Nguyễn phương thảo xây dựng phương pháp định lượng benzalkonium clorid trong thịt lợn bằng lc msms khoá luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN PHƯƠNG THẢO XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BENZALKONIUM CLORID TRONG THỊT LỢN BẰNG LC-MS/MS KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN PHƯƠNG THẢO MÃ SINH VIÊN : 1801647 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BENZALKONIUM CLORID TRONG THỊT LỢN BẰNG LC-MS/MS KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Thanh Thuỷ ThS Cao Công Khánh Nơi thực : Bộ mơn Hố Dược Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Thanh Thuỷ ThS Cao Công Khánh người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ em suốt trình thực đề tài hồn thiện khố luận Em xin chân thành cảm ơn ThS Mạc Thị Thanh Hoa ThS Đỗ Duy Linh cán công tác Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia đồng hành hỗ trợ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo Bộ môn Hố Dược thầy Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình ln bên cạnh ủng hộ, động viên suốt trình học tập nghiên cứu để em hồn thành khố luận cách tốt Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Phương Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Benzalkonium clorid 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo 1.1.2 Tính chất 1.1.3 Lịch sử phát triển sản phẩm 1.1.4 Tác dụng Benzalkonium clorid 1.1.5 Độc tính Benzalkonium clorid 1.1.6 Các sản phẩm chứa Benzalkonium clorid thị trường 1.1.7 Quy định hành giới hạn hàm lượng Benzalkonium clorid thịt 1.2 Một số phương pháp xác định dư lượng Benzalkonium clorid giới 1.2.1 Phương pháp HPLC với detector UV 1.2.2 Phương pháp GC-MS 1.2.3 Phương pháp HPLC – MS/MS 1.3 Một số nghiên cứu xác định dư lượng Benzalkonium clorid Việt Nam 1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 10 1.4.1 Phương pháp xử lý mẫu QuEChERS 10 1.4.2 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị 14 2.2.1 Chất chuẩn 14 2.2.2 Hoá chất dung môi 14 2.2.3 Thiết bị 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 15 2.3.1 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng BAC LC-MS/MS 15 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 16 2.3.3 Áp dụng phương pháp để phân tích mẫu thịt lợn thị trường 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp LC-MS/MS 16 2.4.2 Phương pháp xử lí mẫu dự kiến 16 2.4.3 Thẩm định phương pháp 18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 20 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 21 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng 22 3.1.3 Khảo sát, tối ưu quy trình xử lý mẫu 23 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 28 3.2.1 Độ ổn định hệ thống 28 3.2.2 Độ đặc hiệu 29 3.2.3 Xác định LOD LOQ 30 3.2.4 Xây dựng đường chuẩn 31 3.2.5 Độ lặp lại (độ chụm) độ (độ thu hồi) 33 3.2.5 Độ tái lập nội 36 3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích Benzalkonium clorid thịt lợn 38 3.4 Bàn luận 40 3.4.1 Về phương pháp định tính, định lượng BAC mẫu thịt lợn 40 3.4.2 Về ứng dụng phương pháp xây dựng định tính, định lượng BAC mẫu thực 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN AOAC BAC CTCT CTPT EPA ESI EtOAc GC HLNT HL Tên tiếng Anh tên khoa học Acetonitril Association of Official Analytical Chemists Benzalkonium chlorid United States Environmental Protection Agency Electrospray Ionization Ethyl acetat Gas Chromatography High Performance Liquid Chromatography High Performance Liquid HPLC – MS Chromatography - Mass Spectrometry High Performance Liquid HPLC – UV Chromatography - Ultraviolet High Performance Liquid HPLC – MS/MS Chromatography tandem Mass Spectrometry KLPT Liquid Chromatography - Mass LC-MS Spectrometry LOD Limit of detetion LOQ Limit of quantitation MeOH Methanol HPLC MRL Maximum Residue Level PSA SPE TLTK TT Primary Secondary Amine Solid phase extract References UPLC Ultra Performacnce Liquid Chromatography Tiếng việt Acetonitril Hiệp hội nhà phân tích hóa học Benzalkonium clorid Công thức cấu tạo Công thức phân tử Cục Bảo vệ Mơi trường Hoa Kỳ Ion hóa tia điện tử Ethyl acetat Sắc ký khí Hàm lượng nguyên trạng Hàm lượng Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng hiệu cao khối phổ Sắc ký lỏng hiệu cao detector UV Sắc ký lỏng hiệu cao khối phổ hai lần Khối lượng phân tử Sắc ký lỏng khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Methanol Mức giới hạn dư lượng tối đa cho phép Amin thứ cấp Chiết pha rắn Tài liệu tham khảo Thứ tự Sắc ký lỏng siêu hiệu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Công thức phân tử, khối lượng phân tử BAC chuẩn nội Bảng 1.2 Một số nhóm sản phẩm áp dụng mức dư lượng tối đa BAC Bảng 1.3 Phương pháp xác định hàm lượng BAC HPLC với detector UV Bảng 1.4 Phương pháp xác định hàm lượng BAC GC– MS Bảng 1.5 Phương pháp xác định hàm lượng BAC HPLC – MS/MS Bảng 1.6 Một số nghiên cứu xác định dư lượng Benzalkonium clorid Việt Nam Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ BAC DDAC-C10 D6 (IS) 21 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu MS 22 Bảng 3.3 Chương trình gradient dung mơi pha động 23 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ thu hồi sử dụng dung môi chiết khác 24 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ thu hồi sử dụng hỗn hợp muối chiết khác 25 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ thu hồi sử dụng thành phần d-SPE khác 25 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ thu hồi sử dụng tỷ lệ muối khác d-SPE 26 Bảng 3.8 Kết khảo sát thời gian chiết 26 Bảng 3.9 Kết khảo sát ảnh hưởng mẫu thịt lợn đến tín hiệu BAC 28 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ ổn định thời gian lưu chất phân tích 28 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ ổn định diện tích pic chất phân tích 28 Bảng 3.12 Thời gian lưu số điểm IP BAC 29 Bảng 3.13 Bảng tỷ lệ cường độ hai ion BAC 30 Bảng 3.14 Kết ước lượng LOD phương pháp phân tích 30 Bảng 3.15 Kết đánh giá độ xác LOQ 31 Bảng 3.16 Đường chuẩn hệ số tương quan BAC-C8 31 Bảng 3.17 Đường chuẩn hệ số tương quan BAC-C10 31 Bảng 3.18 Đường chuẩn hệ số tương quan BAC-C12 32 Bảng 3.19 Đường chuẩn hệ số tương quan BAC-C14 32 Bảng 3.20 Đường chuẩn hệ số tương quan BAC-C16 32 Bảng 3.21 Đường chuẩn hệ số tương quan BAC-C18 32 Bảng 3.22 Kết đánh giá độ lặp lại độ thu hồi BAC-C8 33 Bảng 3.23 Kết đánh giá độ lặp lại độ thu hồi BAC-C10 34 Bảng 3.24 Kết đánh giá độ lặp lại độ thu hồi BAC-C12 34 Bảng 3.25 Kết đánh giá độ lặp lại độ thu hồi BAC-C14 35 Bảng 3.26 Kết đánh giá độ lặp lại độ thu hồi BAC-C16 35 Bảng 3.27 Kết đánh giá độ lặp lại độ thu hồi BAC-C18 36 Bảng 3.28 Kết đánh giá độ tái lập nội BAC-C8 37 Bảng 3.29 Kết đánh giá độ tái lập nội BAC-C10 37 Bảng 3.30 Kết đánh giá độ tái lập nội BAC-C12 37 Bảng 3.31 Kết đánh giá độ tái lập nội BAC-C14 37 Bảng 3.32 Kết đánh giá độ tái lập nội BAC-C16 38 Bảng 3.33 Kết đánh giá độ tái lập nội BAC-C18 38 Bảng 3.34 Bảng mã hố mẫu thực phân tích 39 Bảng 3.35 Đường chuẩn hệ số tương quan BAC 39 Bảng 3.36 Kết xác định BAC mẫu thịt lợn 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo tổng qt BAC Hình 1.2 Một số sản phẩm BAC thị trường Hình 1.3 Các bước chuẩn bị mẫu phiên QuEChERS 11 Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 12 Hình 2.1 Hệ thống Waters ACQUITY UPLC H-Class / Xevo TQ-XS IVD 15 Hình 3.1 Sắc ký đồ biểu diễn tín hiệu khả tách BAC chuẩn nội 23 Hình 3.2 Quy trình chiết Benzalkonium clorid mẫu thịt lợn 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong trình sản xuất, chế biến, kinh doanh thịt lợn, nhà sản xuất kinh doanh phải đảm bảo an toàn dịch tễ, vệ sinh an toàn thực phẩm [43], phải ngăn ngừa vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm lây nhiễm chúng phạm vi nhà máy sản xuất hay sở kinh doanh thực phẩm [11][26][39] Các sản phẩm chứa Benzalkonium clorid (BAC) sử dụng phổ biến để phòng ngừa nhiễm khuẩn bề mặt máy móc nhà máy sản xuất, sở kinh doanh thực phẩm đặc tính kháng khuẩn phổ rộng chống lại vi khuẩn, nấm vi rút [31] BAC với nồng độ khoảng 1% sử dụng để tiêu độc sát trùng trại chăn ni, nơi mua bán động vật, lị mổ sở chế biến thực phẩm (thực trước sau ca sản xuất) [43] Việc sử dụng BAC trình làm khử trùng bề mặt suốt q trình chăn ni, sản xuất thịt lợn dẫn đến dư lượng chất lại bề mặt trở thành nguồn ô nhiễm tiềm ẩn cho thịt lợn [36] Hiện nay, Việt Nam chưa ban hành quy định kiểm soát giới hạn hàm lượng BAC sản phẩm từ thịt nói chung thịt lợn nói riêng chưa có phương pháp thức xác định chất thịt lợn Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng BAC để góp phần vào cơng tác kiểm tra phát chất thịt lợn cần thiết Nhằm đưa phương pháp xác định dư lượng Benzalkonium clorid thịt lợn với hiệu suất thu hồi cao phương pháp đơn giản với thời gian phân tích hợp lý, tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng Benzalkonium clorid thịt lợn LC-MS/MS” với mục tiêu : 1- Xây dựng phương pháp định lượng Benzalkonium clorid thịt lợn LC-MS/MS 2- Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra hàm lượng Benzalkonium clorid số mẫu thịt lợn thị trường Hà Nội 6.3.a Sắc ký đồ BAC-C12 nồng độ thêm chuẩn 50 (μg/kg) 6.3.b Sắc ký đồ BAC-C12 nồng độ thêm chuẩn 100 (μg/kg) 6.3.c Sắc ký đồ BAC-C12 nồng độ thêm chuẩn 200 (μg/kg) 6.4.a Sắc ký đồ BAC-C14 nồng độ thêm chuẩn 50 (μg/kg) 6.4.b Sắc ký đồ BAC-C14 nồng độ thêm chuẩn 100 (μg/kg) 6.4.c Sắc ký đồ BAC-C14 nồng độ thêm chuẩn 200 (μg/kg) 6.5.a Sắc ký đồ BAC-C16 nồng độ thêm chuẩn 50 (μg/kg) 6.5.b Sắc ký đồ BAC-C16 nồng độ thêm chuẩn 100 (μg/kg) 6.5.c Sắc ký đồ BAC-C16 nồng độ thêm chuẩn 200 (μg/kg) 6.6.a Sắc ký đồ BAC-C18 nồng độ thêm chuẩn 50 (μg/kg) 6.6.b Sắc ký đồ BAC-C18 nồng độ thêm chuẩn 100 (μg/kg) 6.6.c Sắc ký đồ BAC-C18 nồng độ thêm chuẩn 200 (μg/kg) PHỤ LỤC ĐƯỜNG CHUẨN PHÂN TÍCH MẪU THỰC 7.1 Đường chuẩn BAC-C8 Compound name: BAC C8 Correlation coefficient: r = 0.999404, r^2 = 0.998808 Calibration curve: 22.7783 * x + -3.66632 Response type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Response 2000 1500 1000 500 -0 -0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Conc 100 90 Conc 100 7.2 Đường chuẩn BAC-C10 Compound name: BAC C10 Correlation coefficient: r = 0.999503, r^2 = 0.999006 Calibration curve: 9.21383 * x + -1.78677 Response type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Response 750 500 250 -0 -0 10 20 30 40 50 60 70 80 7.3 Đường chuẩn BAC-C12 Compound name: BAC C12 Correlation coefficient: r = 0.998723, r^2 = 0.997449 Calibration curve: 6.02759 * x + 1.0661 Response type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Response 600 400 200 -0 -0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Conc 100 7.4 Đường chuẩn BAC-C14 Compound name: BAC C14 Correlation coefficient: r = 0.997830, r^2 = 0.995666 Calibration curve: 1.46696 * x + -0.22242 Response type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Response 150 100 50 -0 -0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Conc 100 7.5 Đường chuẩn BAC-C16 Compound name: BAC C16 Correlation coefficient: r = 0.999553, r^2 = 0.999106 Calibration curve: 6.99108 * x + -1.12178 Response type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Response 600 400 200 -0 -0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Conc 100 7.6 Đường chuẩn BAC-C18 Compound name: BAC C18 Correlation coefficient: r = 0.999727, r^2 = 0.999454 Calibration curve: 10.0712 * x + 3.71125 Response type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Response 1000 750 500 250 -0 -0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ppb 100