2.2.2.1. Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8]
Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan vào 2 pha không trộn lẫn, từ đó tách chiết chất phân tích ra khỏi nền hoặc tách các tạp chất ra khỏi chất phân tích. Cho nên, nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là cho chất tan (chất phân tích) ƣu tiên tan vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạp chất hay các chất khác ở lại trong pha kia.
Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo đƣợc các yêu cầu nhất định sau đây:
- Dung môi chiết và dịch chất mẫu cần chiết gọi tắt là hai pha không đƣợc trộn lẫn vào nhau , trong đó dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích.
- Hệ số tách 1
DB DA
K K
và hiển nhiên là α càng khác 1 càng tốt. Điều kiện tối ƣu là KDA . KDB = 1.
- Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để tách hai pha đƣợc tốt.
- Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm: pH của dung dịch mẫu, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia…
Chiết pha rắn là một phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để tách làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch mẫu bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn. Sau đó chất phân tích đƣợc rửa giải bằng một lƣợng nhỏ dung môi thích hợp. Các chất ảnh hƣởng đƣợc loại bỏ.
Cột SPE đƣợc nhồi chặt bằng những vật liệu xốp, hạt nhỏ có các nhóm chức khác nhau. Chất lỏng qua cột dƣới tác dụng của áp suất hoặc chân không.
Các bƣớc tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:
Hình 2.3: Các bước của quá trình chiết pha rắn 1. Hoạt hóa chất hấp phụ pha rắn
Làm ƣớt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ,
Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ,
Không đƣợc để chất hấp phụ bị khô.
1. Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột
Chất phân tích đƣợc làm giàu trên chất hấp phụ,
Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra làm sạch chất phân tích.
2. Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột
Giữ lại chất phân tích,
Nếu mẫu là dung dịch nƣớc, sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nƣớc- dung môi hữu cơ,
Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng chính dung môi hữu cơ.
3. Giải hấp chất phân tích bằng dung môi thích hợp
Dung môi đƣợc chọn đặc trƣng đê phá vỡ tƣơng tác giữa chất phân tích và chất hấp phụ với mục đích rửa giải đƣợc chất phân tích với hiệu quả cao,
Dung môi sử dụng rửa giải đồng thời càng ít chất gây ảnh hƣởng tới phép phân tích càng tốt.
Chất hấp phụ chiết pha rắn thƣờng đƣợc sử dụng gồm các loại: - Chất hấp thụ pha thƣờng: Các silica trung tính, oxit nhôm,
- Chất hấp phụ pha ngƣợc: Các silica đã đƣợc ankyl hóa nhóm OH, - Chất có khả năng trao đổi ion,
- Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thƣớc, - Chất hấp phụ pha khí-rắn,
Hiện nay, phƣơng pháp chiết pha rắn ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến do những ƣu điểm vƣợt trội sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hiệu suất thu hồi cao,
- Khả năng làm giàu, làm sạch các chất phân tích lớn, - Giảm lƣợng dung môi sử dụng,
- Có khả năng kết hợp các phƣơng pháp phân tích,
- An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt,
Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơ chế tƣơng tác pha đảo và tƣơng tác ƣa nƣớc. Pha tĩnh này đƣợc trùng hợp từ hai monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ƣa nƣớc và divinylbenzen
có tính kỵ nƣớc. Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là 1.3 cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lƣợng pha tĩnh cao (810 m2
/g). Các nhóm chức phân cực của monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lƣu giữ tốt đối với các chất phân tích phân cực đồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng.
2.2.3. Thẩm định phƣơng phá p
2.2.3.1. Tính đặc hiệu
Sƣ̉ du ̣ng các p hƣơng pháp xác nhâ ̣n (confirmation method ) là một cách rất tốt để đảm bảo tính đă ̣c hiê ̣u của phƣơng pháp . Hô ̣i đồng châu Âu quy đi ̣nh cách tính điểm IP (điểm nhâ ̣n da ̣ng – identification point) đối với các phƣơng pháp khác nhau để khẳng đi ̣nh chắc chắn sƣ̣ có mă ̣t của các chất . Cách tính điểm IP đƣợc chỉ ra ở phu ̣ lục 3.
2.2.3.2. Khoảng tuyến tính
Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn của chất phân tích . Xác định các giá trị đo đƣợc y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đƣờng biểu diễn là một phƣơng trình:
y = ax + b và hệ số tƣơng quan:
Nếu 0,995 < r2 ≤ 1 : Có tƣơng quan tuyến tính
Khi đã xác định đƣợc khoảng tuyến tính, có thể xây dựng phƣơng trình hồi quy của khoảng này, tức là xác định hệ số a và b. Trên đƣờng hồi quy, lấy đoạn tuyến tính làm khoảng xác định (kể cả hai điểm đầu và cuối).
2.2.3.3. LOD, LOQ
Tính LOD và LOQ theo biểu thƣ́c:
) ( ) ( ) )( ( 2 y Y X x Y y X x r i i i i
Tính giá trị trung bình x , và độ lệch chuẩn SD LOD = 3 x SD LOQ = 10 x SD Với 1 n ) x x ( SD 2 i
Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R = x / LOD là hệ số đánh giá LOD
Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính đƣợc là đáng tin cậy.
Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.
2.2.3.4. Độ lặp lại, đô ̣ thu hồi
Độ thu hồi và độ lặp lại đƣợc xác định theo các đại lƣợng SD và RSD nhƣ công thức dƣới đây:
Trong đó:
Stb : Diện tích pic trung bình. Si : Diện tích píc thứ i n: Số lần đo.
SD: Độ lệch chuẩn
RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (%). Độ thu hồi của phƣơng pháp theo công thức sau : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
% ( )100
C C C
H m c m
Trong đó: Cm+c : nồng độ nitrofuran xác định đƣợc trong mẫu có thêm chuẩn (ng/g). Cm: nồng độ nitrofuran có trong mẫu (ng/g).
C: nồng độ chuẩn nitrofuran đƣợc thêm vào (ng/g). H: độ thu hồi (%).
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả phân tích trên LC-MS/MS đƣợc tính toán và xử lý bằng phần mềm Analyst, Excel, origin 6.0.
Các công thức thống kê tính đô ̣ lă ̣p la ̣i, đô ̣ thu hồi, tính LOD, LOQ…