Các dẫn xuất của nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát một số chƣơng trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17, 24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol. Cố định các điều kiện sắc ký:
- Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm),
- Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol, - Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút,
- Mẫu phân tích: hỗn hợp dẫn xuất nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml. Tiến hành thí nghiệm theo:
a) Chƣơng trình Gradient 1, thu đƣơ ̣c sắc đồ nhƣ trong hình 3.1 :
Thời gian (phút) 0,01 12,00 14,00 15,00 20,00
% MeOH 20 90 90 20 20
b) Chƣơng trình Gradient 2, thu đƣợc sắc đồ trong hình 3.2:
Thời gian (phút) 0,01 5 8 9 12
% MeOH 20 90 90 20 20
Hình 3.2: sắc đồ hỗn hợp chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml c) Chƣơng trình Gradient 3, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.3 :
Thời gian (phút) 0,01 8 10 13 13,01
% MeOH 20 90 90 20 20
d) Chƣơng trình Gradient 4, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.4:
Thời gian (phút) 0,01 10 12 15 15,01
% MeOH 20 90 90 20 20
Hình 3.4: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 4 ở nồng độ 20 ng/ml e) Chƣơng trình Gradient 5, thu đƣơ ̣c sắc đồ trong hình 3.5:
Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00
% MeOH 20 90 90 20 20
Hình 3.5: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 5 ở nồng độ 20 ng/ml
Bàn luận :
- Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thời gian ngắn (chƣơng trình gradient 1, gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc của AOZ rất xấu và bị chẻ píc. Hiện tƣơ ̣ng chẻ pic này là do hàm lƣợng MeOH cao , AOZ tồn ta ̣i đồng thời ở hai da ̣ng là amin bâ ̣c nhất R -NH2 và dạng R -NH3+. Do đó , nồng đô ̣ MeOH cần phải đƣơ ̣c khống chế phù hợp, đồng nghĩa với tăng nồng đô ̣ CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin thành dạng R-NH3+.
- Chƣơng trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng và có tín hiê ̣u píc rõ ràng . Do đó chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Tóm lại : Các thông số phù hợp cho quá trình tách sắc ký là :
- Cột Agilent C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)
- Pha động kênh A (amoniacetat 10 mM) ; kênh B (methanol) theo chƣơng trình gradient 5: Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00 % MeOH 20 90 90 20 20 - Tốc độ pha động: 0,4 ml/phút, - Thể tích bơm mẫu : 10 µl, - Nhiệt độ cột: 300C.