Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất kháng histamin h1 cấm sử dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng lc msms khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN PHƯƠNG THẢO XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHẤT KHÁNG HISTAMIN H1 CẤM SỬ DỤNG TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN PHƯƠNG THẢO Mã sinh viên: 1801645 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHẤT KHÁNG HISTAMIN H1 CẤM SỬ DỤNG TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà TS Đào Thị Cẩm Minh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI -2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Thanh Hà TS Đào Thị Cẩm Minh trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Ngân Bình thầy, giáo Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, anh/chị Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đặc biệt Th.s Mạc Thị Thanh Hoa, DS Nguyễn Quang Hùng đồng hành hỗ trợ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc Trường Đại học Dược Hà Nội Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí thu thập mẫu thực từ đề tài Khoa học Công nghệ trực thuộc Bộ Giáo dục Đào tạo, mã số đề tài 104.04-2020.29 TS Đào Thị Cẩm Minh chủ trì Em xin cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Mây sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh hỗ trợ trình thu thập mẫu thực Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người bên cạnh ủng hộ động viên em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Trong trình thực hiện, dù cố gắng khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót, kính mong nhận bảo, đánh giá từ quý thầy cô người Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Phương Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT a DANH MỤC CÁC BẢNG b DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ c ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Nhóm thuốc kháng Histamin H1 1.1.2 Một số dược liệu sản phẩm TPBVSK hỗ trợ điều trị dị ứng, giải độc 1.1.3 Quy định hành 1.2 THỰC TRẠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 10 1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 11 1.3.2 Khối phổ (MS) 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.3 Dung mơi, hố chất 15 2.1.4 Chất chuẩn 15 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Xây dựng tối ưu hoá phương pháp 16 2.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 17 2.3.3 Phát trộn trái phép Cinnarizin, Chlorpheniramin, Cyproheptadin số thực phẩm bảo vệ sức khoẻ 18 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VA BÀN LUẬN 20 3.1 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP 20 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS 20 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 22 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 22 3.2 THẨM ĐỊNH CỦA PHƯƠNG PHÁP 24 3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 24 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 25 3.2.3 Độ đặc hiệu 26 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) Giới hạn định lượng (LOQ) 30 3.2.5 Đường chuẩn 31 3.2.6 Độ độ xác 31 3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MẪU THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE 34 3.4 BÀN LUẬN 37 3.4.1 Về mẫu 37 3.4.2 Về phương pháp phân tích 38 3.4.3 Về phương pháp xử lý mẫu 38 3.4.4 Về thẩm định phương pháp phân tích 39 3.4.5 Về ứng dụng mẫu TPBVSK 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO: i Phụ lục Khối phổ chất điều kiện lựa chọn iii Phụ lục Đồ thị đường chuẩn chất mẫu lỏng mẫu rắn iv Phụ lục 3: Đường chuẩn dung môi chất v Phụ lục 4: Sắc ký đồ điểm LOD vi Phụ lục 5: Danh sách 22 mẫu TPBVSK thu thập viii Phụ lục 6: Sắc kí đồ mẫu TPBVSK dương tính ix DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hóa học phân tích CE Collision Energy Năng lượng bắn phá CLO Chlorpheniramine Chlorpheniramin CIN Cinnarizine Cinnarizin CYP Cyproheptadine Cyproheptadin ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun mù điện tử HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu cao LC-MS Liquid chromatography mass spectrometry Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ LC-MS/MS Liquid chromatography tandemmass spectrometry Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ hai lần LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MRM Multiple reaction monitoring Kiểm soát đa phản ứng R (%) Recovery Độ thu hồi RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối TPBVSK - Thực phẩm bảo vệ sức khỏe a DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định thuốc kháng Histamin H1 Bảng 2.1 Thành phần tỷ lệ dược liệu mẫu 14 Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ 20 Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ chất phân tích 21 Bảng 3.3 Chương trình gradient chạy sắc ký 22 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mẫu 23 Bảng 3.5 Quy trình pha dãy chuẩn 25 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS (n=6) 25 Bảng 3.7 Tỷ lệ cường độ tín hiệu ion định tính/định lượng chất phân tích 27 Bảng 3.8 Giá trị LOD LOQ chất phân tích 30 Bảng 3.9 Phương trình đường chuẩn chất phân tích 31 Bảng 3.10 Kết độ độ xác ngày (n=7) 32 Bảng 3.11 Độ độ xác khác ngày (n=7) 33 Bảng 3.12 Độ tái lập chất phân tích (n=14) 34 Bảng 3.13 Kết định tính chất phân tích 22 mẫu TPBVSK 35 Bảng 3.14 Kết xác định mẫu TPBVSK dương tính 36 Bảng 3.15 Kết đánh giá mẫu TPBVSK dương tính 37 b DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Chlorpheniramin Hình 1.2 Công thức cấu tạo Cinnarizin Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo Cyproheptadin Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 11 Hình 1.5 Sơ đồ hệ thống HPLC 11 Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo tứ cực 12 Hình 3.1 Sắc ký đồ độ đặc hiệu chất phân tích mẫu lỏng 28 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu cúa chất phân tích mẫu rắn 29 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu trắng lỏng thêm chuẩn điểm LOD vi Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng rắn thêm chuẩn điểm LOD vii a) Sắc ký đồ mẫu HA29 cho kết dương tính với chất CIN, CLO, CYP ix b) Sắc ký đồ mẫu VNA19 cho kết dương tính với CLO ix c) Sắc ký đồ mẫu CLA24 cho kết dương tính với CLO x c ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển, nhu cầu chăm sóc bảo vệ sức khỏe người ngày nâng cao Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) ngày sử dụng phổ biến toàn giới, Việt Nam nằm xu hướng Cùng với việc phát triển trang thương mại điện tử, mạng xã hội internet, việc mua bán TPBVSK online xuất ngày nhiều Điều trở thành vấn đề lớn đến sức khỏe cộng đồng việc kiểm tra, quản lý TPBVSK không diễn cách chặt chẽ Hầu hết quan niệm cho TPBVSK có nguồn gốc từ thảo dược, dẫn xuất tự nhiên nên an toàn Nhưng có nhiều báo cáo phát số TPBVSK cho thêm vào hóa chất tổng hợp có dược tính nhằm ngụy biện tác dụng tăng cường mạnh tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý Các thuốc hóa dược tìm thấy điển hình thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid….[15] Vấn đề nguy hiểm cho người tiêu dùng, người có sẵn bệnh lý bệnh tim mạch người cao tuổi vơ tình sử dụng gây tác dụng phụ trầm trọng Tại Việt Nam, vấn đề trộn trái phép chất nhóm kháng Histamin H1 quan tâm Một số phương pháp phân tích phát chất thuộc nhóm chế phẩm TPBVSK, chế phẩm đông dược công bố sử dụng phương pháp phân tích LCMS/MS[20], phương pháp HPLC-DAD [2] , phương pháp TLC [12]… Trong phương pháp LC-MS/MS phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, sử dụng để khẳng định định tính việc trộn trái phép tân dược vào TPBVSK Năm 2020, Trần Thị Lan xây dựng phương pháp HPLC HPTLC để phát chất thuộc nhóm kháng Histamin H1 bao gồm ba chất có Danh mục chất cấm Thông tư 10/2021/TT-BYT Tuy nhiên hai phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu chưa cao, xảy trường hợp âm tính giả/dương tính giả Phương pháp LC-MS/MS phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, sử dụng để khẳng định định tính việc trộn trái phép tân dược vào TPBVSK Các chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng TPBVSK theo Thông tư số 10/2021/TT-BYT ban hành ngày 30/06/2021 bao gồm Chlorpheniramin, Cyproheptadin Cinnarizin Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS kết hợp khả phân tách chất sắc ký lỏng (LC) khả phát hiện, định lượng khối phổ (MS); phương pháp cho độ nhạy độ đặc hiệu cao, phù hợp phân tích mẫu phức tạp chế phẩm TPBVSK để mở rộng đối tượng nghiên cứu góp phần phục vụ cho cơng tác kiểm tra, quản lý việc trộn chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng TPBVSK thị trường, tiến hành Bảng 3.15 Kết đánh giá mẫu TPBVSK dương tính Mẫu Liều dùng/ Khối Định Hệ số Chất Nồng độ Hàm Hàm ngày * (đơn lượng mức lượng lượng vị) cân (g) pha (mL) loãng (k) phát tính theo đường (mg/g) (mg/liều ngày) chuẩn (ng/mL) HA29 VNA19 gói/ngày (2,5934g/gói) 0,5048 viên/ngày 0,5040 (0,5215g/viên) CLA24 chai (29,4523g) 0,9785 25,0 25,0 25,0 CIN 5,11 0,051 0,265 CLO 45,67 0,452 2,344 CYP 2,41 0,024 0,124 10000 CLO 16,34 8,105 25,36 0,64 0,0004 0,012 200 25 CLO *: tính theo liều người lớn ghi nhãn TPBVSK Cơng thức tính hàm lượng chất phân tích (mg/g): HL (mg/g) = Nồng độ CPT tính theo đường chuẩn ngà25,00×Hệ số pha lỗng 106 ×khối lượng mẫu \ Nhận xét: Đối với TPBVSK (có số đăng ký sản phẩm ghi nhãn “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe”), phát mẫu TPBVSK dương tính, có mẫu TPBVSK dương tính với chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng Nồng độ trộn chất phân tích mẫu TPBVSK nằm khoảng từ 0,0004 – 8,105 mg/g Đặc biệt, mẫu VNA19 TPBVSK có số đăng ký có nồng độ CLO trộn trái phép cao vượt mức liều tối đa khuyến cáo (tối đa 24mg/ngày người lớn)[7] 3.4 BÀN LUẬN 3.4.1 Về mẫu Phạm vi nghiên cứu đề tài tập trung vào dạng bào chế phổ biến loại TPBVSK dạng lỏng (cao lỏng, dung dịch, hỗn dịch…) dạng rắn (viên hoàn, viên nén, viên nang cứng, bột…) Các mẫu chế phẩm thu thập thị trường có nhãn thành phần từ dược liệu cơng bố có tác dụng chống dị ứng, mẩn ngứa, giải nhiệt Kim ngân hoa, Bạc hà, Cà gai leo, Kinh giới, Ké đầu ngựa… Từ mẫu sử dụng dựa thuốc cổ truyền, có nguyên liệu từ 18 loại dược liệu bào chế dạng cao lỏng với dung môi nước dạng cao khô rắn 37 3.4.2 Về phương pháp phân tích Phương pháp LC-MS/MS phương pháp đại, ngày sử dụng phổ biến Việt Nam Với độ nhạy độ đặc hiệu cao, phương pháp ứng dụng nhiều phân tích, đặc biệt phân tích chất trộn trái phép TPBVSK có nguồn gốc dược liệu.[19] Các phương pháp phân tích thơng thường HPTLC hay HPLC cho kết âm tính giả, dương tính giả tùy thuộc vào nồng độ chất phân tích trộn phức tạp mẫu Ngồi ra, phương pháp kể thường có giới hạn phát từ ppm trở lên,[2, 3, 12] phương pháp LC-MS/MS phát chất phân tích nồng độ thấp (ppb/ppt)[14, 21, 20] Do phương pháp phù hợp để phát việc trộn chất thuốc nhóm thuốc kháng Histamin H1 có liều điều trị thấp Phương pháp LC-MS/MS có phận sắc ký phận khối phổ, việc lựa chọn điều kiện tối ưu cho hai trình quan trọng để đạt độ đặc hiệu cao Điều kiện sắc ký bao gồm cột sắc ký, thành phần pha động, chương trình gradient, tốc độ dịng, thể tích tiêm mẫu cho pic gọn, cân đối, thời gian phân tích tương đối ngắn, q trình phân tích diễn ổn định có cường độ tín hiệu pic phù hợp để phân tích Trong trình khảo sát điều kiện sắc ký, ảnh hưởng trang thiết bị thời gian thực đề tài, điều kiện sắc ký lựa chọn cho phân tách chất chưa rõ ràng, thời gian lưu chất phân tích gần (lần lượt 5,02; 5,30; 5,52 phút CLO, CYP CIN) Tuy nhiên, phương pháp sử dụng detector MS đạt yêu cầu có điểm IP (1 ion mẹ ion định tính định lượng) dựa vào ion mẹ, ion tỷ lệ ion con, phương pháp xây dựng cho phép xác định riêng biệt chất phân tích cách xác 3.4.3 Về phương pháp xử lý mẫu Quy trình xử lý mẫu dựa theo độ tan chất phân tích tham khảo số tài liệu nghiên cứu cơng bố, quy trình xử lý mẫu tiến hành sau: Đồng hóa mẫu: mẫu dạng rắn nghiền mịn thành bột, mẫu lỏng lắc Cân xác khoảng 0,50g mẫu rắn 1,0g mẫu lỏng vào ống ly tâm nhựa 50ml Thêm xác 25,0ml dung mơi methanol lắc Lắc vortex phút Siêu âm nhiệt độ phòng 15 phút Ly tâm lạnh 6000 vòng/phút 10 phút, thu lấy phần dịch Pha lỗng mẫu đến nồng độ thích hợp dung mơi chiết mẫu (nếu cần) Lọc qua màng lọc 0,22µm Tiến hành phân tích mẫu thiết bị LC-MS/MS Quy trình xử lý mẫu giúp tiết kiệm thời gian tiến hành kiểm tra, sàng lọc lượng mẫu thực lớn Các ưu điểm quy trình xử lý mẫu so với tài liệu tham khảo gồm: 38 - Dung môi sử dụng giống methanol, nhiên tỷ lệ dung mơi/mẫu quy trình xử lý mẫu cao hơn, so với tài liệu [5, 14] 10,0mL/1,0g mẫu 20,0mL/1,0g mẫu - Lượng mẫu cân giữ cố định giá trị khoảng 0,50g với mẫu rắn, 1,0g với mẫu lỏng (thường xấp xỉ - 1/10 đến khối lượng trung bình liều) Điều giúp cho thời gian cân mẫu giảm đáng kể so với việc cân mẫu theo 1/10 hay 1/2 liều (theo tài liệu [1, 20]) chế phẩm lại có liều sử dụng khác Tuy q trình nghiên cứu chưa có khảo sát điều kiện xử lý mẫu khác nhau, dựa vào kết đánh giả ảnh hưởng mẫu (ảnh hưởng mẫu đạt nằm khoảng ± 20%) độ thu hồi phương pháp (nằm khoảng 71,0 – 112,0 % với chất), thấy phương pháp xử lý mẫu đưa giúp loại bỏ ảnh hưởng mẫu có độ thu hồi chất đạt yêu cầu 3.4.4 Về thẩm định phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp xây dựng tiêu chí gồm độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ độ xác + Độ phù hợp hệ thống phương pháp đạt yêu cầu + Phương pháp có tính đặc hiệu đạt u cầu Kết cho thấy, sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic trùng với thời gian lưu chất phân tích Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, pic xuất trùng thời gian lưu với mẫu trắng thêm chuẩn, pic có hình dạng cân xứng, nhỏ gọn Hơn nữa, phương pháp đạt yêu cầu theo quy định Châu Âu (2002/657/EC) có điểm IP (1 ion mẹ, ion để định tính định lượng) Như vậy, phương pháp phân tích xây dựng đáp ứng yêu cầu độ đặc hiệu + Giới hạn phát 0,10 - 0,25 ng/mL; giới hạn định lượng 0,33 – 0,83 ng/mL + Đường chuẩn chất tuyến tính khoảng từ 1,0 - 50 ng/mL + Độ lặp lại phương pháp tốt loại nền: độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 1,1 – 8,3 %; độ thu hồi đạt khoảng 71,0 -112,0% + Độ tái lập từ 3,0 -18,2 % 3.4.5 Về ứng dụng mẫu TPBVSK Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS xây dựng để phân tích chất CIN, CLO, CYP 22 chế phẩm TPBVSK có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng, mẩn ngứa, giải độc gan, an thần từ nguồn khác Kết có chế phẩm dương tính với chất phân tích Trong có chế phẩm dạng viên hồn dương tính với chất phân tích với hàm lượng 0,051mg/g; 0,452mg/g 0,024 mg/g CIN, CLO CYP; chế phẩm dương 39 tính với Chlorpheniramin với hàm lượng 0,0004 mg/g (mẫu CLA24) 8,105mg/g (mẫu VNA19) Riêng mẫu VNA19 có mức nồng độ tính theo liều ghi nhãn 25,36mg/ngày, vượt liều tối đa khuyến cáo.[7] Từ cho thấy, thực trạng trộn trái phép thuốc kháng Histamin H1 bị cấm TPBVSK có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng tồn đáng kể, đặc biệt sản phẩm khơng có số đăng ký, sản phẩm mua bán internet không rõ nguồn gốc Do đó, người sử dụng cần cân nhắc lựa chọn chế phẩm TPBVSK có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng, mẩn ngứa… Như vậy, phương pháp phân tích xây dựng có tính thực tiễn cao việc phát hoạt chất nhóm kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng sản xuất kinh doanh TPBVSK, góp phần vào cơng tác quản lý, kiểm tra chất lượng TPBVSK thị trường 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời Chlorpheniramin, Cinnarizin Cyproheptadin trộn trái phép TPBVSK dạng lỏng dạng rắn LC-MS/MS Quá trình xây dựng phương pháp bao gồm: - Khảo sát điều kiện LC-MS: với cột sử dụng cột C18 (3,5µm, x 150 mm), hệ dung mơi pha động Acid formic 0,1% nước (kênh A) Acid formic 0,1% (kênh B), tốc độ dòng 0,5 ml/phút; chế độ ion hóa ESI (+) thông số khối phổ tối ưu, lựa chọn ion mẹ ion dùng định tính định lượng - Xây dựng quy trình xử lý mẫu gồm bước: Đồng mẫu, cân mẫu xác khoảng 0,5g với mẫu rắn 1,0g với mẫu lỏng Chiết mẫu 25,00ml Methanol lắc vortex, siêu âm 15 phút Ly tâm lấy dịch trong, pha loãng lọc dịch qua màng 0,22 µm - Thẩm định phương pháp: Phương pháp đạt yêu cầu độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, xác định giới hạn phát giới hạn định lượng, đường chuẩn độ – độ xác, so với yêu cầu AOAC 2016 Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định loại dược chất trộn trái phép 22 mẫu TPBVSK lưu hành thị trường Kết phát 03/22 mẫu TPBVSK dương tính với chất phân tích Trong có 01 mẫu bị trộn Chlorpheniramin với hàm lượng vượt mức khuyến cáo Bộ Y tế Kiến nghị Ứng dụng phương pháp để kiểm tra phát chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng thực phẩm bảo vệ sức khỏe, bao gồm Cinnarizin, Chlorpheniramin Cyproheptadin, hỗ trợ công tác kiểm tra, quản lý thực phẩm bảo vệ sức khỏe Việt Nam 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Tiếng Việt Nguyễn Thị An (2019), Xây dựng phương pháp xác định thuốc kháng Histamin trộn trái phép chế phẩm đơng dược LC-MS/MS TLC, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ; Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Kiều Anh, Trần Thị Lan, Nguyễn Thị Quỳnh(2020), "Nghiên cứu xác định số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép chế phẩm đông dược HPLCPDA", Tạp chí Dược học, Tập 60, Nguyễn Thị Kiều Anh, cộng (2021), "Xây dựng phương pháp HPTLC xác định số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép chế phẩm đơng dược ", Tạp chí Nghiên cứu dược thông tin thuốc, Tập 12, 18-24 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V - Tập 1; Nhà xuất Y học, Bộ Y tế (2018), Dược thư Quốc gia Việt Nam - Tái lần thứ nhất;,Nhà xuất Y học, Bộ Y tế ( 2012), Sách giáo trình Dược lý học - Tập 2, Nhà xuất Y học,Hà Nội, Bộ Y tế ( 2014), Sách giáo trình Hóa Dược - Tập I, Nhà xuất Y học,Hà Nội, Bộ Y tế (2012), Sách giáo trình Hóa phân tích - Tập II Phân tích dụng cụ, Nhà xuất Y học,Hà Nội, Trần Lệ Hoa (2018), Xây dựng phương pháp xác định số dược chất nhóm hạ huyết áp trộn lẫn chế phẩm đông dược HPTLC HPLC, Luận văn thạc sĩ dược học; Đại học Dược Hà Nội 10 Nguyễn Trọng Linh, Cao Hữu Nghĩa, Vĩnh Thị Châu (2022), "Tầm soát chất hóa dược tổng hợp: ức chế PDE5, kháng viêm, giảm đau, giảm cân thực phẩm bảo vệ sức khỏe LC-MS/MS", Viẹtnam Journal of Food Control, Tập 5, 462-473 11 Phạm Thị Thanh Tuyền (2019), Xây dựng phương pháp xác định số thuốc chống dị ứng trộn trái phép chế phẩm đông dược LC-MS/MS, Luận văn thạc sĩ dược học; Trường Đại học Dược Hà Nội Tiếng Anh 12 AOAC International Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements; (2016) 13 Maciej J Bogusz, Hassan Huda, Al-Enazi Eid, Ibrahim Zuhour, Al-Tufail Mohammed (Năm 2006), "Application of LC–ESI–MS–MS for detection of synthetic i adulterants in herbal remedies", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 554-564 14 Jamshed Haneef, Shaharyar Mohammad, Husain Asif, Rashid Mohd, Mishra Ravinesh, Siddiqueb Nadeem A., et al (2013), "Analytical methods for the detection of undeclared synthetic drugs in traditional herbal medicines as adulterants", Drug Testing and Analysis, 5, 607-613 15 ICH (1995), "Step 5: NOTE FOR GUIDANCE ON VALIDATION ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY", OF 16 Do Jung-Ah, Jung Yeon Kim, Ji Yeon Choi, Ji Hyun Lee, Hyung Joo Kim, Eunyoung Noh, et al (2015), "Development of a LC–MS/MS method for simultaneous analysis of 20 antihistamines in dietary supplements", ANALYTICAL SCIENCE & TECHNOLOGY, 28, 86-97 17 PubChem Chlorpheniramine - Compound summary: National Library of Medicine; [14/4/2023] Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2725 18 Weng F Huang PhD, PhD Kuo-Ching Wen, MPH Mei-Ling Hsiao (1997), "Adulteration by Synthetic Therapeutic Substances of Traditional Chinese Medicines in Taiwan", J Clin Pharmacol, 37, 344-350 19 Tiago Rocha, Amaral Joana S., Oliveira Maria Beatriz P.P (2015-2016), "Adulteration of Dietary Supplements by the Illegal Addition of Synthetic Drugs: A Review", Comprehensive Reviewsin Food Science and Food Safety, 15, 43-62 20 Cho S.H., H.J Park, J.H Lee, H.J Kim, S Cho, C.Y Yoon, et al (2014), "Monitoring of 35 illegally added steroid compounds in foods and dietary supplements", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 31, 1470-1475 21 Lin-hu YE, Xu Song, Wang Li-sha, He Mei, Chang Qi (2016), "Simultaneous determination of antihistamine agents added into traditional Chinese medicine preparation by LC-MS/MS", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 36, 2022-2028 ii Phụ lục Khối phổ chất điều kiện lựa chọn 20230426-std50 604 (5.646) 167.15 4: MRM of Channels ES+ (Cinnarizin) 6.97e5 % 100 152.07 115.08 115 201.16 m/z 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 20230426-std50 546 (5.100) 170 175 180 185 190 195 200 2: MRM of Channels ES+ (Clopheninramin) 230.12 3.46e5 % 100 167.11 125.04 m/z 120 130 140 150 160 170 20230426-std50 570 (5.326) 180 190 200 210 220 230 3: MRM of Channels ES+ (Cyproheptadin) 96.23 6.76e5 100 % 58.07 70.09 44.02 m/z 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 iii Phụ lục Đồ thị đường chuẩn chất mẫu lỏng mẫu rắn Đường chuẩn Cinnarizin dung môi mẫu 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 10 20 30 40 Lỏng MeOH 50 60 Rắn Đường chuẩn Chlorpheniramin dung môi mẫu 100000 80000 60000 40000 20000 0 10 20 30 40 Lỏng MeOH 50 60 Rắn Đường chuẩn Cyproheptadin dung môi mẫu 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 10 20 30 Lỏng MeOH iv 40 50 Rắn 60 Phụ lục 3: Đường chuẩn dung môi chất v Phụ lục 4: Sắc ký đồ điểm LOD f) Hình 4.1 Sắc ký đồ mẫu trắng lỏng thêm chuẩn điểm LOD vi g) Hình 4.2 Sắc ký đồ mẫu trắng rắn thêm chuẩn điểm LOD vii Phụ lục 5: Danh sách 22 mẫu TPBVSK thu thập Mã kí Dạng bào hiệu chế CLA24 Cao lỏng Việt Nam Thanh nhiệt, cảm cúm CLA25 Cao lỏng Việt Nam Thanh nhiệt mát gan, ban da HA18 Viên hoàn Việt Nam Thanh nhiệt, mát gan, dị ứng, giảm ngứa HA22 Viên hoàn Việt Nam Giải độc gan, dị ứng HA29 Viên hoàn Việt Nam Viêm xoang, viêm mũi dị ứng HCA23 Viên hoàn Việt Nam Dị ứng, giải độc gan HCH01 Viên hoàn Việt Nam Nghẹt mũi, hắt hơi, viêm mũi dị ứng VNA19 Viên nang Việt Nam Viêm xoang, viêm mũi VNA20 Viên nang Việt Nam Viêm xoang, viêm mũi 10 VNA21 Viên nang Việt Nam Viêm xoang, viêm mũi dị ứng 11 VNA34 Viên nang Việt Nam Mày đay, dị ứng, vàng da, giải độc gan 12 VNA38 Viên nang Việt Nam Viêm mũi, dị ứng 13 VNA99 Viên nang Việt Nam Viêm xoang, viêm mũi dị ứng 14 VNE01 Viên nén Việt Nam Hắt hơi, sổ mũi, chảy nước mũi, xoang, viêm mũi dị ứng 15 VNE02 Viên nén Việt Nam Tăng đề kháng, chống cảm cúm, viêm họng 16 VNE03 Viên nén Việt Nam Viêm xoang 17 VNE04 Viên nén Việt Nam Ngạt mũi, hắt hơi, dị ứng, viêm xoang 18 VNE05 Viên nén Việt Nam Dị ứng, viêm xoang 19 VNE06 Viên nén Việt Nam Viêm xoang, viêm mũi dị ứng 20 VNE07 Viên nén Việt Nam Mề đay, mụn nhọt, viêm da 21 VNE08 Viên nén Việt Nam Mề đay, mụn nhọt, viêm da 22 VNE09 Viên nén Việt Nam Mề đay, phát ban TT Tác dụng Nguồn gốc viii Phụ lục 6: Sắc kí đồ mẫu TPBVSK dương tính 20230514-HA29-L200 4: MRM of Channels ES+ 369.232 > 167.153 (Cinnarizin) 6.55e4 5.51 590 5.53 592 100 % 5.58 597 5.64 603 5.68 608 5.82 6.08 623 651 5.32 569 7.79 833 6.52 6.72 698 719 7.97 853 8.48 8.60 8.92 8.80 907 920 954 941 0.50 20230514-HA29-L200 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ 288.2 > 96.2 (Cyproheptadin) 1.65e4 5.33 571 100 5.30 568 5.36 574 % 5.39 577 5.48 587 5.60 600 6.22 5.76;617 666 0.50 20230514-HA29-L200 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 7.72 827 7.28 780 6.66 713 8.94 9.08 957 972 8.31 8.12 890 869 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ 275.1 > 230 (Chlorpheniramin) 5.01e5 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ TIC 6.28e5 5.00 536 100 % 5.09 545 5.31 569 0.50 20230514-HA29-L200 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 5.00 536 a) Sắc ký đồ mẫu HA29 cho kết dương tính với chất CIN, CLO, CYP 100 % 5.05 541 5.31 569 20230514-VNA19-L1000 5.56 595 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 4: MRM of Channels ES+ 369.232 > 167.153 (Cinnarizin) Time 5.70e3 9.00 9.50 6.17 6.00660 5.93;634 5.95 5.71 637 611 5.52 591 % 5.68 608 6.50 7.00 6.82 730 6.44 689 6.75 722 6.86 734 6.65 712 5.20 5.41 556 579 7.50 8.00 7.98 8.23 854 880 7.62 815 7.79 833 7.45 797 8.50 8.64 8.80 924 942 8.88 950 9.12 976 7.42 794 7.21;771 5.13 549 0.50 1.00 20230514-VNA19-L1000 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ 288.2 > 96.2 (Cyproheptadin) 1.75e3 6.13 656 100 % 5.42 581 5.59 599 5.95 637 7.94 850 8.00 857 6.87 736 6.48 694 6.29 674 6.83 731 6.71 718 7.63 817 6.92 741 7.66 820 8.62 923 8.18 8.33 876 892 8.56 916 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 9.28 994 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ 275.1 > 230 (Chlorpheniramin) 1.58e5 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ TIC 2.11e5 5.05 541 100 9.11 975 8.98 961 8.85 947 6.98;747 0.50 1.00 20230514-VNA19-L1000 8.66 927 5.11 547 % 5.16 553 5.30 568 5.46;585 0.50 1.00 20230514-VNA19-L1000 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 5.05 541 b) Sắc ký đồ mẫu VNA19 cho kết dương tính với CLO 100 % 5.13 549 5.21 558 5.32 570 5.57 597 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 ix 5.00 6.54 700 Time 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 20230514-CLA24-L5 5.51 590 100 4: MRM of Channels ES+ 369.232 > 167.153 (Cinnarizin) 1.52e4 5.55 594 5.61 600 5.72 612 % 6.05 5.78 647 6.28 618 672 6.51 6.08 697 650 6.80 728 5.43 581 5.40 5.20 578 556 1.79 191 0.50 20230514-CLA24-L5 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 5.29 567 100 6.50 7.00 7.50 8.28 886 8.48 907 8.00 9.06 8.81 969 943 9.10 974 9.42 1008 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ 288.2 > 96.2 (Cyproheptadin) 6.84e3 5.32 570 5.25 562 % 6.00 7.74 7.86 828 841 5.44 583 5.57 596 1.51 162 1.78 191 5.61 601 6.01 644 1.82 195 6.33 678 7.49 802 6.61 708 8.69 7.88 8.01 8.14 8.37 930 844 858 872 896 9.02 966 9.07;971 0.50 20230514-CLA24-L5 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 4.99 534 100 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ 275.1 > 230 (Chlorpheniramin) 1.05e4 5.06 542 5.09 545 % 5.17 554 0.65 0.77 0.90 70 83 97 0.50 20230514-CLA24-L5 1.00 1.51 1.74 162 187 1.50 2.00 5.35 573 5.51 590 3.42 3.54 366 379 2.19 2.31 235 248 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 4.99 534 5.50 5.88 630 6.00 6.30 6.47 6.68 675 693 715 6.50 6.97 746 7.00 7.43 796 7.62 7.96 816 852 7.50 8.06 863 8.26 884 8.00 8.55 9.06 9.22 915 8.80 970 987 942 9.56 1023 8.50 9.00 9.50 1: MRM of Channels ES+ TIC 1.51e4 c) Sắc ký đồ mẫu CLA24 cho kết dương tính với CLO 100 5.06;542 5.44 583 5.57 596 5.65 605 % 8.00 857 0.99 0.71 106 1.20 0.29 0.45 77 129 49 32 1.51 162 1.64 176 1.94 2.19 208 235 2.64 2.78 283 298 3.24 347 3.42 367 3.62 388 5.82 623 4.83 4.68 517 4.18 4.34 501 448 465 6.57 6.74 6.33 703 722 678 7.00 750 7.53 7.85 806 840 7.88 8.06 844 863 8.55 915 8.40 899 8.74 936 9.05 969 9.11 975 9.59 9.77 1027 1046 Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 x 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50