2.3.1. Dụng cụ và thiết bị
2.3.1.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt.
- Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm). - Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB).
- Máy lắc vortex VELP. - Máy đồng nhất mẫu. - Máy li tâm MIKRO 22R.
- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg). - Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g).
- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt. - Bể điều nhiệt
2.3.1.2 Dụng cụ
- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml. - Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml.
- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm. - Vial loại 1,8 ml.
- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml. - Ống nghiệm thủy tinh…
2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích
2.3.2.1 Chất chuẩn
- AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5% - d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99% - d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99% - 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98%
2.3.2.2 Hóa chất
- Methanol (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%) - Amoni acetate (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 98%) - 2-NBA (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)
- K2HPO4.3H2O (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%) - NaOH (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%) - HCl 37% (Merck hoặc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)
- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nƣớc cất.
- 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng methanol. Dung dịch chuẩn bị hằng ngày.
- K2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần.
- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần.
- CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần.
2.3.3 Pha chế chất chuẩn
- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.
- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200
C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.
- Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.
- Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.
- Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lƣợt 1 ml chuẩn AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 3 tháng. - Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 1 tháng.
- d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200
C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.
- d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200
C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.
- d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 6 tháng.
- Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l: hút lần lƣợt 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l và 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 3 tháng.
- Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 20 µg/l: hút lần lƣợt 200 µl hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, 13C15N2- SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c trong 1 tháng.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS
Phân tích dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran. Các chất chuyển hóa của nitrofuran có khối lƣợng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đặc hiệu cho sự phân mảnh (chủ yếu là mất nƣớc, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện bằng MS tƣơng đối thấp. Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran để có đƣợc các hợp chất dẫn xuất (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM) với nhiều đặc tính thuận lợi.
3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khối 3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ
Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lƣợng phân tử nhỏ và phân cực. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chệ độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD, SEM 500 ng/ml đã đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đƣa vào detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất, tối ƣu hóa từng ion mẹ, thu đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI
Khí màn (CUR) 20 psi
Khí va chạm (CAD) 8 psi
Thế ion hóa (IS) 5000 V
Nhiệt độ mao quản (TEM) 4000C
Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi Áp suất của luồng khí nóng (GS2) 40 psi
Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dƣơng, các ion mẹ có dạng (MH)+ vớ i số khối m = (M+1) theo phản ƣ́ng:
M0 + H+ → (MH)+
Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ
Chuyển hóa nhóm
nitrofuran Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+H)
NPAOZ 235 236 NPAMOZ 334 335 NPSC 208 209 NPAHD 248 249 d4-AOZ 239 240 d5-AMOZ 339 340 13C-15N2 SEM.HCl 211 212 D2-AHD.HCl 250 251
3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion mẹ để thu đƣơ ̣c ion con
Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hệ khối phổ 2 lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn đƣợc ion con là rất quan trọng. Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu đƣợc mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn đƣợc mức năng lƣợng bắn phá thích hợp. Dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn đã đƣợc dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion con đă ̣c trƣng có cƣờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lƣợng. Mảnh ion con m/z có cƣờng độ lớn nhất dùng để định lƣợng, mảnh ion con thứ 2 có cƣờng độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích. Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion con đặc trƣng có cƣờng độ cao nhất. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.3
Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất chuyển hóa nitrofuran
Chuyển hóa nhóm nitrofuran
Ion mẹ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(M+H)+ Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V)
NPAOZ 236 134 80 15 10 104 80 27 14 NPAMOZ 335 291 80 15 16 262 80 21 16 NPSEM 209 192 80 11 18 166 80 13 14 NPAHD 249 134 80 15 18 104 80 27 14 d4-AOZ 240 134 80 17 16 d5-AMOZ 340 296 80 15 16 13C-15N2 SEM.HCl 212 168 80 13 12 d2-AHD.HCl 251 134 80 15 14 Nhâ ̣n xét:
Theo qui định của Châu Âu 2002/657/EC, số điểm nhâ ̣n da ̣ng (IP) đƣợc tính đối với kỹ thuật LC/MS/M, tƣơng ƣ́ng với 1 ion me ̣ và 2 ion con, số điểm nhâ ̣n da ̣ng (IP) là 4. Nhƣ vậy phƣơng pháp đã đáp ƣ́ng đƣợc yêu cầu của Châu Âu [phụ lục 4]. Phù hơ ̣p với các nghiên cƣ́u khác của mô ̣t số tác giả nhƣ tác giả Leitner , tác giả D.Tyler của phòng thí nghiệm của Anh…
3.1.2. Lựa chọn cột tách
Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thời theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực trung bình nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớc, acid formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha đảo. Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 với các thông số dƣới đây cho các nghiên cứu tiếp theo:
- Chiều dài 150mm, - Đƣờng kính 2,1mm, - Cỡ ha ̣t 3,5µm.
3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient pha động
Các dẫn xuất của nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát một số chƣơng trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17, 24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol. Cố định các điều kiện sắc ký:
- Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm),
- Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol, - Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút,
- Mẫu phân tích: hỗn hợp dẫn xuất nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml. Tiến hành thí nghiệm theo:
a) Chƣơng trình Gradient 1, thu đƣơ ̣c sắc đồ nhƣ trong hình 3.1 :
Thời gian (phút) 0,01 12,00 14,00 15,00 20,00
% MeOH 20 90 90 20 20
b) Chƣơng trình Gradient 2, thu đƣợc sắc đồ trong hình 3.2:
Thời gian (phút) 0,01 5 8 9 12
% MeOH 20 90 90 20 20
Hình 3.2: sắc đồ hỗn hợp chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml c) Chƣơng trình Gradient 3, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.3 :
Thời gian (phút) 0,01 8 10 13 13,01
% MeOH 20 90 90 20 20
d) Chƣơng trình Gradient 4, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.4:
Thời gian (phút) 0,01 10 12 15 15,01
% MeOH 20 90 90 20 20
Hình 3.4: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 4 ở nồng độ 20 ng/ml e) Chƣơng trình Gradient 5, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.5:
Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00
% MeOH 20 90 90 20 20
Hình 3.5: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 5 ở nồng độ 20 ng/ml
Bàn luận :
- Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thời gian ngắn (chƣơng trình gradient 1, gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc của AOZ rất xấu và bị chẻ píc. Hiện tƣơ ̣ng chẻ pic này là do hàm lƣợng MeOH cao , AOZ tồn ta ̣i đồng thời ở hai da ̣ng là amin bâ ̣c nhất R -NH2 và dạng R -NH3+. Do đó , nồng đô ̣ MeOH cần phải đƣơ ̣c khống chế phù hợp, đồng nghĩa với tăng nồng đô ̣ CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin thành dạng R-NH3+.
- Chƣơng trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng và có tín hiê ̣u píc rõ ràng . Do đó chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tóm lại : Các thông số phù hợp cho quá trình tách sắc ký là :
- Cột Agilent C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)
- Pha động kênh A (amoniacetat 10 mM) ; kênh B (methanol) theo chƣơng trình gradient 5: Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00 % MeOH 20 90 90 20 20 - Tốc độ pha động: 0,4 ml/phút, - Thể tích bơm mẫu : 10 µl, - Nhiệt độ cột: 300C.
3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu
Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có một số quy trình đã và đang đƣợc ứng dụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran bao gồm : quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây để tiến hành thí nghiê ̣m.
3.1.4.1. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng
Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm
Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml
Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống
Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu
Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400
C
Trung hòa axit bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây
Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấy dung dịch mẫu
Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấy lớp trên thổi khô bằng N2
Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)
Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằng LC/MS/MS
Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết lỏng – lỏng nói trên làm lặp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.4 và sắc đồ ở hình 3.6:
Bảng 3.4: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết lỏng – lỏng Chất phân tích Lần 1 (ng/g) Lần 2 (ng/g) Lần 3 (ng/g) TB (ng/g) SD % RSD H (%) AOZ 8,51 7,66 9,11 8,43 0,729 8,65 42,1 AMOZ 9,32 10,2 7,55 9,01 1,38 15,3 45,0 AHD 6,82 5,89 7,43 6,71 0,776 11,6 33,7 SEM 6,12 6,27 5,98 6,12 0,145 2,37 30,6
Hình 3.6: Sắc đồ mẫu thi ̣t lợn thêm chuẩn hỗn hợp nitrofuran ở mƣ́c nồng đô ̣ 20 ng/g sƣ̉ du ̣ng quy trình chiết lỏng – lỏng.
3.1.4.2. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm
Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml
Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống
Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu
Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C
Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây
Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấy dung dịch mẫu
Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O
Nạp mẫu vào cột, rửa loại chất bẩn bằng 2 x 2,5 ml H2O
Hút chân không cho khô cột SPE
Rửa giải chất phân tích bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm
Thổi khô bằng N2
Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)
Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằng LC/MS/MS
Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết pha rắn làm lặp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.5 và hình 3.7:
Bảng 3.5: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết pha rắn Chất phân tích Lần 1 (ng/g) Lần 2 (ng/g) Lần 3 (ng/g) TB (ng/g) SD % RSD H (%) AOZ 17,3 18,4 16,9 17,5 0,777 4,43 87,7 AMOZ 19,3 18,5 17,8 18,5 0,750 4,04 92,7 AHD 15,7 14,8 13,5 14,7 1,11 7,54 73,3 SEM 14,3 13,2 14,8 14,1 0,818 5,80 70,5
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});