Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS
Trang 1
NGUYEN BUC HOANG LONG
NGHIÍN CỨU ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT
HOLOTHURIN B TRONG MOT SO MAU HAI
SAM VA THUC PHAM CHUC NANG CO CHUA
HAI SAM O VIET NAM BANG PHUONG PHAP SAC KY LONG KHOI PHO LC-MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYEN NGANH : KIEM NGHIEM THUỐC & ĐỘC CHẤT
MA SO: 607315
Người hướng dẫn khoa học: TS.Trần Việt Hùng
PGS.TS Phan Văn Kiệm
Trang 2LOI CAM ON!
Trước hết, tôi xin băy tỏ lòng biết ơn sđu sắc đến TS Trần Việt Hùng-
Trưởng khoa Vât lý do lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung wong vă
PGS.TS Phan Van Kiĩm- Viĩn Khoa hoc va Cong nghĩ Viĩt Nam, cdc thay
đê luôn quan tđm, giúp đỡ, hướng dẫn vă động viín tôi trong suốt quâ trình nghiín cứu vă thực hiện luận văn năy
Tôi xin chđn thănh cảm ơn câc anh chị phòng nghiín cứu của Viện
Khoa học vă Công nghệ Việt Nam đê quan tđm vă tận tình hướng dđn tôi
trong quâ trình thực hiện đỀ tăi năy:
Đặc biệt, tôi đê luôn nhận được sự giúp đỡ của câc cân bộ khoa Vật
Lý- Viện Kiĩm nghiệm thuốc Trung ương: DS Vũ Thị Nguyệt Minh, DS Dương Minh Tđn đê hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quâ trình thực hiện đề tăi
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chđn thănh tới câc đẳng nghiệp, bạn bỉ, người thđn đê hết lòng động viín vă giúp đồ tôi trong suốt quâ trình nghiín cứu vă hoăn thănh luận văn năy!
Học viín
Trang 3DĐVNIH DAD/PDA mm ie GC/MS : LC/MS LOQ MS QIT RSD
DANH MUC CAC CHU VIET TAT
Dược điền Việt Nam III
Diode Array Detector / Photodiode array
Detector mang diode
Electron spray isonization (Nguồn ion hóa phun điện tử)
Food & Agriculture Organisation
(Tô chức lương thực Quốc Te)
Gas Chromatography - Mass spectrometry
(Sắc ký khí ghĩp khối phổ)
Hiph Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
Liquid chromatography — Mass spectrometry (Sắc ký lông ghĩp khối phổ) Limit of detection (Giới hạn phât hiện) Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) Mass spectrometry Khối phố
Pulsed amperometric detection (Detector do xung ampe)
Quadrupole ion Trap (Phan tich bay ion)
Trang 4SD SIM SKLM SKD SRM UY-VIS YRHCNYN VKNTTW Standard Deviation Độ lệch chuẩn
Selected lon Monitoring Chon loc ion
Sắc ký lớp mỏng Sắc ký đồ
Selected Reaction Monitoring
(Chọn lọc ion con sau phản ứng) Ultraviolet-Visible
Phổ tử ngoại khả kiến
Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Trang 5BANG 2.1 nă Gă cu ơi wu su Cond - ^ 3.8
DANH MUC CAC BANG
Cach pha cac dung dich chuan
Cac thong sĩ cia khdi phĩ ding dĩ xae dinh holothurin B
Kết quả khảo sât độ lặp lại của hệ thống
Kết quả khảo sât độ tuyến tính của bolofrin B
Kết quả khảo sât tỷ lệ thu hồi chuẩn trín cột DLAION HP- 20
Kết quả định lượng holothurin B trong câc mẫu nghiín cứu
Khảo sât độ lặp lại của phương phâp
Kết quả khảo sât độ đúng của phương phâp LC-MS
Giới hạn phât hiện vă giới hạn dinh luong cua holothurin B
Trang 6HÌNH 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 17 1.8 1.10 1.11 1.12 1.13 2.1 2.2 2.3 DANH MỤC CÂC HÌNH NOI DUNG
Mĩt so loai Hai Sam & Việt Nam: Hải Sđm đen vă Hải Sđm cât
Một số món ăn lăm từ Hải Sđm
Một số sản phđm có chứa /J4¡ Sđm
Cđu trúc hoâ học của holothurin B vă holothurin A
Một số hợp chất phđn lập từ loăi Holothuria scabra Hệ thông LC-MS Câc bộ phận cua detector khối pho Ky thuat ESI Bộ phđn tích bẫy ion tứ cực Bộ phđn tích tứ cực đơn Bộ phđn tích từ
Bộ phđn tích thời gian bay
Bộ phđn tích cộng hưởng 1on cyclotron
Thiết bị LC — MS sử dụng trong nghiín cứu, Mây sắc ký lỏng
khối phổ (LC - MS/MS) Thermo Finigan LCQ Advantage Max
Thiĩt bi LC-MS Agilent — Technologies
Trang 73.1 3.2 3.3 3.4 ao 3.6 + 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12
Phổ MS của dung dich chuan holothurin B 10 ug/ml trong
methanol, ghi trín thiết bị LC — MS Agilent — Technologies, Viện KH&CN VN
Phổ MS của dung địch chuẩn Z#ø/o/hrin B 10 ug/ml trong methanol, ghi trín thiết bị LC - MS Thermo Finnigan LCQ Advantage Max, Viện KNTTW
Phĩ MS? cia dung dich chuan holothurin B 10 pg/ml trong
methanol, với mức năng lượng E = 5% ghi trín thiết bị LC —
MS Thermo Finnigan LCQ Advantage Max, Viĩn KNTTW Phố MS” của dung dich chuan holothurin B 10 ug/ml trong methanol, với mức năng lượng E — 10% ghi trín thiết bị LC - MS Thermo Finnigan LCO Advantage Max, Viện KNTTW
SKD mau C4 (1 |pg/ml) phđn tích LC— MS chế độ - ESI SIM 859
Đồ thị biểu điễn mối tương quan giữa nông độ vă diện tích
peak cua holothurin B
Trang 8MỤC LỤC
Trang bìa phụ Loi cam ơn
Mục lục
Danh mục câc chữ viet tat Danh muc cac bang
Danh muc cac hinh
Trang
PUT I een enr encore ennai hi NREL LN 1
CHƯƠNG I TÓNG QUAN 22 s2 CS E231 E31 E311 EEZ1xeEEEerrrerrrrrre 3 1 a RARE BID scecenonnsassivononsnnnsissenssiessoss ins Ais CEA RTA CRELAD PREIS 3 1.1.1 Đặc điểm của Hải SĐNM -.e -ceSct 5< St ‡rkE+tevtxtertertrxterksrerrrrkerrree 3
I2 n7 an 6 6-dHqúẴA,HRHẬH H)HẶ)H 4
13.3 Gil Pt GIA quGHG Giai TII VỐNG seo ceninniierassierikssiEkkasâdukaanssaxlldEE 5
LJ COngy ding Crt TIO SGM: ccmcvecsexernssanssavrsnenasntnncenorenanntenereenasenswcrgenrssenindd
LLS Mĩts6 san phdm cb chiber Gi SG sccsscssscsesssvusszssnavsnsasssnasnssnsnnsxvenssesxeenens 7
1.2 TỎNG QUAN VĨ HOLOTHURIN B -.5 25225csscrsesrtserrrrrree 7
1.2.1 Nhĩm chat triterpen glycosid chiết xuất từ Hải (Siđm -. «5c: or
122: Bee dit BHBIHHBỀI ununadaiinaasbsttstiEiiitifflGGB103001387000288808840800089 10 1.2.2.1 Tính chất lý hóa s2 12211151511 11212 2221121722223 217212 ce 10 1.2.2.2 Một số công trình nghiín cứu về holothurin B - - 10,
1.2.2.3 Phđn lập holothurin B từ nhóm chất triterpen gÌycosid I1
Trang 91.4.1 Tổng quan về sắc kí lỏng khối phô 5WgifV0w'SvS3o$i9080050G402058gi691G601S803661408.01300680248g8 16
1.4.2 Một số kỹ thuật LC/MS .cvscccccssssesscsessesseessssssessesssseesessenssensessceescenssseneess 22
1.4.2.1 Kỹ thuật phđn tích toăn thang (FULL SCAN) 22 1.4.2.2, Ky thuat phan tich chon Ipe ton (SIM) sssssessssssanceserseceavscrensesssevesses 22
VN san 0 i8 S L.,.H,H, 23
CHƯƠNG II ĐÓI TƯỢNG VĂ PHƯƠNG PHÂP 25Š
2.1 NGUYEN VAT LIEU VA THIET BI NGHIEN CỨU 25
2.1.1 Hoâ chất vă dung tôi . -cec set setsservetesrseserrserrrersrvrvesrrrrrsrrrrers/25
2.1.2 Thiết bị, QIÌNG ÚT suggniinniidddiinngataat1LCDEESG410109000/00001111417180530000n91002219)
2.2 ĐÓI TƯỢNG, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 277
3.3.1 Boi AOS WIEN CU ra 27?
2.2.2 Nội dung vă phương phâp nghiÍn CỨU «« -<-s««-ex-xe 200 #3.2.1 Chuẩn Bỉ dụng dịch KhUẨN san naanuaueotiioiaiidtoasgaadtsgasege 200 2.2.2.2 Xử lý mẫt ¿5256122111 1E11111xE1errrrserrrrrrrrrsssrrers 2Ô
2.2.23, Dinh tinh vă định lượng bolotiuHtii Ð saeseaseaeoeesaadaeodneassans 322
CHƯƠNG III KẾT QUÂ THỰC NGHIỆM 388 3.1 KHAO SAT DIEU KIEN VA XAY DUNG CHUONG TRÌNH CHẠY
SECT TT SẼ ecco eee 388
3.1.1, Xúc định điều kiện Khối BÌ «.- ««cheeudghăx co hs koSG18êss j6 Sâvdg35eE 388
3.1.2 Thiết lập chương trình LC - ÌMẮS - + +©s+St£2Se+texeckrserserrrrrcee 422
3.1.3 Sự phù hợp của điễu kiện sắc ký e: «cv cStcxetssktirkrsevrsrrree 455
3.2 BINH TINH VA DINH LUQNG HOLOTHURIN B TRONG HAI SAM VA TRONG — PHAM CHUC NĂNG .- ¿55s 488
chức năng SeqVie — ÍÏải SẲNHH óc ằc ĂsS SS trhtgrme ng ri rre 499
Trang 103:3 1: TÌNH EU DĐ tescsvngiiistiooiraGE000000316081409900GE0000990360v999663564604399355a3394310x6a 0788 544
99a III Osean sheen vas cao ESET 555
in: an 555,
3.3.4 Giới hạn phât hiện vă giới hạn định lưỢng - - - -‹ «+ sort:
CHUONG IV: BAN LUAN i cecscccsscsssssessssesssecsssessssesessecssvecsusssseeessseessees 588
4.1 DOL TUQNG NGHIÍN CỨU -2- 552 SseSEeEezttersersreerrrrrr ĐỂ)
4.2 PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨPU .- ¿2 22 S2 SeEx2verxzseccee 58
4.2.1 Qui trivthe xv ly 1G nh ố.ố.ốố 58
Sâu, Í HƯƠNG DHÂN Âc s WES: scssscscossvsnncensvesseveannecmesessneeswentwevtaneaanesevausavanenve 509
đ4.XÍT 0U NGHI NCU co naaaaeenaaaandaaosouosastaragaasaassai 60
KẾT LUẬN VĂ KIÍN NGHỊ -222222222222222022255e- ối
41800079 007 ¬55344 ƠỊỎ 6L
KIỂ NHI Gaeeieeaeegaatgogtoiiootiboiodio is GIGGSGDNGSGGagEBSgSE.ng0gssenag 63
TĂI LIỆU THAM KHẢO
Trang 11DAT VAN DE
Nghiín cứu tìm kiếm thuốc từ nguồn hợp chất thiín nhiín biến đê được
nhiều nước trín thế giới thực hiện Thông qua câc chương trình nghiín cứu năy, rất nhiều thuốc mới của câc hêng được phđm có nguồn gốc sinh vật biển đê có mặt trín thị trường Một trong những chương trình nghiín cứu đó lă chương
trình nghiín cứu về /1đ¿ Sđm vă câc chất có hoạt tính sinh học quý của nó lă
holothurin A, B để lăm thuốc, được thực hiện tại Viện Khoa học vă Công nghệ Việt Nam (VKHCNVN) vă đê thu được những kết quả nhất định
Theo y học cố truyền, Hai Sđm có công dụng bổ thận ich tinh, dưỡng
huyết nhuận tâo, thường được dùng đề chữa câc chứng bệnh như tỉnh huyết hao
tổn, hư nhược, liệt dương, di tỉnh Câc y thư cô như Bản thảo nhiếp yếu, Dược
tính chỉ nam, Dược tính khảo đều đê nói đến câc công dụng trín của Hải S2m I816M51
Còn theo kết quả nghiín cứu dược lý học hiện đại cho thấy, Hi Sớm có
tâc dụng tăng cường sức đề khâng vă nđng cao năng lực miễn dịch của cơ thí, U#!I?' chống mệt mỏi cơ bắp, ức chế quâ trình sinh trưởng của câc tế băo ung thư
chống lêo hoâ, tăng cường hoạt động của thần kinh vă tăng phản xạ; tăng tuần
hoăn mâu, cải thiện khả năng hấp thụ oxi vă chống mệt mỏi cơ tim Hơn nữa, do
chứa rất ít lipid vă hau nhu khĩng cĩ cholesterol nĩn Hai Sdm 1a loại thực phẩm
bồi bổ lý tưởng cho những người bị rối loạn lipid mâu vă bị câc bệnh lý động mach vanh tim I8H9H15HI3H27H301
Hiện nay trín thị trường có một số sản phẩm lưu hănh dưới dạng thực phẩm
chức năng có chita Hai Sam: Amorvita Hai Sam (Cĩng ty cổ phần Traphaco),
Hasamin (Cong ty duge Dong Duong), Seavie-Hai Sam ( Anvygroup) , trong
tiíu chuẩn chất lượng của câc sản phẩm trín có công bố hăm lượng holothurin B
Trang 12phải có một phương phâp định tính định lượng hoạt chất ho/o/hurin B trong câc sản phẩm nói trín nhằm phục vụ công tâc quản lý chất lượng lă hết sức cần thiết Để kiểm nghiệm Dược liệu, thuốc có nguồn gốc Dược liệu hay câc sản phđm có
nguồn gốc thiín nhiín khâc thì cần thiết phải có câc chất chuẩn lă câc hợp chất
đặc trưng được chiết ra từ Dược liệu Đề tăi nhânh đề tăi khoa học công nghệ
cấp nhă nước mê số: KC.10.16.07/06-10 “Nghiín cứu chiết suất, phđn lập vă
tình chế holothurin B từ Hải Sđm lăm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược
liệu" có mục tiíu chiết xuất, phđn lập vă tỉnh chế holorhurin B có độ tỉnh khiết
tối thiíu 95 % tir Hai Sam lăm chất chuẩn Nhằm góp phần thực hiện đề tăi trín
vă dĩ đânh giâ chất lượng một số sản phđm có chứa Hải Sđm trín thị trường
chúng tôi đặt vấn đề: “Nghiín cứu định lượng hợp chât holothurin B trong mot số mẫu Hải Sđm vă thực phẩm chức năng có chứa Hải Sđm ở Việt Nam bằng
phương phâp LC-MS” với câc mục tiíu sau:
@ Nghiín cứu xđy dựng phương phâp định lượng hợp chat holothurin B bang
sắc ký lỏng ghĩp nồi khối phố (LC-MS)
Trang 13Chuong I TONG QUAN
1.1 Hai Sam
12; [17], [32], [41]
Hinh 1.1 Mot sĩ loai Hai Sdm & Viĩt Nam: Hai Sam den va Hai Sam cat
Hải Sđm có tín gọi dđn gian lă đỉa biến, lă tín gọi chung của một số nhóm động
vật biển thuộc lớp Holothuroidea (ngănh Echinodermata) sống trong lòng biển
trín khắp thế giới #4? Sđm có thđn hình trụ dăi, lớp da dẻo, trơn bóng vă có
lông hoặc gai san sùi; có những loăi có thđn trong suốt Trong số hăng trăm loăi
chỉ khoảng hơn 10 loăi ăn được hoặc dùng lăm thuốc Chiều dăi của /đi Sđm
trung bình khoảng từ 2.5 em đến 30 em Loăi lớn nhật lă Synapta maculata có
thể dăi đến 5m
Hai Sam có một miệng nơi phía đầu của thđn, miệng năy không hướng xuống phía dưới như câc sinh vật khâc Quanh miệng có những sợi rđu dăi từ 10cm đến
30cm, mọc như tua vă luôn luôn hoạt động nhằm giúp bơm vă hút nước trong hệ thông hô hắp đẻ thở Vâch thđn của /7đ¿ Sđm được cđu tạo bởi câc chất collagen,
có thể co giên tuỳ con vật, giúp chúng có khả năng luồn lâch giữa câc khe chật
hẹp Vỏ ngôăi eủa Hải Sđm eó cđu trúe đặt biệt, được tạo bởi những ehất đẻo, eó
khả năng co giên, không thắm nước giúp cơ thí Hai Sdm có khả năng kiểm sôt
Trang 14trơi nơi trín mặt biển Một số loăi còn eó khả năng tự vệ bằng câch tiết ra độc tô holothurin có thể giết câc sinh vật gần bĩn chung Hai Sam lă loăi chuyín ăn xâc
chết của động vật dưới biển, lă người vệ sinh của biển Thức ăn của chúng lă câc
loăi phù du vă câc chất hữu cơ tìm thấy dưới biĩn Hai Sdm sinh sản bằng câch
phóng tỉnh trùng vă trứng văo nước biến Tuỳ văo điều kiện thời tiết, mỗi câ thí
có thể sản xuất hăng ngăn giao tử /74¡ Sđm sông rất dăy đặc nơi thím biển dưới đây sđu: ở độ sđu dưới 8,8 km, Hải Sđm chiếm đến 90% khối lượng sinh vật
Tại vùng biến phía nam của New Zealand loăi Squamocnus brevidentis (Strawberry sea cucumber) sống tập trung đông đến 1,000 câ thẻ/mˆ Khoảng
10% sắc tổ trong mâu của Hai Sĩm lă vanadium Mâu của Hi Sđm có mău
văng vì có sắc tố yanabin chứa vanadium (tuy nhiín vanabin không có khả năng chuyển vận oxygen, như hemocyanin va hemoglobin) Tại Chđu Â, đặc biệt lă Trung Quốc, Nhật Bản vă Đông Nam A (ca Viĩt Nam), Hai Sam được xem như
lă một loại thực phẩm quý, rất được ưa chuộng nín bị đânh bắt quâ mức, hiện
nay đang được nghiín cứu đí nuôi tại câc trại Hải Sâm
1.1.2 Phạm vỉ phđn bố [12], [L7], [28], [36], [41], [46], [50], [51]
- Câc vùng biển của Hoa Kỳ thuộc khu vực Thâi Bình Dương vă Đại Tđy Dương
có một số loăi Hđi Sđm như : Stichopus Johnsoni thuộc họ Holothuriidae, lớn
khoảng 16-20 cm, gặp trong vùng biĩn Santa Barbara; Stichopus californicus phan bố từ vùng biển Puget Sound, Washington dĩn Monterey, California;
Holothuria ƒloridana lă loăi lớn nhất tại Hoa Kỳ, phđn phối nơi vùng san hí
ngoai khoi Florida
- Trung Quốc lă nơi tiíu thụ vă buôn bân Hai Sdm quan trong nhat Thị trường chính kiểm soât giâ vă số lượng /đải Sâm trín thế giới lă Hong Kong, Singapore
va Dai Loan $6 loai Hai Sam ở vùng ven biển Trung Quốc có khoảng 150 loăi,
Trang 15Stichopus chloronotus, phan bĩ tai ving quanh Hai Nam; Stichopus hermanni quanh Dai Loan, Quang Tay, Quang Dĩng, Hoang Sa va Truong Sa
- Ngoăi ra, Hải Sđm còn phđn bỗ ở một số vùng biển khu vực Chđu Đu, Đông Phi, Đông Đn Độ Dương, vă khu vực Đông Nam Â
- Tại Việt Nam, #âi Sđm có nhiều nhất ở câc vùng biến Nha Trang, Khânh Hoă,
Phan Thiết, Côn Đảo Câc loăi Hải Sđm ở Việt Nam phổ biến như:
+ Holothuria nobilis: Hải Sđm vú, thđn hình ống dăi đến 40 em, đường kính 5 -
6 cm, mau xam dĩn nau - den nhat, doc theo lưng vă hai bín có những cục thịt u lỗi lín như 2 hăng vú, bụng có nhiều chđn nhỏ
+ Actinopyga echinites: Hai Sam mit, than co vâch day, giống như quả dưa leo, hình trụ dăi, thon ở hai đầu vă phình ra ở giữa, đăi 20 - 30cm; đường kính 2 - 4
cm Lưng có mău nầu xậm, có nhiều gai thịt nhô lín Bụng có mău nhạt hơn, nhiều chđn nhỏ
+ Holothuria seabra: Hải Sđm trắng, thđn đăi 30 - 40 em, có con dăi đến 70 em
Lưng chúng có mău tro sậm, hai bín nhạt hơn, bụng có mău trăng Tập trung
thănh những bêi lớn dọc bờ biển, những nơi có vùng thuỷ triều thấp đây cât vă
nhiều rong biển
+ Holothuria vagabonda: Hải Sđm đen, toăn thđn mău đen, bụng mău nhạt hơn,
dăi đín 50 cm, hay sông nơi ven biín chđn núi đâ có sóng mạnh 1.I.3 Giâ trị dinh dưỡng của Hải Sđm [6], [27], [28], [32]
Hai Sam được khai thâc như một nguồn lợi kinh tế Trong đó, Hải Sđm trắng được xem lă có giâ cao nhất, một con có thể nặng đến 2 kg, giâ khoảng 50-60
USD ( khoảng 1 triệu đồng VN) Giâ trị dinh dưỡng của Hi Sđm đê được
nghiín cứu khâ kỹ tại Trung Quốc Câc thông tìn của cơ quan Lương nông Quốc
tế (FAO) đều dựa trín câc kết quả từ Viện Nghiín cứu Nghề Câ Hoăng Hải của
Trung Quốc Về mặt dinh dưỡng, /đ¡ Sđm được xem lă một thực phẩm bố
Trang 16gồm nhiều acid amin cần thiết Ngoăi ra, “đi Sđm còn chứa nhiều kim loại hiếm
gặp ở câc loăi thuỷ hải sản khâc Ví dụ, loăi H.nobilis có chứa câc thănh phan,
acid amin, cao nhat 1a Glycine (17.8%), Glutamine (11.2%), Alanine (8.4%), va
cdc acid amin chinh yĩu nhu Arginine (4.95%), Leucine (2.64%) vă đặc biệt
la Taurine (một acid amin có khả năng giúp cho sự tăng trưởng của câc tế bảo
nêo) Ngoăi ra thănh phần còn có câc khoâng chất hiểm như: Chromium (10.1ppm), Đồng (6.1ppm), Strongtium (6 6ppm)
Hình 1.2 Một số món ăn lăm từ Hải Sđm
I.!4 Công dụng của Hải Sđm [6], [9], [1Š], [18] [23] [30], [32], [37], [45] a) Trong Y học cổ truyền: Hải Sđm có vị mặn/ngọt, tính ấm tâc động văo câc kinh mạch thuộc Can vă Thận với câc tâc dụng chính:
+ Bồ thận, trợ dương: dùng để trị câc chứng suy nhược vẻ sinh lý, trị di tỉnh
+ Bỗ huyết, chỉ huyết: trị thiếu mâu với câc triệu chứng mỏi mệt
b) Trong Y học hiện dai
- Hải Sđm lă nguồn cung cấp rất tốt câc mweopolysaccharides, đê được chứng
mỉnh lă có khả năng giúp lăm giảm đau vă sưng trong câc bệnh về xương khớp
- Trong Hải Sâm còn có chứa câc saponin (câc íriterpen glycoside, philonopsid
Trang 17minh có hoạt tính chống sưng vă chống ung thư do ức chế câc thụ thể
tyrosinkinase
- Dau bĩo tir Hai Sam cũng đang được nghiín cứu để chế tạo câc dược phẩm
điều trị ung thư do hoạt tính giúp tăng sự hoạt động của men caspase-3
1.1.5 Một số sản phẩm có chứa Hải Sđm
Một số sản phẩm có chứa #!đi Sđm được liệt kí trong hình 1.3
Hình 1.3 Một số sản phẩm có chứa Hải Sđm
- Amorvita Hải Sđm (Iraphaco) với chỉ định: tăng cường sinh lực, yíu sinh lý nam
- Hasamin (CT dược Đông Dương) có chỉ định: tăng cường sinh lực, chống lêo
hoâ, tăng cường miễn dịch
- Seavie Hải Sđm của Anvy group: thănh phần gồm có bột Hải Sđm, bột Hải Mê,
tỉnh chất Nhđn Sđm có tâc dụng điều hoă thận khí, dưỡng huyết, bồi bố cơ thể, tăng cường miễn dịch
1.2 Tổng quan về holothurin B
1.2.1 Nhóm chất triterpen glycosid chiết xuất từ Hâi Sđm [ 12], [24], [25], [29], [38], [39], [40], [42], [45], [47], [49], [52], [53]
- Những triterpen glycosid tir Hai Sam thudng cĩ phĩ hoat tinh rộng như độc tế
băo, khâng nấm, tan mâu, điều biến miễn dịch Đê có khoảng hơn 100 chất
thuộc nhóm năy được phđn lập Phần lớn câc chất năy có khung cđu trúc
Trang 18trí số 3 của aglycon Sự khâc biệt thường thấy giữa câc hợp chất năy chủ yếu được tạo bởi sự sai khâc giữa câc vị trí nổi đôi trong khung, vị trí vă số lượng câc đường gắn với C-3 của aglycon, cũng như cấu trúc của nhânh bín Thông
qua câc thử nghiệm, người ta đê nhận ra rằng sự sai khâc về cấu trúc của phần aplycon với gốc đường đều liín quan đến sự thay đổi về hoạt tính khâng nắm
của holostane Cụ thể lă câc triterpen gắn bốn phđn tử đường thường có hoạt tính
cao hơn câc triterpen có gắn hai hoặc sâu phđn tử đường Những chất có chứa
đường quinovose thường có hoạt tính cao hơn, những hợp chất có nhânh bín dạng mở thường không có hoạt tính cao băng câc hợp chất có nhânh bín dạng
vòng Từ đó dẫn đến kết luận lă hoạt tính khâng nam của câc hợp chất trín phụ
thuộc văo khả năng tạo phức của câc phđn tử dường với câc măng sterol, Ví dụ mỉnh hoạ cấu trúc hợp chất olothurin B lă một triterpen gÌveosid cô 2 phđn tử
đường, có độ phđn cực cao Trong quâ trình chiết tâch thường xuất hiện cùng vGi cdc hep chat triterpen glycoside khac 1a holothurin A có 4 phđn tử đường
cũng như một loạt câc hợp chất triterpen glycoside khac Tuy nhiĩn, holothurin
B thường chiếm hăm lượng cao nhất trong câc hợp chất Hải Sđm, sau đó mới đến holothwrin A vă câc hợp chất khâc a Lo : — m HN SỦ# a " — “Oy toe Ny ig oe " Tă l Holothurin A Holothurin B
Hình 1.4 Cđu trúc hoâ học của Aolothurin B ¥a holethurin A
Trang 201.2.2 Hợp chất holothurin B [21] [22], [33], [35], (381, [39] [48], [52], [54]
1.2.2.1 Tính chất lý hóa
- Công thức phđn tử: CaiH¿4O¡;SNa - Khối lượng phđn tử: M = 882
- Dang tha hinh: Tinh thĩ hinh kim trong Ethanol - Điểm nóng chảy; 190,78°C, - Công thức cầu tạo: Hlolothurigenol-3-O-[6”-deoxy-B-ID- glucopyranosyl-(I”—>2}-B-D- xylopyranosit]- 4'-O-sulfat natri ' 1 ' ' 4 oO }—O 30 + QH ' Nad; ø CHa ` Ps hs Ty OH Ye
Holothurm B lă một triferpen glvcosid , độ phần cực cao
1.2.2.2 Một số công trình nghiín cứu về holothurin B [14], [21], [24], [25],
[38], [39], [45], [47] [48], [52]
- Nam 1965 Sobotka da nghiĩn ctru vĩ holothurin va saponin steroid tit sinh vat
biĩn
- Nam 1969, Ara Der Marderosian thudc dai hoc Duge Philadelphia cũng đê
phđn loại vă đề cập tới holorhurin ở chỉ Holothuria
- Năm 1980, cac tac gia V.A.S tonik, A D Chumak, V V Isakov, N I Belo - sortseva, V.Ya Chirva vă G B Elyakov cũng đê công bố cấu trúc hoâ học của
holothurin B từ loăi Holothuria atra
- Nam 2005, cac tâc giả Chđu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lí Mai Hương, Phạm
Quốc Long, Nguyễn Hoăi Nam cùng một số đồng tâc giả trín thí giới đê công
Trang 21bố về công trình nghiín cứu tâc dụng độc tính khâng tế băo ung thư của câc hợp
chất triterpen glycoside từ Holothuria martensii vă từ loăi Hai Sđm trắng Holothuria scabra, trong đó điển hình lă nghiín cứu về o/o/uzin B từ loăi Hải
Sđm đen Holothurin vagabunda
- Năm 2006, cac tac gia Hua Han, Yang Hua Yi, Ling Li, Xiao Hua Wang, Bao
Shu Liu, Peng Sun va Min Xiang Pan 6 D.H Y học Hăng Hai Thượng Hải, Trung Quốc cũng đê công bố về câc chat triterpen glycoside tir Holothuria
leucospilota trong d6 có holothurin B
- Năm 2007, câc tac gid Wei-Hua Yuan, Yang-Hua YI, Mei Xue, Hong-Wei
Zhang, Ming-Ping La đê công bố tâc dụng khâng nắm ctia holothurin B chiĩt
suất từ Holothuria axiloga
- Gần đđy nhất văo thâng 2/2009 lă công trình nghiín cứu của hai nhă khoa học
trẻ Nguyễn Xuđn Cường, Nguyễn Hải Đăng thuộc Viện hoâ học vă hợp chất
thiín nhiín với công trình nghiín cứu về thănh phần hoâ học, hoạt tính của câc hoạt chất ở loăi Hai Sam trang Holothuria scabra 6 Viĩt Nam da phan lap duge
3 hoạt chất Holothurin mới có hoạt tính gđy độc với một số câc tĩ bao ung thu
1.2.2.3 Phđn lập holothurin B từ nhóm chất triterpen glycosid
- Hop chat holothurin B \a mĩt triterpen glycosid (cĩ hai phan ti duĩng) cĩ dĩ
phđn cực cao Trong quâ trình chiết tâch thường xuất hiện cùng với câc hợp chất
triterpen ølycoside khâc lă holothurin A (4 phđn tử đường) vă một số câc hợp chat glycosid khac loai holostan argoside F,, impatienside B va pervicoside D - Qua trinh chiĩt tach hop chat holothurin B tit hop chat triterpen glycosid dau
tiín phải loại bỏ câc chất bĩo vă câc hợp chất phđn cực trung bình bằng câch
^ See ae 4
chiết băng dung môi elorôform/nướe Phđn tan vắ đung môi hữu eỡ đượe lại
9 Ă s , ~ s Ae ˆ * , + N + ˆ AS
bỏ Phđn dịch nước sẽ được loại muỗi vô cơ bằng câch sử dụng sắc ký cột nhồi
Diaion HP - 20 Sau đó bằng câc phương phâp sắc ký cột sử dụng kết hợp silica
Trang 22gel pha thường vă pha ngược thu được câc hỗn hợp câc hợp chất triterpen glycoside c6 chita holothurin B va holothurin A Hai hop chất năy khâc nhau 2
phđn tử đường, đo đó độ phđn cực của chúng cũng khâc nhau nín có thí chiết
holothurin B ra khoi holothurin A bang câc sắc ký cột với âp suất thường
1.3 TONG QUAN VE PHUONG PHAP CHIẾT XUẤT, PHĐN LẬP HỢP
CHAT HOLOTHURIN B
1.3.1, Chiết xuất [1]
Chiết xuất dược liệu lă phương phâp nham lay được câc chất có trong dược liệu
dưới dạng tỉnh khiết hay hỗn hợp toăn phần phục vụ cho mục đích nghiín cứu
hoặc điều trị Chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết vă câch thức chiết Dược liệu dùng để chiết xuất có thí lă những bộ phận của động vật,
thực vật, khoâng vật hoặc vi sinh vật Quâ trình chiết xuất được liệu chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tô thuộc về thănh phan, cau tạo của dược liệu (măng tế băo
dược liệu, chất nguyín sinh, câc tạp chất ) dung môi (độ phđn cực, độ nhớt,
sức căng bề mặt của dung môi ), kỹ thuật vă điều kiện chiết xuất (nhiệt độ
chiết, thời gian chiết, độ mịn của dược liệu ) Có nhiều phương phâp chiết xuất
dược liệu Câc phương phâp được phđn loại dựa văo câc yếu tố khâc nhau:
+ Dựa văo nhiệt độ: Chiết nóng vă chiết nguội (ở nhiệt độ thường);
+ Dựa văo chế độ lăm việc: Chiết giân đoạn, chiết bân liín tục vă chiết liín tục;
+ Dựa văo chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha: Chiết ngược dòng, chiết
xuôi dòng
+ Dựa văo trạng thâi lăm việc của hai pha: Phương phâp ngầm, ngắm kiệt
+ Dựa văo những biện phâp kỹ thuật đặc biệt có thĩ lam rút ngắn thời gian chiết:
siíu đm, phương phâp tạo dòng xóay vă phương phâp mạch nhịp v.v
* Chiết xuất nhóm Holothurin: Đặc tính của câc sinh vật biển lă sông ở những
khu vực có âp suđt cao, điíu kiện sông khâc hăn so với thực vật Do đó đề chiết
Trang 23xuất được câc hoạt chất từ sinh vật biín, điều kiện đầu tiín lă phải phâ vỡ được
cấu trúc tế băo của câc sinh vật biến Trong câc dung môi được lựa chọn thì
dung môi MeOH có khả năng phâ vỡ măng tế băo của câc sinh vật biển hơn cả
Nín chúng tôi lựa chọn dung môi MeOH vă câc điều kiện siíu đm vă thời gian
chiết dĩ thực hiện việc chiết hợp chất từ sinh vật biền
1.3.2 Phan lap [1]
Sau khi chiết xuất hợp chất từ được liệu, ít khi ta thu được một chất tỉnh khiết
mă thường lă hỗn hợp câc chất Phđn lập chính lă quâ trình tâch riíng một chất
ra khỏi hỗn hợp Có nhiều phương phâp đề phđn lập như: Phương phâp kết tinh
phđn đoạn băng câc dung môi, phương phâp trao đổi ion, phương phâp sắc ký cột, săe ký lớp mông điều ehế, sẵe ký lỏng điều ehâ/ bân điều ehễ Hiện nay,
phương phâp phđn lập phô biến hay sử dụng nhất vẫn lă sắc ký cột Có thể dựng một số kiểu sắc ký cột với một số cơ chế như: sắc ký pha thuận trín silica gel, pha đảo trín chất nhồi Cạ, C¡s hoặc sắc ký rđy phđn tử (Size exclusion chromatography, SEC) trín Sephadex®
* Phuong phap phan lap bang sắc ký cột
- Nguyín tắc: Dựa trín nguyín tắc câc thănh phần trong hỗn hợp có độ hấp phụ khâc nhau trín chất hấp phụ đó nạp trong cột Chất hấp phụ thường dùng lă oxyđ nhôm, s¿//ca-gel dùng cho sắc ký cột, bột cellulose Khi cho dịch chiết văo cột,
Ở phan trín của cột sĩ tap trung chất bị hap phu manh nhất, còn ở phan dưới của cột tập trung chất kĩm hấp phụ nhất Tuy nhiín, giữa câc phần chưa có sự phđn chia thănh ranh giới rõ rệt Do đó, người ta phải dùng một dung môi hay một hệ
dung môi thích hợp chạy qua cột để rửa giải câc thănh phần đó hấp phụ trong
cột,
- Xâc định câc thông số của cột: Phụ thuộc văo mục đích phải tâch sạch hay chỉ
phđn loại thănh nhóm mă chọn câc thông số cột khâc nhau Với mục đích phđn
tâch thănh câc nhóm, tỷ lệ giữa khối lượng si//ca-gei vă chất cần tâch (mix
Trang 24se/mehâ) khoảng 8-10; dùng cột có kích thước tỉ lệ chiều đăi/ đường kính (h/d) từ
10-15; kích cỡ hạt thường dùng lă 100-160um với câc dịch chiết từ động thực
vật thường có thănh phần phức tạp, khâc nhau nhiều về tính chất lý, hóa, độ
phđn cực, độ hấp phụ, Dùng hạt quâ nhỏ sẽ cản trở tốc độ dòng pha động, do
đó tâch chậm, có thể còn tắc cột Còn nếu chọn cột dăi thì khả năng tâch tốt
nhưng thời gian tâch lại lđu Thông thường, một cột có kích thước h/d (chiều
dăi/đường kính) khoảng từ 10-15 lă phù hợp - Nhôi cột: Có hai câch: Nhồi ướt vă nhi khô
+ Nhĩi ướt: Cđn siliea-gel cho văo một cốc miệng rộng có dung tích thích hợp,
đồ dung môi văo, khuấy đều tay để duôi hết bọt khí vă lam silica-gel phan tan
đều trong đúng môi Cột được kẹp đứng, đây cột đượe lót một lớp bông xốp Đồ
từ từ s//ca-gel đó được trộn đều với dung môi văo cột Sau khi s///ca-gel đó được đưa văo cột, phải đảm bảo cột luôn được ngđm trong dung mỗi vì nếu để khô hay nứt cột thì khả năng tâch sẽ kĩm nhiíu
+ Nhôi khô: Cđn siliea-gel văo một cỗc có dung tích thich hop, dĩ tir tir silica-
gei, sau đó, tiến hănh chuyển dung môi văi lần qua cột dĩ nĩn chat silica-gel,
đảm bảo độ đồng đều, trânh hiện tượng vón cục hay tạo thănh bọt khí
- Đưa chất lín cột: Tùy thuộc văo dạng chất ban đầu mă ta có thể có câc câch
phđn tân trong si/ca-gel khâc nhau Nếu chất ban đầu ở dạng rắn hay keo thì
phải hòa tan trong một lượng dung môi vừa đủ; sau đó trộn đều với một lượng
sica-gel (lượng silica-gel ding hap phu chat không quâ 3 lần so với lượng
chất) vă trộn đều, để bay hơi hết dung môi Nếu dạng chất ban đầu lă chất lỏng ta chỉ việc trộn s//ica-gel văo vă để cho khô Khi đưa chất lín cột, nín để lượng
dung môi trín cột sao cho chỉ vừa đủ ngập lượng chất dính silica-gel cho vao
- Chạy cột: Mẫu chốt trong quâ trình chạy cột lă lựa chọn vă thay đổi dung môi
chạy cột hợp lý để đảm bảo câc chất vừa phđn tâch tốt mă thời gian chạy qua cột
không quâ dăi Để tâch câc chất hữu cơ trín si//ea-gei, thường cho chạy dung
Trang 25môi kĩm phđn cực trước, sau đó mới nđng dần độ phđn cực của dung môi cho phù hợp với từng phđn đoạn hỗn hợp Nếu chỉ dùng một dung môi trong suốt
quâ trình chạy sắc ký, tuy có thể tâch sạch nhưng mất nhiều thời gian do phải
chờ giữa hai giai đoạn, hơn nữa những phđn đoạn cùng bị hấp phụ mạnh sẽ không di chuyín được hoặc di chuyển chậm Vì vậy, với mỗi đoạn ta tăng dần độ phđn cực của dung môi nghĩa lă giảm dần độ hấp thụ của silica-gel, câc phđn
đoạn sẽ di chuyín liín tục vẫn đđm bâo phđn tâch tốt
* Phđn lập bằng sắc ký loại theo kích cỡ vă việc sử dung Sephadex”
Sắc ký cột loại theo kích cỡ hiện nay được sử dụng phỏ biến nhất trong phan lập
chất ở quy mô phòng thí nghiệm Sắc ký cột phđn loại theo kích cỡ (size
exclusion chromatography- SEC) cũng được biết đến với tín lă sắc ký rđy phan tir (molecular sieve chromatography), sac ky tham qua gel (gel permeation
chromatography) hay sac ky loc qua gel (gel filtration chromatography) SEC
dựa trín sự khâc nhau về kích cỡ của câc tiíu phđn để tâch riíng chúng ra bằng
câch sử dụng câc chất có kích thước lỗ xốp xâc định lăm pha cố định Câc phđn
tử có kích thước nhỏ hơn sẽ đi sđu văo trong khối xốp vă bị giữ lại lđu hơn trước khi ra khỏi cột Trong khi đó, câc phđn tử có kích thước lớn hơn sẽ ra khỏi cột
nhanh hơn
Sắc ký gel bắt đầu được nghiín cứu từ năm 1950 nhưng gần 10 năm sau, chất lọc gel dùng lăm pha cô định mới ra đời với tín lă Sephadex” Đđy lă pha rắn
dùng đề lọc câc hợp chất có trọng lượng phđn tử lớn tan trong nước, Về sau một
số chất gel polystyren có tính ky nước ra đời dùng dĩ lọc câc hợp chất phđn tử
lớn tan trong dung môi hữu cơ Sephadex' lă tín thương mại của một loại gel có
câc dđy nối dextran, được sử dụng nhiều trọng sắc ký lọc gel Sephadex” LH-20
được tạo ra bằng câch hydroxypropyl hoa cac hat dextran dĩ tạo câc cầu liín kết hình thănh nín một mạng lưới polysaccharid Mang ludi nay trương nở trong
nước hoặc trong câc dung môi hữu cơ Tuỳ thuộc văo dung môi được sử dụng,
Trang 26Sephadex” LH-20 thể hiện cả tính ưa nước vă ky nước vă có thí đạt được độ chọn lọc sắc ký cần thiết cho những ứng dụng nhất định, Khi sử dụng Sephadex” LH-20 trong quâ trình phđn lập vă tinh chế, dĩ thu được phđn đoạn
của một nhóm hoạt chất, thẻ tích mẫu đưa lín cột có thể lín đến 30% tổng thể
tích cột
1.4 TONG QUAN VE PHUONG PHAP SAC KY LONG KHOI PHO
Ham luong holothurin B trong Hai Sdm va cac san phẩm chức năng rất nhỏ
Ngoăi ra, trong phđn tử của hợp chất năy không có những liín kết đôi, nín
không thí định lượng bằng phương phâp sắc ký lỏng với detertor tử ngoại khả
thđy có những công bố năo về định tính , định lượng holothurin B trong Hai %đm Do đó, chúng tôi lựa chọn phương phâp sắc ký lỏng khối phố (LC-MS) lă phương phâp có tính đặc hiệu vă độ nhạy cao
1.4.1 Tổng quan về sắc kí lỏng khối phổ [2] [3] [4] [5], [7] [8] [11] [13] [14], [16] [19], [20], [26] [31] [43] [44]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vă kỹ thuật phđn tích khối phổ (MS) lă hai
kỹ thuật đê ra đời khâ lđu Tuy nhiín mêi đến những năm 1970 người ta mới nhận ra lợi ích to lớn của việc kết hợp chúng với nhau, nguyín nhđn của sự
chậm trễ năy lă vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng văo hệ thống khói phô có
độ chđn không cao Kẻ từ đó đến nay sắc ký lỏng khối phổ không ngừng phât triền vă chứng minh được tầm quan trọng của mình trong phđn tích
Trang 27w Pha dong
Pha động trong sắc ký lỏng khối phổ thường lă câc dung môi hòa tan văo nhau
dĩ có khả năng tâch với độ phđn giải phù hợp Có hai câch dùng pha động đề rửa
giai:
- Đăng đồng: Câc thănh phần pha động không thay đổi trong suối quâ trình sắc ký
-_ Gradieni: Pha động lă hỗn hợp của nhiều dung môi, tỷ lệ câc thănh phđn
thay đổi trong quâ trình sắc ký theo chương trình dung môi Chế độ rửa giải gradient nồng độ thích hợp với những mẫu phđn tích gồm nhiều thănh
phần có độ phđn cực khâc nhau nhiều, khi đó chế độ năy giúp rút ngắn
Trang 283 Hệ thẳng bơm
Bơm HPLC có chức năng tạo âp suất cao để đđy pha động từ bình dung môi qua
hệ thống sắc ký Hệ thống bơm trong sac ky long can đâp ứng câc yíu cầu:
-_ Có khả năng hoạt động ở âp suất đầu văo khoảng 5000 psi trở lín
- Đảm bảo lưu lượng lap lai trong khoang 0,01 ul - 5,0 mL/phut - C6 thĩ chiu duge tâc động của nhiều loại dung môi
x* Cội tâch vă pha fĩnh
Cột HPLC thường được chế tạo băng thĩp không gi, thủy tỉnh hoặc chất dẻo có
chiều dăi 10-30cem, đường kính trong 4-10mm Kích thước của hạt nhồi trong
cot thuong 1a 5-10um Cac chất nhôi thường được sử dụng lă Silica gel, nhôm
,
ưxyd, pơlỳïe xốp hơặe cdc loai pha đảo C;, Cạ, C¡s
Cột tâch sắc ký lỏng yíu cầu phải trơ, có thănh phẳng, đồng nhất trín bề mặt vă
có thí chịu được âp suất cao *®' Hệ tiím mẫu
Mẫu ở dạng lỏng được tiím thắng văo pha động cao âp ngay ở đầu cột mă không cần dừng dòng bằng một van tiím có vòng chứa mẫu Đđy lă một ưu
điểm lớn của HPLC vì có thí tâch chính xâc, độ lặp lại rất cao
*® Hệ thống điều khiển vă thu nhận, xử lý dữ liệu
Toăn bộ hệ thống LC/MS được kết nối với mây vi tính đê căi đặt phần mềm
thích hợp, người phđn tích giao tiếp với hệ thống qua mây tính trín phần mềm
năy để điều khiến, theo dõi quâ trình phđn tích, nhận thông tin vă xử lý thông
tin
* Defecfor khối phổ
Một trong những bộ phận quan trọng nhất trong HPLC lă detector Việc sử dụng
khối phổ kế lăm detector cho sắc ký đem lại câc ưu điểm sau:
-_ Có thể đưa ra những thông tin đặc hiệu về cấu tạo hóa học của chất cần phđn tích
Trang 29- (C6 tinh chon lọc, phđn tích đúng vă chính xâc đối tượng phđn tích
- Có độ nhạy cao (Phđn tích được hăm lượng siíu vết trong mẫu thănh phan
phức tạp)
+ Nguyín tắc hoạt động
Khối phổ lă kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng vă điện tích của ion (m/z)
được tạo thănh trong pha khí từ phđn tử hoặc nguyín tử của mẫu Câc ion được
tạo thănh trong buông ion hóa, được gia tốc vă tâch riíng nhờ bộ phđn tích khôi
trước khi đến detector Tất cả câc quâ trình năy diễn ra trong thiết bị chđn
không, âp suất trong hệ dao động từ 10” Pa đến 10” Pa Tín hiệu tương ứng với câc ion sẽ được thí hiện bằng một số vạch (píc) có cường độ khâc nhau tập hợp
lại thănh một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khôi
lượng phđn tử, nhận dạng câc chất), xâc định cấu trúc vă định lượng câc chất # Câc bộ phận của detector khối phổ
Hí chđn không (âp suất 1ữ-10”Pa)
Nạp mẫu Nguồn ion Phđn tích Detector khối > * - - Bơm chđn Au ly dir không liệu
Hình 1.7 Câc bộ phận của detector khối phổ
- Nạp mẫu: Trong LC-MS, bộ nạp mẫu lă đầu ra của HPLC kết nỗi với detector
khối phố
- Nguồn ion: Lă bộ phận ion hóa mẫu có nhiệm vụ: lon hóa chất cần phđn tích, khử dung môi để đưa tiếp ion văo bộ phđn tích khối, câch ly phan tạo ion ở âp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chđn không sđu, vă rút ra ngoăi câc phđn
tử trung hòa, ion khâc dấu có thể ảnh hưởng đến phĩp đo
Trang 30Câc kỹ thuật ion hóa đê được phât triển vă sử dụng lă: Va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, lon hóa hóa học ở
âp suất khí quyền, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp
Kỹ thuật sử dụng trong luận văn năy lă kỹ thuật ion hóa bằng nguồn ion phun
sương khử solvat hay kỹ thuật ion hóa bằng tia diĩn - Electronspray ionization,
ESI
Kỹ thuật năy như sau:
Câc phđn tử hóa chất vă dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa văo một ống mao quản bằng kim loại cao thế 3-4kV (điện thế dương ở đầu kim loại tạo ion dương,
vă ngược lại), sau đó được phun mịn bằng khí N¿ thoât ra xung quanh ống mao
quản Dưới tâc động của điện thế vă của dòng khí N; có sự tạo thănh những hat
nhuyễn mang điện tích thoât ra từ đầu ống mao quản Trong khí nóng, câc phđn tử dung môi bị bốc hơi, câc hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần vă do sự đđy
nhau giữa câc điện tích cùng dấu sẽ vỡ dần thănh những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó câc ion đương hoặc đm tạo thănh được đưa văo bộ phận tâch ion qua một
cửa rất nhỏ, dung môi vă khí Nạ bị bơm hút ra ngoăi
Hình 1.8 Kỹ thuật ESI
- Bộ phđn tích khối: Bộ phđn tích khối được coi lă quả tìm của mây khối phổ
Trang 31Câc ion được gia tốc vă tâch riíng nhờ tâc dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Bộ phđn tích khối trong luận văn năy lă bộ phđn tích bẫy ion tứ
cực (Quadrupole ion trap) Thế xoay chiều tần số radio âp văo cực trung tđm sẽ
đưa câc ion văo chuyển động tròn trong hốc với quỹ đạo ôn định Bằng câch
thay đôi thế xoay chiều lăm cho cdc ion eó m/z xâc định chuyền động theo quỹ
Trang 32want 10 oP ate Frica WfSeoeoytrdote đọ †——> : [3Xfwweœxrse ` syưrngxiftew le | eS | > Hình 1.13 Bộ phđn tích cộng hưởng ion cyclotron
- Bộ phận phât hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển câc ion đê đến thănh tín hiệu
Hình 1.12 Bộ phđn tích thời gian bay
điện đo bằng hệ điện tử của mây khối phổ Hiện có hai dạng truyền thống: Nhđn
electron vă nhđn quang, trong luận văn năy, bộ phận phât hiện ion lă dạng nhđn electron
1.4.2 Một số kỹ thuật LC/MS [7], [8] [10] [26] [34]
1.4.2.1 Kỹ thuật phđn tích toăn thang (EULL, SCAN)
Với một hỗn hợp nhiều chất, sau khi được tâch ra qua cột sắc ký lỏng vă đưa
văo detector khối phổ, khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ câc ion sinh ra từ mỗi chất Ta có một sắc đồ toăn ion TIC (Total lon Chromatogram) vă phổ khói
được lấy toăn bộ câc ion (FULL SCAN)
FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phđn tích hơn, tuy nhiín phương phâp năy có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn
1.4.2.2 Kỹ thuật phđn tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)
Kỹ thuật năy chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion vă ghi sắc đồ theo thời
gian Kỹ thuật SIM có có tâc dụng lăm giảm bớt nhiễu đường nền vă do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu S⁄N
Kỹ thuật SIM nhay hon FULL SCAN
Trang 331.4.2.3 Kỹ thuật MS/MS
Trong kỹ thuật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phđn tích tiếp bang câch sử dụng năng lượng bẻ gêy, tạo ra một hoặc văi ion con đặc trưng ở
chế độ phđn tích MS lần 2
Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc vă tăng độ nhạy do lăm
giảm nhiễu đường nín rất đâng kí
* Nguyín tắc:
Phđn tích khối phổ lă phương phâp nghiín cứu câc chất băng câch đo chính xâc
khối lượng phđn tử chất đó Chất phđn tích được chuyền thănh trạng thâi hơi, rồi được chuyền thănh ion bằng phương phâp phđn tích tích hợp Câc ion tạo thănh được đưa văo nghiín cứu trong bộ phđn tích của khói phô kĩ Tuy theo loại điện tích của ion đem nghiín cứu mă người ta phđn biệt mây khối phố ion đương hoặc đm Câc khối phố kế đều nằm trong môi trường chđn không cao
* Thiết bị:
Hệ thống thiết bị gồm mây sắc ký lỏng (bao gôm hệ thông bơm pha động, bộ
phận tiím mẫu, cột sắc ký ) kết nối với detector khối phổ ( bao gồm bộ phận nạp
mẫu lă đầu ra của mây sắc ký lỏng, bộ phđn ion hoa, bd phận phđn tích khôi, bộ
phận phât hiện ion ) vă thiết bị ghi phđn tích dữ liệu - Định tính: + Dựa văo thời gian lưu: So sânh sự giống nhau về thời gian lưu trín sắc ký đồ của chất chuẩn vă thử + Dựa văo khối phổ: So sânh phổ khối của chất cần xâc định với phô khôi của chất chuẩn tương ứng
- Định lượng: Việc so sânh độ lớn tín hiệu thu được từ peak chuẩn vă peak thử (
diện tích peak hoặc chiều cao peak) trong mối tương quan với nông độ hoạt chất trong cùng một điều kiện sắc ký xâc định lă cơ sở của phĩp thử định lượng Từ
dêy chất chuẩn ở trín tiến hănh xđy dựng đường chuẩn thu được đường chuẩn
Trang 34có dạng y = ax+b với y lă nồng độ vă x lă diện tích peak Hăm lượng của
holothurin B trong nhóm thử sẽ được nội suy theo đường chuẩn trín với sự hỗ trợ của phần mềm Chemsation đi kỉm theo mây
Trang 35Chương II ĐÓI TƯỢNG VĂ PHƯƠNG PHÂP
NGHIÍN CỨU
2.1 NGUYEN VAT LIEU VĂ THIẾT BỊ NGHIÍN CỨU
211 Hod chat va dung mĩi
- Chat chuan holothurin B dĩi chiĩu hĩa hoc, (Viĩn Kiĩm nghiệm thuốc Trung
uong), ham lugng 96,17 % tinh theo nguyĩn trang
- Dung môi tỉnh khiết phđn tích: ethanol, methanol, cloroform, ether dầu hỏa,
n - hexan, acefon
- Cột trao đổi anion manh Diaion HP - 20 (Mitsubishi Chemical Co ltd., Tokyo,
Japan, kích thước 10 x 300 mm, lugng nhya uot 10 g)
- Dung mĩi tinh khiĩt dùng cho sac ki: Methanol (Merck), nước, acid
trifloroacetic (TFA), aceton, acetonitril vv
2.1.2 Thiĩt bj, dung cu:
- May sắc ký lỏng khối phổ Thermo - Finnigan LCQ Advantage Max, detector PDA vă MS/MS (Khoa Vật lý đo lường, Viện KMNTTW), hình 2.1
Hình 2.1: Thiết bị LC - MS sử dụng trong nghiín cứu, Mây sắc ký lỏng khối phổ (LC - MS/MS) Thermo Finigan LCQ Advantage Max
Trang 36- Mây sắc ký lỏng khối phĩ Agilent-Technologies, detector MS/MS (Viĩn KHCN VN), hinh 2.2 ss: bị = & "x: ; + ue Ị ` Hình 2.2 Thiết bị LC-MS Agilent - Technologies - Cột sắc kí Purospher R Star C¡¿ (250 mm x 4mm; 5 pm)
- Mây lắc siíu đm
- Cđn phđn tích Mettler AB204 (Thụy Sĩ)
- Sinh hăn
- Thiết bị cất thu hồi dung môi dưới âp suất giảm (mây cất quay)
- Bình nón, bình định mức, pipet, cốc có mỏ vă câc dụng cụ thủy tính khâc
Trang 372.2 ĐÓI TƯỢNG, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
2.2.1 Đối trợng nghiín cứu
- Đối tượng nghiín cứu lă holouzin B8 có trong một số loăi Hải Sđm đen vă một số thực phẩm chức năng có chứa holothurin B
- Đề tiến hănh nghiín cứu, chúng tôi sử dụng:
+ Hải Sđm đen: gồm 3 mẫu Huyết đen (ký hiệu MI), Môi son (M2) vă Tă la
(M3) Hăm lượng holothurin B trong Hải sđm được tính theo tỷ lệ 2% trín mẫu
đê loại bỏ ruột vă sấy khô ở 100°C đến khói lượng không doi Cac mau Hai Sđm
nghiín cứu được cung cấp bởi Viện Hóa Sinh Biín- Viện KHCNVN
Trang 38
Hình 2.3 Mẫu Hải sđm: Huyết đen (a), Môi son (b) vă Tă la (e)
Trang 39+ Sản phẩm viín nang mem Seavie - Hải Sđm (Công ty CP Anvy), số lô 011205, ngăy sản xuất 10/12/2008, HSD 11/2010, có công thức:
Bột Hải sđm 200 mg
Bột Hải mê 50 mg-
Tinh chat Nhan sam 10 mg -
Hoăng kỳ, Dđm dương hoắc, Tiín mao (cao khô) 50mg
Tâ dược vừa đủ 1 nang
2.2.2 Nội dung vă phương phâp nghiín cứu
2.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn * Chuẩn bị mẫu chuẩn
- _ Dưng dịch chuẩn gốc:
+ Dung dịch chuđn gĩc holothurin B trong methanol I mg/ml! (Dung
dịch chuẩn gốc A, I mg/ml): Can chinh xâc 20,8 mg chất đối chiếu
holothurin B văo bình định mức 20 ml, thĩm khoang 15 ml methanol, lắc đều cho tan, thím methanol vừa đủ, lắc đều Bảo quản dung dịch
năy trong tủ bảo quản ở nhiệt độ từ 2 — 8C
+ Dung dịch chuđn B (100 ng/ml): Hút chính xâc ! ml dung địch A,
thím methanol vừa đủ 10 ml, lắc đều, được dung dịch chuẩn gốc
100ug/ml
+ Dung địch chuẩn C (10 ug/ml) Hut chinh xac I ml dung dich B, thĩm
methanol vira di 10 ml, lắc đều Dung dịch nay duge str dung dĩ tune
mây (hiệu chỉnh tín hiệu) tối ưu hóa điều kiện bắt ion vă để khảo sât
mảnh phổ của holothurin B
-_ Đẩy chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc pha day dung dịch chuẩn trong pha động
có nồng độ 0.1 jig/ml; 0,25 jig/ml; 0,5 g/ml; 2,5 ug/ml; 1! jig/ml va 5 pg/ml
Trang 40Hút dung dịch chuan 100 {ig/ml pha trong vira da methanol 70 % (theo bang 2.1)
để có dêy chuẩn S1 Dêy chuđn năy để khảo sât độ lặp lại, độ tuyến tính vă sử
dụng lăm đường chuẩn đề định lượng
Bảng 2.1: Câch pha câc dung dịch chuẩn Cl C2 C3 C4 ca Có S6 ml'chuan gốc B - - 0,1 0,2 0,5 1,0 Số ml chuẩn gĩc Cc Thím vừa đủ (ml) | 20 20 20 20,0 | 20,0 | 20,0 Nông độ (ugml) | 0,1 0,25 0,5 L,0 2,5 5 0,2 0,5 - - - -
- Pha dung dich chuan holothurin B de thir gidi han phat hiĩn: Hut chinh xdc
Iml dung dich Cl cho vao binh dinh muc 10 ml, thĩm methanol vừa đủ tới
vach Dung dich nay cĩ nĩng d6 khoang 0,01 pg/ml
2.2.2.2 Xử lý mẫu
+ Hai Sam
Hải sđm tươi được loại bỏ ruột vă rửa sạch hết cât, tiếp tục được rửa sạch
bằng nước để loại muối vô cơ Mẫu được sấy ở 100°C đến khô Sau đó được
lăm thănh bột nửa mịn
Hăm lượng nước trong mẫu được xâc định theo DĐVN II, Phụ lục 5.16
Mắt khối lượng do lăm khô
- _ Chiết, lăm sạch vă lăm giău mẫu
Loại bỏ lipid: Cđn chính xâc khoảng 5 g mẫu bột Hải sđm gói văo giấy lọc, tiền hănh chiết loại bỏ lipid bằng chiết Soxhlet với n-hexan trong 3 h Sau đó