ ng LC/MS/MS Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết lỏng – lỏng nói trên làm lặp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.4 và sắ c đồ ở hin ̀ h 3.6: 34 Bảng 3.4: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết lỏng – lỏng Chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB phân tích (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) AOZ 8,51 7,66 9,11 AMOZ 9,32 10,2 AHD 6,82 SEM 6,12 SD % RSD H (%) 8,43 0,729 8,65 42,1 7,55 9,01 1,38 15,3 45,0 5,89 7,43 6,71 0,776 11,6 33,7 6,27 5,98 6,12 0,145 2,37 30,6 Hình 3.6: Sắ c đồ mẫu thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p nitrofuran ở mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/g sƣ̉ du ̣ng quy triǹ h chiế t lỏng – lỏng. 3.1.4.2. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn Thƣ̣c hiê ̣n theo sơ đồ sau: 35 Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm  Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml  Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống  Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu  Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C  Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây  Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấ y dung dich ̣ mẫu  Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O  Nạp mẫu vào cột, rửa loại chất bẩn bằng 2 x 2,5 ml H2O  Hút chân không cho khô cột SPE  Rửa giải chấ t phân tích bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm  Thổi khô bằng N2  Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)  Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằ ng LC/MS/MS Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết pha rắn làm lặp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.5 và hình 3.7: 36 Bảng 3.5: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết pha rắn Chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB phân tích (ng/g) (ng/g) (ng/g) (ng/g) AOZ 17,3 18,4 16,9 AMOZ 19,3 18,5 AHD 15,7 SEM 14,3 SD % RSD H (%) 17,5 0,777 4,43 87,7 17,8 18,5 0,750 4,04 92,7 14,8 13,5 14,7 1,11 7,54 73,3 13,2 14,8 14,1 0,818 5,80 70,5 Hình 3.7: Sắ c đồ thiṭ lơ ̣n thêm chuẩ n hỗn hơ ̣p nitrofuran ở mƣ́c nồ ng đô ̣ 20 ng/g sƣ̉ dụng qui trình chiết pha rắn SPE Bảng 3.6: So sánh độ thu hồi của 2 quy trình chiết: AOZ 20 ng/g Chiết SPE H (%) 87,7 Chiết lỏng-lỏng H (%) 42,1 AMOZ 20 ng/g 92,7 45,0 AHD 20 ng/g 73,3 33,7 SEM 20 ng/g 70,5 30,6 Thịt lợn thêm chuẩn 37 Nhâ ̣n xét : Nhìn vào bảng trên ta thấy quy trình chiết SPE cho độ thu hồi cao hơn so với quy trình chiết lỏng lỏng và đáp ứng đƣợc quy định của Châu Âu 2002/657EC. Do đó chúng tôi chọn quy trình chiết SPE cho các nghiên cứu tiếp theo 3.2. Thẩ m đinh ̣ phƣơng pháp 3.2.1 Tính đặc hiệu Phƣơng pháp trên sƣ̉ du ̣ng kỹ thuâ ̣t sắ c ký lỏng khố i phổ 2 lầ n, thƣ̣c hiê ̣n bắ n phá ion mẹ m/z, đinh ̣ lƣơ ̣ng theo ion con ta ̣o thành. Theo cách tính điể m IP thì với 1 ion me ̣ và 2 ion thu đƣơ ̣c 4 điể m IP, nhƣ vâ ̣y phƣơng pháp có tin ́ h đă ̣c hiê ̣u đáp ƣ́ng đƣơ ̣c yêu cầ u của châu Âu 2002/657/EC [32]. 3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn 3.2.1.1. Đường chuẩn của các chất nhóm nitrofuran sử dụng nội chuẩn (để phân tích mẫu thực) Chúng tôi khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích píc sắc kí, tỷ lệ diện tích píc nitrofuran/nội chuẩn vào nồng độ chất phân tích ở các nồng độ khác nhau xác định hệ số tƣơng quan và phƣơng trình đƣờng chuẩn. Theo quy định của Châu Âu các chất nhóm nitrofuran là chất cấm, MRPL về yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ nhất của phƣơng pháp đối với các chất dẫn xuất nhóm nitrofuran là 1 µg/kg, do đó chúng tôi khảo sát xây dựng khoảng đƣờng chuẩn từ 0,5 – 5 ppb, sử dụng các nội chuẩn ở cùng nồng độ 2 ppb để phân tích mẫu thực. Sƣ̉ du ̣ng phầ n mề m origin 6.0 để xây dựng đƣờng chuẩn của các kháng s inh nhóm nitrofuran thu đƣơ ̣c các hin ̀ h 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 và bảng 3.7 dƣới đây: 38 Y = 0.12426 + 0.31607 * X 1.8 Parameter Value Error -----------------------------------------------------------A 0.01426 0.0141 B 0.31607 0.00606 ------------------------------------------------------------ 1.6 1.4 Analyte area/IS area 1.2 1.0 R SD N P -----------------------------------------------------------0.99927 0.02411 6 [...]... VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS” 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran 1.1.1 Nhóm nitrofuran là gì? Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thƣờng đƣợc sử... nitrofuran, bao gồm: AOZ, AMOZ, SEM và AHD Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan của gia súc gia cầm Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dƣ̣ng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xây dựng phƣơng pháp xác định. .. detector MS/MS 1.4.1 Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector tử ngoại khả kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của 6 nó trong một số đối tƣợng thực phẩm Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC – UV Phƣơng pháp dựa trên sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde,... Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS - Ứng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 2.1.2.1 Xây dựng phƣơng pháp  Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:  Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,  Điều kiện... tić h  Thẩm định phƣơng pháp:  Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ,  Khoảng tuyến tính,  Độ chụm (độ lặp lại),  Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch) 2.1.2.2 Ứng dụng phƣơng pháp Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống đang bán trên địa bàn Hà Nội 11 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu... nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ 2.2.1.1 Nguyên tắc chung về phƣơng pháp sắc kí lỏng HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn) Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách dƣới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phan tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất... phƣơng pháp hóa sinh Elisa , phƣơng pháp s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm chung là thủy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành các dẫn xuất tƣơng ứng Các dẫn xuất này sau đó đƣợc chiết lỏng lỏng hoặc chiết pha rắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ Phƣơng pháp này có... 13C15N2SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 1 tháng 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS Phân tích dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran Các chất chuyển hóa của nitrofuran có khối lƣợng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion... vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một cách chính xác Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thủy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn) đã ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký. .. detector khối phổ 2.2.1.5 Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry) Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này đƣợc tách theo tỉ số ... VSATTP, tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran số loại thực phẩm tƣơi sống địa bàn Hà Nội phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”... QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN THỊ HỒNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG... AHD, SEM thực phẩm tƣơi sống kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời chất chuyển hóa của nitrofuran thực phẩm tƣơi sống LC-MS/MS