KIM THỊ THANH HIỀN xây DỰNG và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID ARISTOLOCHIC a, ACID 7 HYDROXYARISTOLOCHIC a và ARISTOLOLACTAM i TRONG THỰC PHẨM bảo vệ sức KHỎE CHỨA dược LIỆU họ ARISTOLOCHIACEAE

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KIM THỊ THANH HIỀN XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID ARISTOLOCHIC A, ACID 7-HYDROXYARISTOLOCHIC A VÀ ARISTOLOLACTAM I TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHỨA DƯỢC LIỆU HỌ ARISTOLOCHIACEAE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KIM THỊ THANH HIỀN Mã sinh viên: 1701183 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID ARISTOLOCHIC A, ACID 7-HYDROXYARISTOLOCHIC A VÀ ARISTOLOLACTAM I TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHỨA DƯỢC LIỆU HỌ ARISTOLOCHIACEAE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đặng Thị Ngọc Lan ThS Bùi Cao Tiến Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Đặng Thị Ngọc Lan ThS Bùi Cao Tiến – người thầy trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà thầy, giáo mơn Hóa phân tích – Độc chất, anh/chị Khoa Độc học Dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đặc biệt ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc, đồng hành hỗ trợ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo mơn Hóa phân tích – Độc chất khoa Độc học Dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè, người ln bên cạnh ủng hộ động viên em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Trong trình thực hiện, dù cố gắng khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót, kính mong nhận bảo, đánh giá từ quý thầy cô người Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Kim Thị Thanh Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chung đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Tính chất hóa học vật lý 1.1.2 Độc tính 1.1.3 Quy định hành .6 1.2 Các phương pháp phân tích acid aristolochic A, acid 7-hydroxyaristolochic A aristololactam I 1.3 Tổng quan phương pháp LC-MS/MS .11 1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu cao 12 1.3.2 Khối phổ 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17 2.1.3 Dung mơi, hóa chất 17 2.1.4 Chất chuẩn 18 2.1.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Xây dựng tối ưu phương pháp 20 2.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 21 2.3.3 Phân tích hàm lượng acid aristolochic A, acid 7-hydroxyaristolochic A aristololactam I số thực phẩm bảo vệ sức khỏe 23 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .24 3.1 Xây dựng tối ưu phương pháp 24 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS 24 3.1.1.1 Điều kiện khối phổ 24 3.1.1.2 Điều kiện sắc ký 24 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29 3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu 29 3.1.2.2 Khảo sát số lần chiết lặp 30 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 31 3.2 Thẩm định phương pháp 34 3.2.1 Độ đặc hiệu 34 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 35 3.2.3 Đường chuẩn .36 3.2.4 Độ lặp lại, tái lập thu hồi 36 3.2.5 Độ không đảm bảo đo 39 3.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO i PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AA Aristolochic acid Acid aristolochic AL Aristolactam Aristolactam AA A Aristolochic acid A Acid aristolochic A AA B Aristolochic acid B Acid aristolochic B AA D Aristolochic acid D Acid aristolochic D 7-OH AA A 7-hydroxy aristolochic acid A Acid 7-hydroxy aristolochic A AL I Aristololactam I Aristololactam I ACN Acetonitril Acetonitril AOAC Hiệp hội nhà hóa học phân tích DMSO Association of Official Analytical Chemists Dimethyl sulfoxide ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun mù điện tử FDA LOD Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography International Agency for Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Research on Cancer Quốc tế Liquid chromatography mass Sắc ký lỏng khối phổ spectrometry Liquid chromatography Sắc ký lỏng khối phổ hai lần tandem-mass spectrometry Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol Methanol MRM Multiple reaction monitoring - R (%) Recovery Độ thu hồi RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối TCVN - Tiêu chuẩn Việt Nam TPBVSK - Thực phẩm bảo vệ sức khỏe UV-Vis Ultraviolet-visible Tử ngoại - khả kiến HPLC IARC LC-MS LC-MS/MS Dimethyl sulfoxide DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Công thức phân tử, khối lượng phân tử độ tan chất Bảng 1.2 Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS Bảng 1.3 Điều kiện sắc ký cho LC-MS theo TCVN 11940:2017 11 Bảng 2.1 Quy trình pha dãy chuẩn 0,1-500 µg/L 19 Bảng 3.1 Mảnh mẹ, mảnh điều kiện phân mảnh chất phân tích 24 Bảng 3.2 Thời gian lưu chất phân tích 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng mẫu .31 Bảng 3.4 Tỷ lệ diện tích ion định tính/ ion định lượng chất .34 Bảng 3.5 Giá trị LOD LOQ chất phân tích 36 Bảng 3.6 Phương trình đường chuẩn khoảng tuyến tính chất 36 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi AA A 37 Bảng 3.8 Độ lặp lại độ thu hồi 7-OH AA A .38 Bảng 3.9 Độ lặp lại độ thu hồi AL I 38 Bảng 3.10 Độ tái lập chất 39 Bảng 3.11 Độ không đảm bảo đo chất 39 Bảng 3.12 Kết phân tích mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 40 Bảng 3.13 Tóm tắt tổng số mẫu thực 42 DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học AA A, 7-OH AA A AL I .3 Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống HPLC 12 Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống MS .13 Hình 1.4 Sơ đồ tứ cực (quadrupole) .14 Hình 1.5 Cấu tạo thiết bị khối phổ MS/MS 15 Hình 1.6 Quy trình xử lý mẫu dự kiến 16 Hình 3.1 Khảo sát loại cột sắc ký 25 Hình 3.2 Sắc ký đồ TIC hệ pha động khảo sát 27 Hình 3.3 Sắc ký đồ theo gradient khảo sát 28 Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát dung môi chiết 30 Hình 3.5 Khảo sát số lần chiết lặp 30 Hình 3.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 33 Hình 3.7 Sắc ký đồ độ đặc hiệu chất mẫu trắng thêm chuẩn 35 Hình 3.8 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn điểm LOD 35 Hình 3.9 Hàm lượng AA A, 7-OH AA A, AL I mẫu thực phẩm bảo vệ sức khoẻ thu thập cửa hàng nhà thuốc Hà Nội .42 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển xã hội, đời sống người dân nâng cao, nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu ngày trọng Việc phát triển xã hội kéo theo biến đổi khí hậu, mơi trường lối sống/phong cách sống người dân yếu tố góp phần gia tăng bệnh mạn tính Do nhu cầu hỗ trợ phịng ngừa cải thiện sức khỏe ngày gia tăng Từ lâu, việc sử dụng thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ dược liệu nước ta phổ biến sử dụng, đem lại hiệu việc điều hòa thể, hỗ trợ phòng chữa bệnh Đối với y học cổ truyền Việt Nam, Phịng kỷ, Mộc thơng (thuộc họ Aristolochiaceae) coi vị thuốc quý Tuy nhiên, dược liệu tự nhiên lại có chứa acid aristolochic (AA) – độc chất gây độc thận Hiện nay, Việt Nam, TCVN-11940:2017 ban hành để xác định hàm lượng acid aristolochic-1 (AA A) thực phẩm bổ sung nguyên liệu thực vật kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với detector UV khẳng định sắc ký lỏng phổ khối lượng [2] Tuy nhiên, không AA A mà dẫn chất khác AA A gây độc cho thận Các dẫn xuất AA A gồm chất nhóm acid aristolochic aristolactam (AL), có độc tính thấp AA A chúng tồn thực vật họ Aristolochiaceae, có nguy tăng cường độc tính kết hợp AA A Trong số đó, hai dẫn chất hay gặp acid 7-hydroxyaristolochic A (7-OH AA A) aristololactam I (AL I) Do đó, việc ban hành tiêu chuẩn, quy định kiểm soát phương pháp xác định đồng thời hàm lượng độc tố thuốc có chứa thực vật họ Aristolochiaceae quan trọng cấp thiết để tránh việc đánh giá thấp nguy sức khỏe liên quan đến độc tố nhóm AA để bảo vệ sức khỏe người sử dụng Điều đặc biệt cần thiết thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) có nguồn gốc từ thảo dược, ln tin tưởng an tồn thường lạm dụng theo mong muốn người sử dụng Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) có cảnh báo người tiêu dùng không sử dụng dược liệu sản phẩm từ dược liệu chứa AA [33] Tại Việt Nam, có cơng văn 3887/QLD-ĐK kiểm nghiệm acid aristolochic-1 thuốc từ dược liệu Cục Quản lý Dược ban hành, chưa có quy định TPBVSK [3] Trên giới, đến có nghiên cứu có mặt AA A, 7-OH AA A AL I nguyên liệu thảo dược TPBVSK phương pháp khác nhau: điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector khác tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) khối phổ (MS) Tại Việt Nam, chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác định đồng thời hàm lượng độc tố mẫu TPBVSK có nguồn gốc dược liệu Dựa sở phương pháp LC-MS/MS phương pháp phân tích đại có độ nhạy, độ đặc hiệu, độ tuyến tính cao thời gian phân tích ngắn, đề tài: “Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid aristolochic A, acid 7hydroxyaristolochic A aristololactam I thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa dược liệu họ Aristolochiaceae” thực với mục tiêu là: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định đồng thời độc tố: acid aristolochic A, acid 7-hydroxyaristolochic A aristololactam I thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa dược liệu họ Aristolochiaceae phương pháp sắc ký lỏng khối phổ lần LC-MS/MS Áp dụng phương pháp để sơ đánh giá hàm lượng độc tố thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa dược liệu họ Aristolochiaceae lấy thị trường Hà Nội năm 2021 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Đã khảo sát lựa chọn điều kiện LC-MS để phân tích đồng thời chất gồm acid aristolochic A, acid 7-hydroxyaristolochic A, aristololactam I, sử dụng nguồn ESI dương phân tích cột C18 (150 x 3,0 mm, 3,5 µm) pha động hệ MeOH 5% + acid formic 0,1% + amoni acetat 10 mM /nước (kênh A) ACN + MeOH (1:1, tt/tt) + amoni acetat 10 mM (kênh B) Đã khảo sát lựa chọn điều kiện xử lý mẫu: Sử dụng dung môi hỗn hợp DMSO:MeOH tỷ lệ thể tích 1:10, chiết mẫu lặp lại lần Đã thẩm định phương pháp xác định với kết quả: - Phương pháp có tính đặc hiệu đạt yêu cầu - Sự phụ thuộc tuyến tính tỷ lệ diện tích píc chuẩn/nội chuẩn nồng độ chất khoảng nồng độ từ 0,5 - 10 ng/g 50 – 500 ng/g AA A, 50 – 500 ng/g AL I, 250 - 2500 ng/g 7-OH AA A - Giới hạn phát 0,03 - ng/g; giới hạn định lượng 0,1 - 10 ng/g - Độ lặp lại phương pháp tốt, độ lệch chuẩn tương đối từ 1,2 – 9,8 %, độ tái lập có RSD từ 4,6 – 5,5 % - Độ thu hồi đạt khoảng 84 – 108 % Các kết cho thấy phương pháp có độ xác đáp ứng yêu cầu AOAC Đánh giá hàm lượng AA A, 7-OH AA A AL I 30 mẫu sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho thấy có phát chất 24 mẫu tổng số 30 mẫu khảo sát, khoảng nồng độ từ 0,17 – 646,1 ng/g Đề xuất - Mở rộng nghiên cứu TPBVSK chứa dược liệu khác như: mã đậu linh, rễ gió, quảng mộc thơng…, từ đưa danh sách dược liệu có nguy cần kiểm sốt TPBVSK - Mở rộng nghiên cứu độc tố khác nhóm acid aristolochic aristolactam acid aristolochic B, acid aristolochic D, aristolactam BII… để góp phần xây dựng phương pháp xác định chi tiết độc tố nhóm AA - Thực phân tích giám sát hàm lượng AA TPBVSK có chứa dược liệu nguy lưu hành Việt Nam, từ góp phần đưa liệu cảnh báo cho quan quản lý người tiêu dùng - Khảo sát mức tiêu thụ đánh giá nguy sức khỏe tiêu dùng người Việt Nam nguy phơi nhiễm AA từ TPBVSK Có thể tiến hành thêm nghiên cứu phơi nhiễm AA lên thực phẩm trồng quanh vùng trồng dược liệu có nguy 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2012), Hóa phân tích tập II, NXB Y học, Hà Nội Bộ Khoa học Công nghệ (2017), TCVN 11940:2017 Thực phẩm bổ sung nguyên liệu thực vật – Xác định axit aristolochic-1 – phương pháp sắc ký lỏng với detector UV (LC-UV) khẳng định sắc ký lỏng phổ khối lượng Bộ Y tế (2011), Công văn 3887/QLD-ĐK ngày 22/03/2011 kiểm nghiệm Acid aristolochic-1 thuốc từ dược liệu Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr.PL-290 Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng hóa học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh AFP (2017), Across Asia, liver cancer is linked to herbal remedies - study Available: https://hongkongfp.com/2017/10/19/across-asia-liver-cancer-linked-herbal-remediesstudy/ Alvin W Ng et al (2017), "Aristolochic acids and their derivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia", Science translational medicine, 9(412) AOAC International (2016), "Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements", AOAC official methods of analysis, pp.1-18 Araya M., García S., González-Teuber M (2018), "Rapid Identification and Simultaneous Quantification of Aristolochic Acids by HPLC-DAD and Confirmations by MS in Aristolochia chilensis Using a Limited Biomass", Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2018(8) 10 Aronson J K (2009), Meyler's side effects of herbal medicines, Elsevier 11 Bode A M., Dong Z (2015), "Toxic phytochemicals and their potential risks for human cancer", Cancer prevention research, 8(1), pp.1-8 12 Cain T et al (2007), “Determination of Aristolochic Acid I in Botanicals and Dietary Supplements Potentially Contaminated with Aristolochic Acid I Using LC-UV with Confirmation by LC/MS: Collaborative Study”, Journal of AOAC international, 90(4), pp.925 - 933 13 Chan S.A et al (2003), "Determination of aristolochic acids in medicinal plant and herbal product by liquid chromatography–electrospray–ion trap mass spectrometry", Talanta, 60(4), pp.679-685 i 14 Chernozemsky I et al (1977), "Geographic correlation between the occurrence of endemic nephropathy and urinary tract tumours in Vratza district, Bulgaria", International Journal of Cancer, 19(1), pp.1-11 15 Dickman, K G., Grollman, A P (2010), “Nephrotoxicity of Natural Products: Aristolochic Acid and Fungal Toxins”, Comprehensive Toxicology, pp.433-458 16 Ge Y et al (2017), “Selective analysis of aristolochic acid I in herbal medicines by dummy molecularly imprinted solid-phase extraction and HPLC”, Journal of Separation Science, 40(13), pp.2791–2799 17 Grollman A.P., Jelaković B (2007), "Role of environmental toxins in endemic (Balkan) nephropathy”, Journal of the American Society of Nephrology, 18(11), pp.2817-2823 18 Han J., Xian Z., Zhang Y., Liu J., Liang A (2019), "Systematic overview of aristolochic acids: nephrotoxicity, carcinogenicity, and underlying mechanisms", Frontiers in pharmacology, 10, pp.648 19 Hsieh S.-C., Huang M.-F., Lin B.-S., Chang H.-T (2006), "Determination of aristolochic acid in Chinese herbal medicine by capillary electrophoresis with laserinduced fluorescence detection", Journal of Chromatography A, 1105(1-2), pp.127-134 20 Huang C.-Y., Tseng M.-C, Lin J.-H (2005), “Analyzing Aristolochic Acids in Chinese Herbal Preparations Using LC/MS/MS”, Journal of Food and Drug Analysis, 13(2), pp.125 - 131 21 IARC (2002), “Some traditional herbal medicines”, IARC Monographs, 82, pp.69128 22 ISO (2017), ISO/TS 21748:2017 Guidance for the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in measurement uncertainty estimation 23 Liu J., Liu Y., Wu Y., Dai Z., Ma S (2020), "Rapid Analysis of Aristolochic Acid Analogues in Traditional Chinese Patent Medicine by LC-MS/MS", Journal of Analytical Methods in Chemistry, vol 2020 24 Martena M.J et al (2007), “Enforcement of the ban on aristolochic acids in Chinese traditional herbal preparations on the Dutch market”, Anal Bioanal Chem, 389, pp.263– 275 25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center (2017), Integrative Medicine: FDA Warning Regarding Aristolochic Acid 26 National Library of Medicine (2022) Available: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2236 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11667582 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/96710 27 Offical Journal of the European Communities (2002), 2002/657/EC ii 28 Ohno T., Mikami E., Matsumoto H., Kawaguchi N (2006), "Identification tests of aristolochic acid in crude drugs by reversed-phase TLC/scanning densitometry", Journal of health science, 52(1), pp.78-81 29 Ong E S., Woo S O (2001), "Determination of aristolochic acids in medicinal plants (Chinese) prepared medicine using capillary zone electrophoresis," Electrophoresis, 22(11), pp.2236-2241 30 Schmeiser H H et al (2014), "Exceptionally long‐term persistence of DNA adducts formed by carcinogenic aristolochic acid I in renal tissue from patients with aristolochic acid nephropathy", International journal of cancer, 135(2), pp.502-507 31 Shaw D (2010), "Toxicological risks of Chinese herbs", Planta medica, 76(17), pp.2012-2018 32 Specialist B S S (2021) Available: https://www.biocrick.com/Aristolochic-acidA-BCN6262.html 33 U.S Food and Drug Administration (2020), Import Alert 54-10 Detention Without Physical Examination of Bulk/Finished Dietary Supplements Products Containing Aristolochic Acid 34 Vaclavik L., Krynitsky A J., Rader J I (2014), "Quantification of aristolochic acids I and II in herbal dietary supplements by ultra-high-performance liquid chromatography–multistage fragmentation mass spectrometry", Food Additives Contaminants: Part A, 31(5), pp.784-791 35 Yu J et al (2016), “Analysis of aristolochic acids, aristololactams and their analogues using liquid chromatography tandem mass spectrometry”, Chinese Journal of Natural Medicines, 14(8), pp.626-640 36 Zhang C.-Y et al (2005), "New aristolochic acid, aristololactam and renal cytotoxic constituents from the stem and leaves of Aristolochia contorta", Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 60(10), pp.785-788 iii PHỤ LỤC Phụ lục Phổ khối chất điều kiện lựa chọn AA A 7-OH AA A AL I Finasteride iv Phụ lục Đường chuẩn dung môi đường chuẩn mẫu AA A mẫu TỶ LỆ S/IS 4.00E-01 dung môi Linear (nền mẫu) Linear (dung môi) Dung môi: y = 0.0038x - 0.0008 R² = 0.9997 Nền mẫu: y = 0.0034x + 0.0084 R² = 0.9928 3.00E-01 2.00E-01 1.00E-01 0.00E+00 20 40 60 80 100 120 NỒNG ĐỘ (ng/mL) 7-OH AA A mẫu dung môi Linear (nền mẫu) Linear (dung môi) 5.00E-01 dung môi: y = 0.0008x - 0.0096 R² = 0.9993 TỶ LỆ S/IS 4.00E-01 mẫu: y = 0.0008x - 0.0086 R² = 0.9997 3.00E-01 2.00E-01 1.00E-01 0.00E+00 100 200 300 400 500 600 NỒNG ĐỘ (ng/mL) AL I TỶ LỆ S/IS mẫu 1.00E+00 dung môi Linear (nền mẫu) Linear (dung môi) dung môi: y = 0.0091x - 0.0419 R² = 0.996 mẫu: y = 0.0088x - 0.0285 R² = 0.9999 8.00E-01 6.00E-01 4.00E-01 2.00E-01 0.00E+00 20 40 60 80 NỒNG ĐỘ (ng/mL) v 100 120 Phụ lục Sắc ký đồ độ đặc hiệu chất a) AA A b) 7-OH AA A vi c) AL I vii Phụ lục Sắc ký đồ chất điều kiện phân tích tối ưu Sắc ký đồ TIC AA A 7-OH AA A AL I Finasteride viii Phụ lục Đồ thị biểu diễn đường chuẩn chất Đường chuẩn AAA (nồng độ 0,1 - ppb) 8.00E-03 3.00E-01 6.00E-03 Tỷ lệ S/IS 4.00E-01 2.00E-01 y = 0.0037x + 0.0056 R² = 0.998 1.00E-01 4.00E-03 y = 0.0033x + 0.0005 R² = 0.9993 2.00E-03 0.00E+00 0.00E+00 20 40 60 80 100 120 0.5 1.5 Đường chuẩn 7-OH AAA 5.00E-01 Tỷ lệ S/IS 4.00E-01 3.00E-01 2.00E-01 y = 0.0008x - 0.0109 R² = 0.9985 1.00E-01 0.00E+00 100 200 300 400 500 600 Nồng độ chất phân tích (ppb) Đường chuẩn AL I 1.00E+00 8.00E-01 6.00E-01 y = 0.009x - 0.0354 R² = 0.9963 4.00E-01 2.00E-01 0.00E+00 20 40 Nồng độ chất phân tích (ppb) Nồng độ chất phân tích (ppb) Tỷ lệ S/IS Tỷ lệ S/IS Đường chuẩn AA A (nồng độ 10 - 100 ppb) 60 80 Nồng độ chất phân tích (ppb) ix 100 120 2.5 Phụ lục Bảng kết độ lặp lại trung gian PL 3.1 Độ tái lập AA A STT Ngày Hàm lượng (ng/g) Ngày Trung RSD Hàm lượng Trung RSD bình (%) (ng/g) bình (%) (ng/g) 451,1 (ng/g) 413,5 4,6 497,3 452 491,9 450,5 456,0 463,5 466,0 464,5 474,9 450,5 446,0 467 475,6 443 482,5 483,5 478,5 10 422,5 462,4 Trung bình (ng/g) 462,1 RSD (%) 4,6 x 473,1 3,4 PL 3.2 Độ tái lập 7-OH AA A STT Ngày Hàm lượng (ng/g) Ngày Trung RSD Hàm lượng Trung RSD bình (%) (ng/g) bình (%) (ng/g) 434,8 (ng/g) 431,5 2,6 496,2 450,5 500,0 428 462,7 425 465,2 418 481,1 441 462,5 444 462,7 436,5 489,4 449,5 479,5 10 424 475,8 Trung bình (ng/g) 456,2 RSD (%) 5,5 xi 477,5 3,0 PL 3.3 Độ tái lập AL I STT Ngày Hàm lượng (ng/g) Ngày Trung RSD Hàm lượng Trung RSD bình (%) (ng/g) bình (%) (ng/g) 503,5 (ng/g) 487,5 5,5 551,8 486 513,7 535 469,0 510 523,1 540 482,5 515 478,6 525 518,3 466 519,3 510 518,3 10 460 492,1 Trung bình (ng/g) 505,1 RSD (%) 5,1 xii 506,7 5,0 Phụ lục Sắc ký đồ mẫu thực tế Mẫu NC1 Mẫu VN4 Mẫu VH1 Mẫu CL3 xiii Mẫu VN3 Mẫu VH2 Mẫu CL1 xiv ... Aristolochic acid Acid aristolochic AL Aristolactam Aristolactam AA A Aristolochic acid A Acid aristolochic A AA B Aristolochic acid B Acid aristolochic B AA D Aristolochic acid D Acid aristolochic D 7- OH... Đ? ?I HỌC DƯỢC HÀ N? ?I KIM THỊ THANH HIỀN Mã sinh viên: 170 1183 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID ARISTOLOCHIC A, ACID 7- HYDROXYARISTOLOCHIC A VÀ ARISTOLOLACTAM I TRONG THỰC PHẨM BẢO... 7- OH AA A 7- hydroxy aristolochic acid A Acid 7- hydroxy aristolochic A AL I Aristololactam I Aristololactam I ACN Acetonitril Acetonitril AOAC Hiệp h? ?i nhà h? ?a học phân tích DMSO Association of