Khóa luận tốt nghiệp xây dựng quy trình định lượng glucosamine trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  - BẠCH PHƯƠNG DUNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMINE TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hà Nội – 09/2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMINE TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Người thực : Bạch Phương Dung Lớp : K62CNTPB Khóa : 62 Khoa : Cơng Nghệ Thực Phẩm Mã SV: 620935 Giáo viên hướng dẫn : T.S Nguyễn Thị Hồng Lan Bộ mơn: Thực phẩm Dinh dưỡng Th.S Nguyễn Thị Lê Hịa Khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh dưỡng Hà Nội – 09/2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: khóa luận cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu khảo sát tình hình thực tiễn hướng dẫn khoa học T.S Nguyễn Thị Hồng Lan Th.S Nguyễn Thị Lê Hịa Số liệu, bảng biểu kết khóa luận trung thực, nhận xét, phương hướng đưa xuất phát từ thực tiễn kinh nghiệm có Một lần xin khẳng định trung thực lời cam đoan Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên thực Bạch Phương Dung i LỜI CẢM ƠN Bản luận văn thực Viện Dinh Dưỡng Quốc Gia, 48B Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội hồn thành Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam, với hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Lan Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn trân thành tới: Th.S Nguyễn Thị Lê Hòa - Viện Dinh dưỡng Quốc gia, người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ Đồng thời, xin chân thành cảm ơn anh chị khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh dưỡng Quốc Gia giúp đỡ tạo điều kiện cho trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Thị Hồng Lan, mơn Thực phẩm Dinh dưỡng - Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam dạy dỗ, bảo, tạo điều kiện tốt cho học tập, tạo hội cho thực tập làm khóa luận tốt nghiệp Và cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè quan tâm động viên tơi q trình học tập thực luận văn Do kiến thức khả tiếp thu thực tế nhiều hạn chế nên báo cáo cịn nhiều thiếu sót, kính mong góp ý giúp đỡ Quý thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên thực Bạch Phương Dung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Glucosamine 2.1.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa Glucosamine 2.1.2 Cơ chế tác dụng Glucosamine 2.1.3 Nguồn gốc .7 2.2 Tổng quan thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Glucosamine 2.3 Các phương pháp phân tích xác định hàm lượng Glucosamine 2.3.1 Trên giới 2.3.2 Tại Việt Nam 13 2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 14 2.4.1 Khái quát phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 14 2.4.2 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 15 PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nguyên vật liệu thiết bị 18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Chất chuẩn 18 3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 18 iii 3.1.4 Dung mơi, hóa chất .18 3.1.5 Thiết bị dụng cụ .19 3.2 Phạm vi nghiên cứu 20 3.3 Nội dung nghiên cứu phương pháp xây dựng hàm lượng Glucosamine phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 20 3.3.1 Khảo sát điều kiện phân tích Glucosamine HPLC 20 3.3.2 Thẩm định phương pháp xác định Glucosamine sắc ký lỏng hiệu cao 20 3.3.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng phân tích hàm lượng Glucosamine mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe lưu hành thị trường 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu .20 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 20 3.4.2 Quy trình dự kiến tách xác định Glucosamine thực phẩm bảo vệ sức khỏe 21 3.4.3 Thẩm định phương pháp .21 3.4.4 Ứng dụng phương pháp xây dựng phân tích Glucosamine mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe lưu hành thị trường 24 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 25 PHẦN IV: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 26 4.1.1 Lựa chọn phương pháp nghiên cứu xác định hàm lượng Glucosamine thực phẩm bảo vệ sức khỏe phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 26 4.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 28 4.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32 4.2.1 Khảo sát dung môi chiết .32 4.2.2 Khảo sát thời gian chiết 33 4.2.3 Khảo sát tỉ lệ thời gian dẫn xuất O-phthalaldehyd (OPA) .34 4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 36 4.3.1 Độ đặc hiệu 36 4.3.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 37 4.3.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .38 iv 4.3.4 Độ lặp lại .39 4.3.5 Độ thu hồi 40 4.4 Ứng dụng phương pháp xây dựng phân tích Glucosamine mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe lưu hành thị trường 41 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitrile Association of Official Hiệp hội nhà phân tích AOAC GlcN HPLC Analytical Communities thống Glucosamine High Performance Glucosamine Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng MCPA Mecaptopropionic acid ME Mecaptoethanol MeOH Methanol OPA o-phthalaldehyd PAD Photo array Diod Detector Detector mảng diot phát quang ppm parts per million Phần triệu RI Refrative Index Detector RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối RT Retention time Thời gian lưu SD Standard deviation Độ lệch chuẩn Methanol TCVN THF Tiêu chuẩn Việt Nam Tetrahydrofuran TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Độ hòa tan GlcN.HCl số loại dung môi khảo sát ở 25℃ .4 Bảng 2.2: Tổng hợp nghiên cứu cơng bố giới quy trình phân tích Glucosamine Bảng 4.1: Kết khảo sát cột sắc ký 28 Bảng 4.2: Ảnh hưởng tốc độ dòng đến sắc ký đồ GlcN 30 Bảng 4.3: Kết khảo sát dung môi chiết mẫu 32 Bảng 4.4: Khảo sát tỷ lệ dẫn xuất 34 Bảng 4.5: Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất trước bơm vào cột sắc ký 35 Bảng 4.6: Sự phụ thuộc diện tích pic sắc ký vào nồng độ GlcN 37 Bảng 4.7: Kết khảo sát giá trị LOD LOQ Glucosamine 38 Bảng 4.8: Độ lệch chuẩn (SD) độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) rắn TPBVSK nồng độ khác .39 Bảng 4.9: Độ thu hồi phương pháp mức thêm chuẩn khác 40 Bảng 4.10: Hàm lượng Glucosamin mẫu phân tích thực tế 41 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Hợp chất huỳnh quang GlcN-OPA/2ME 12 Hình 2.2: Hợp chất GlcN-OPA/3MPA 12 Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC .15 Hình 2.4: Hệ thống HPLC khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh dưỡng Quốc gia .15 Hình 3.1: Quy trình dự kiến tách xác định Glucosamine thực phẩm bảo vệ sức khỏe 21 Hình 4.1: a,b,c sắc ký đồ quang phổ hấp thụ chuẩn GlcN 500µg/ml chạy theo nghiên cứu (1), (2), (3) 27 Hình 4.2: a,b sắc ký đồ chuẩn GlcN cột C18 29 Hình 4.3: a,b sắc ký đồ chuẩn GlcN với tỷ lệ pha động 85:15 80:20 .30 Hình 4.4: a,b,c sắc ký đồ chuẩn GlcN với v1 = 0,8 ml/phút, v2 = ml/phút, v3 = 1,2 ml/phút 31 Hình 4.5: Sắc ký đồ mẫu nạp chuẩn với dung môi chiết khác 33 Hình 4.6: Ảnh hưởng thời gian đến trình chiết GlcN 34 Hình 4.7: Quy trình chiết mẫu Glucosamine tối ưu 36 Hình 4.8: a,b,c sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu trắng nạp chuẩn, mẫu chuẩn GlcN 60 ppm 36 Hình 4.9: Đường chuẩn Glucosmine .38 viii Cân xác 0,1g mẫu vào bình định mức 100ml Thêm 70ml dung môi chiết Acid acetic ACN Siêu âm nhiệt độ 65oC 40 phút Định mức vừa đủ Acid acetic ACN Ly tâm, gạn lấy dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiêm vào hệ thống HPLC Hình 4.7: Quy trình chiết mẫu Glucosamine tối ưu 4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 4.3.1 Độ đặc hiệu Tiến hành phân tích sắc ký mẫu chuẩn GlcN 60ppm, mẫu trắng nạp chuẩn 0.004 0.0003 0.0002 0.003 0.0001 AU AU 0.0000 -0.0001 -0.0002 0.002 0.001 Glucosamin - 10.554 Glucosamin - 6.689 0.0004 Glucosamin - 6.802 0.005 0.0005 0.005 0.004 0.003 AU 0.0006 Glucosamin - 10.390 GlcN 60ppm mẫu trắng.Sắc ký đồ mẫu ghi lại sau 0.002 0.001 -0.0003 -0.0004 0.000 0.000 -0.0005 -0.001 -0.0006 -0.001 -0.0007 -0.002 -0.0008 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Minutes Hình a 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 Hình b 12.00 14.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00 Hình c Hình 4.8: a,b,c sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu trắng nạp chuẩn, mẫu chuẩn GlcN 60 ppm 36 Từ kết trên, ta thấy rằng: Mẫu trắng khơng xuất pic trùng thời gian lưu chất phân tích Mẫu trắng thêm chuẩn cho pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu với pic sắc ký đồ mẫu chuẩn đối chứng, pic có hình dạng cân đối, phổ chất có hình dạng giống mẫu chuẩn Như phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu độ đặc hiệu rắn 4.3.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn Xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ từ 18 ppm tới 600ppm Dãy dung dịch chuẩn nồng độ 18; 60; 120; 240; 360; 600ppm pha loãng từ chuẩn GlcN 1200ppm để xác định khoảng tuyến tính phương pháp Tiến hành tiêm mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC để xác định tín hiệu đo (diện tích chất phân tích) Thiết lập phương trình hồi quy biểu diễn tương quan tín hiệu đo nồng độ Đồ thị tuyến tính khoảng nồng độ đảm bảo có hệ số tương quan 0,995 ≤ r ≤1 độ chệch nồng độ nhỏ khơng q 20%, nồng độ cịn lại có độ chệch khơng q 15%, kết trình bày bảng 4.6 hình 4.8 Bảng 4.6: Sự phụ thuộc diện tích pic sắc ký vào nồng độ GlcN Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mAU) Nồng độ GlcN tính lại theo đường chuẩn (ppm) Độ chệch (%) 18 145,637 1,40 12,30 60 774,687 7,84 1,94 120 1,610,086 16,40 2,49 240 8,118,903 83,05 3,81 360 15,180,821 155,36 2,90 600 31,409,342 321,54 0,48 37 Diện tích peak 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 y = 2231.8x - 9251.6 R² = 0.9998 100 200 300 400 500 600 700 Nồng độ (𝛍l/ml) Hình 4.9: Đường chuẩn Glucosmine Nhận xét: Kết cho thấy, khoảng nồng độ khảo sát với GlcN, có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ từ 18ppm đến 600ppm Giá trị tuyệt đối độ chệch không lớn 20% giá trị trị 0,99 ≤ R2 ≤1 Vì khoảng tuyến tính GlcN lập khoảng từ 18ppm đến 600ppm đạt yêu cầu tiêu chuẩn AOAC (Analysis AOAC Official methods of, 2016) 4.3.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Tiến hành thí nghiện song song lần với mẫu trắng thêm chuẩn nồng độ μl/ml Thực bước quy trình phân tích mục 3.3.2 Kết trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7: Kết khảo sát giá trị LOD LOQ Glucosamine C 𝐶̅ (g/ml) (g/ml) Lần Diện tích pic 12,345 6,10 10,958 5,45 12,554 6,19 10,359 5,17 11,830 5,86 5,672 SD 0,376 LOD LOQ R= (g/ml) (g/ml) 1,13 / LOD 5,03 3,76 38  x 10,535 5,25 12,206 6,03 11,425 5,67 10,541 5,25 10 11,599 5,75 Kết cho thấy R = 5,03 nằm khoảng < R < 10 nồng độ dung dịch thử C= μl/ml phù hợp LOD tính đáng tin cậy Giới hạn phát thiết bị GlcN 1,13 μg/ml Kết phân tích bảng sử dụng lượng mẫu phân tích 0,2g định mức 100ml giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp là: LOD = 1,13 x 100 / 0,2 = 565 (μg/g) LOQ = 3,3 x 565 = 1864,5 (μg/g) 4.3.4 Độ lặp lại Tiến hành phân tích mẫu trắng thêm chuẩn mức nồng độ khác nhau: thấp, trung bình, cao (n=7) Nạp chuẩn mức thấp 20,16 ppm: Nạp 0,84ml chuẩn GlcN 2400ppm vào 0,1 g mẫu đồng nhất, chiết theo quy trình định mức 100 ml Nạp chuẩn mức trung bình 60 ppm: Nạp 2,5ml chuẩn GlcN 2400ppm vào 0,1g mẫu đồng nhất, chiết theo quy trình định mức 100ml Nạp chuẩn mức cao 150 ppm: Nạp 6,25 ml chuẩn GlcN 2400ppm vào 0,1g mẫu đồng nhất, chiết theo quy trình định mức 100ml Kết độ lệch chuẩn (SD) độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) mẫu TPBVSK thể bảng 4.8 Bảng 4.8: Độ lệch chuẩn (SD) độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) rắn TPBVSK nồng độ khác 39 Mức thêm chuẩn Thấp Diện tích pic trung bình Tên mẫu Xtb (μl/ml) SD RSD (%) (mAU) GlcN 41,942 19,90 0,39 1,94 GlcN 122,878 59,20 1,14 1,92 GlcN 327,534 150,90 4,23 2,8 20,16 μl/ml Trung bình 60 μl/ml Cao 150 μl/ml Nhận xét: Kết cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt dối với mẫu thêm chuẩn GlcN mức nồng độ 20,16ppm, 60ppm 150ppm với độ lệch chuẩn tương đối RSD tương ứng 1.94%, 1,92% 2,80%, đạt yêu cầu quy định tiêu chuẩn AOAC 2016 ≤ 5,3% (Analysis AOAC Official methods of, 2016) 4.3.5 Độ thu hồi Độ thu hồi phương pháp tính tốn dựa thí nghiệm thêm chuẩn vào mẫu biết trước hàm lượng Tiến hành phân tích lặp lại lần mức khác Bảng 4.9: Độ thu hồi phương pháp mức thêm chuẩn khác Hệ số thu hồi trung bình Mức thêm chuẩn Tên mẫu Xtb (μl/ml) Thấp 20,16 μl/ml GlcN 19,90 98,35 GlcN 59,20 98,67 GlcN 150,90 100,60 Trung bình 60 μl/ml Cao 150 μl/ml 40 (%) Nhận xét: Kết thực nghiệm cho thấy giá trị trung bình độ thu hồi nồng độ 20,16ppm, 60ppm, 150ppm mẫu TPBVSK rắn nạp chuẩn tương ứng 98,35%, 98,67% 100,60% Như hệ số thu hồi GlcN đạt yêu cầu AOAC từ 80-105% (Analysis AOAC Official methods of, 2016) Vậy mẫu rắn, phương pháp xây dựng cho độ thu hồi, độ độ xác đáp ứng theo yêu cầu AOAC 2016 Điều cho thấy phương pháp xây dựng đủ tin cậy xác để ứng dụng xác định chất phân tích 4.4 Ứng dụng phương pháp xây dựng phân tích Glucosamine mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe lưu hành thị trường Sau tìm điều kiện tối ưu cho q trình xử lý mẫu phân tích GlcN thực phẩm bảo vệ sức khỏe, tiến hành phân tích mẫu thực tế số TPBVSK có thị trường Cơng bố định lượng hoạt chất Glucosamine kiểm nghiệm định lượng được, sai số ±10% với hàm lượng ghi nhãn (Luật Dược Việt Nam Vnras, 7/06/2017) Kết trình bày bảng sau Bảng 4.10: Hàm lượng Glucosamin mẫu phân tích thực tế Mã Khối lượng ruột viên (g) Dạng muối hàm lượng công bố Hàm lượng (mg/kg) Hàm lượng (mg/viên) G01 1,8387 G.HCl-1600mg/v 427815,49 786,63 Không đạt G02 0,5572 G.sunfat-600mg/v 430868,45 288,62 Không đạt G03 1,1309 G.sunfat1500mg/v 550136,61 747,95 Không đạt G04 1,2028 G.sunfat-750mg/v 512205,57 740,65 Đạt G05 0,6123 G.HCl 250mg/v 402670,03 246,54 Đạt G06 0,5550 G.sunfat-600mg/v 409322,35 273,11 Không đạt G07 0,56554 G.sunfat-600mg/v 450902,80 306,56 Không đạt G08 0,54016 G.sunfat-600mg/v 377180,46 244,93 Không đạt G09 1,12973 G.HCl 1500mg/v 570166,69 774,38 Không đạt 41 Kết Nhận xét: Trong mẫu phân tích có mẫu nhà sản xuất cơng bố hàm lượng bao bì, nhiên mẫu không đạt tiêu hàm lượng Glucosamine có mặt sản phẩm (các sản phẩm bị làm nhái bị làm giả) mẫu đạt hàm lượng Glucosamine theo công bố Đánh giá chung: Hiện nay, thực phẩm bảo vệ sức khỏe cải thiện chức xương khớp có mặt nhiều thị trường với đa dạng hóa sản phẩm Vì khuyến cáo người tiêu dùng nên sử dụng sản phẩm có nguồn gốc rõ ràng, mua nhà thuốc uy tín Qua kiến nghị đơn vị quản lý nên thắt chặt tra mặt hàng thực phẩm bảo vệ sức khỏe thị trường đảm bảo bảo vệ sức khoẻ quyền lợi người tiêu dùng, đặt yêu cầu quan nghiên cứu quản lý chất lượng – an toàn thực phẩm phát triển phương pháp kiểm nghiệm phù hợp để giám sát chất lượng thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Glucosamine 42 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu để định lượng Glucosamine thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector PDA, thu kết sau  Nghiên cứu tối ưu điều kiện chạy sắc ký lỏng: Pha tĩnh: Cột C8 (150 x 4.6mm; 5µm) Nhiệt độ cột: 35oC Thể tích tiêm mẫu: 12l Thời gian phân tích: phút Tốc độ dịng pha động: 1ml/ phút Chương trình pha động: chế độ rửa giải đẳng dịng với tỉ lệ pha động kênh A: Đệm Acetat (pH = 5.9) phối hợp với kênh B: MeOH (80:20)  Đã khảo sát tối ưu điều kiện chiết với quy trình chiết mẫu: Dung mơi chiết: hỗn hợp dung dịch Acid acetic : ACN Thời gian chiết: 40 phút Tỷ lệ dẫn xuất đệm Borat:OPA:Mẫu 8:2:2 thời gian phút  Đã thẩm định phương pháp xác định Glucosamine với kết sau: Phương pháp có độ đặc hiệu với Glucosamine Khoảng tuyến tính từ 18-600μg/ml, có hệ số tương quan r2 = 0,9998 Giới hạn phát hiện: Giới hạn phát thiết bị: IDL = 1,13 μg/ml Giới hạn phương pháp LOD = 565 (μg/g) Giới hạn định lượng: Giới hạn định lượng thiết bị: MDL = 3,76 μg/ml 43 Giới hạn định lượng phương pháp: LOQ = 1864,5 (μg/g) Độ lặp lại phương pháp: RDS (%) = 1,92- 2,80%, độ thu hồi từ 98,35- 100,6% (đáp ứng yêu cầu AOAC) cho thấy phương pháp có độ xác cao  Ứng dụng phương pháp để phân tích mẫu rắn TPBVSK nhóm hỗ trợ xương khớp địa bàn Hà Nội, kết có 7/9 mẫu có hàm lượng Glucosamin khơng đạt u cầu cơng bố bao bì sản phẩm 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu phát Glucosamine TPBVSK, cần tiếp tục nghiên cứu phát triển phương pháp để phát chất nhóm hoạt chất nguồn tổng hợp như: Chondroitin, Diacerein, MSM,…nhằm xác định đồng thời phương pháp Tiếp tục nghiên cứu thêm quy trình phân tích Glucosamin nang mềm, hồn mềm… Cần phân tích thêm số lượng mẫu nhiều để có số liệu đầy đủ hàm lượng Glucosamine thực phẩm bảo vệ sức khỏe-cải thiện xương khớp 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Công ty cổ phần thực phẩm Thiên Nguyên (2021) D-glucosamine-sulfate-2Nacl Truy cập từ https://thiennguyen.net.vn/d-glucosamine-sulfate-2nacl.html ngày 24/7/2021 Cục Quản lý Dược (2010) Công văn số 6132/QLD-ĐK ngày 16/06/2010 việc hướng dẫn ghi định điều trị, chống định liều dùng glucosamin Truy cập từ https://thuvienphapluat.vn/cong-van/The-thao-Y-te/Cong-van-6132QLD-DK-huong-dan-ghi-chi-dinh-dieu-tri-chong-chi-dinh-lieu-dung108334.aspx ngày 7/7/2021 Nguyễn Thu Hiền (2012) Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật tạo nguyên liệu thực phẩm giàu Glucosamine protein từ cua đồng Luận văn Thạc sĩ sinh học Phạm Thị Khánh Vân & Vũ Thị Thái (2004) Phím nước mắt tác dụng Chondrroitin sulfate, Tạp chí Thuốc Sức khoẻ, số 273 tháng 12/2004 Trần Hồng Lê (2010) Khảo sát ảnh hưởng HCl định lượng glucosamin hydroclorid theo tiêu chuẩn sở Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ Phạm Luận (2006) Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Quang Mẫn & Trần Hữu Dũng (2012) Định lượng đồng thời chondroitin, glucosamin acid ascorbic thuốc đa thành phần sắc ký lỏng hiệu cao Tạp chí Dược học 437: 37-41 Hồ Thị Bích Phượng cs (2020), Microrna tuần hồn - Dấu chứng sinh học tiềm cho chẩn đoán sớm bệnh thối hóa khớp Circulating microRNAs - The potential biomarkers for early diagnosis of osteoarthritis Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh 15(1): 16-26 PR, Pinpoint (13/12/2019) Vitafoods Asia 2019: hội cho dược phẩm dinh dưỡng Việt Nam Truy cập https://www.mynewsdesk.com/sg/pinpointpr/pressreleases/vitafoods-asia-2019-co-hoi-cho-duoc-pham-dinh-duong-taiviet-nam-2919024 ngày 10/9/2021 10 Trần Cao Sơn (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 16-59 11 Thnthao (22/04/2019) Cùng tìm hiểu Glucosamine gì, có tác dụng mua đâu? Truy cập https://fado.vn/blog/cung-tim-hieu-glucosamine-la-gi-cotac-dung-gi-va-mua-o-dau.n18637/ ngày 24/6/2021 Nguyễn Lục Thơ, Nguyễn Thị Chung & Nguyễn Đức Tuấn (2014) Xây dựng quy trình định lượng Glucosamin phương pháp HPLC với đầu dò PDA Y Học TP Hồ Chí Minh 17(2): 57-161 12 13 Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC) (14/04/2020) Kiểm nghiệm thực phẩm chức năng, thực phẩm bảo vệ sức khỏe 14 Luật Dược Việt Nam Vnras (7/06/2017) Chỉ tiêu kỹ thuật phải công bố kiểm nghiệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Tài liệu Tiếng Anh 15 16 Analysis AOAC Official methods of (2016) Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements, Official Methods of Analysis of AOAC International, 20th edition AOAC, USA Armando Alcázar Magaña, Katarzyna Wrobel, Alma Rosa Corrales Escobosa, Kazimierz Wrobel (2014) Fast determination of glucosamine in pharmaceutical formulations by high performance liquid chromatography without pre-column derivatization, Ciencias Médicas Diciembre 2014 24(NE-2) Ciencias Médicas Diciembre 2014 17 Arshine (2021), Glucosamine Cas 9082-07-9 18 Arthritis Australia (2015), Glucosamine and chondroitin 19 Azim Md.Sabir, Mitra Moloy & Bhashi Parminder S(2015) HPLC method development and validation: A review International Research Journal of Pharmacy 4, 39-46 Bruyère, O.Altman, R D.Reginster & J Y (2016) Efficacy and safety of glucosamine sulfate in the management of osteoarthritis: Evidence from reallife setting trials and surveys, Semin Arthritis Rheum 45(4 Suppl), S12-7 20 21 Das, A.Hammad & A, T (2000) Efficacy of a combination of FCHG49™ glucosamine hydrochloride, TRH122™ low molecular weight sodium chondroitin sulfate and manganese ascorbate* in the management of knee osteoarthritis Osteoarthritis and Cartilage 8(5), 343-350 22 Dionex Corporation (2008) Determination of Glucosamine in Chondroitin Sulfate-Containing Dietary Supplements Using HPAE-PAD Application Note 197, LPN 2001 23 European Food Safety Authority (2009), Opinion of the safety of glucosamine hydrochloride from Aspergillus niger as food ingredient EFSA Journal, 7(6), 1099 Gaonkar, Priya Khanvilkar, Vineeta Shettigar, Rajani Gadgoli & Chhaya (2006) Spectrophotometric method for determination of glucosamine in tablets Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 68(1) 24 25 Harmita, H., Jatmika, C., & Nugraha, M I (2017) Determination of levels of glucosamine hydrochloride and chondroitin sulfate in mixtures in tablet and cream forms using high-performance liquid chromatography with fluorescence International Journal of Applied Pharmaceutics, 9, 144 26 Hooper & Michele (2001) Is glucosamine an effective treatment for osteoarthritic pain? Cleveland Clinic Journal of Medicine, 68(6), 494-495 27 Joseph Ziqi Zhou, Ted Waszkuc & Felicia Mohammed (2005) Determination of glucosamine in raw materials and dietary supplements containing glucosamine sulfate and/or glucosamine hydrochloride by high-performance liquid chromatography with FMOC-Su derivatization: collaborative study Journal of AOAC International, 88(4), 1048-1058 28 Lorraine Heller (25-1-2008) Another vegetarian glucosamine launched in US, NutraIngredient.com Marc Cohen, Rory Wolfe, Trudy Mai & Daniel Lewis (2003) A randomized, double blind, placebo controlled trial of a topical cream containing glucosamine sulfate, chondroitin sulfate, and camphor for osteoarthritis of the knee, J Rheumatol 30, 523-528 29 30 Martel-Pelletier J, Farran A, Montell E, Vergés J & Pelletier JP (2015) Discrepancies in composition and biological effects of different formulations of chondroitin sulfate, Molecules 20(3), 4277-4289 31 S Pulla redd & C Rambabu (2015) Simultaneous Determination of Glucosamine and Diacerein in Pharmaceutical Dosage Form by RP-HPLC, Department of Chemistry, Acharya Nagarjuna University, Guntur, Andhra Pradesh, India 2(2), 139-151 32 Sánchez-Machado & Delgado-Rosas (2019) Glucosamine Market- Global Industry Analysis, Size, Share, Growth, Trends, And Forecast 2020-2030 33 Setnikar I., Giacchetti C & Zanolo G (1986) Pharmacokinetics of glucosamine in the dog and in man Arzneimittelforschung 36(4), 729-35 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 2016 TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất phân tích Đơn vị RSD (%) 100 100% 1,3 ≥ 10 10-1 10% 1,9 ≥1 10-2 1% 2,7 ≥ 0,1 10-3 0,1% 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10ppb 21 10 0,0000001 10-9 ppb 30 Phụ lục 2: Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 2016 TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất phân tích Đơn vị Độ thu hồi (%) 100 100% 98-102 ≥ 10 10-1 10% 98-102 ≥1 10-2 1% 97-103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 ppb 40-120 Phụ lục 3: Sắc ký đồ số mẫu TPBVSK thị trường Hà Nội 0.004 0.003 AU Glucosamin - 10.554 Glucosamin - 6.802 0.005 0.002 0.001 0.000 -0.001 -0.002 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00 Sắc ký đồ phân tích mẫu G01 6.705 0.012 0.010 0.006 10.423 AU 0.008 0.004 0.002 0.000 -0.002 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00 Sắc ký đồ phân tích mẫu G03 6.803 0.007 0.006 0.005 AU 0.004 10.582 0.003 0.002 0.001 0.000 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Minutes 9.00 10.00 11.00 12.00 Sắc ký đồ phân tích mẫu G07 13.00 14.00 15.00 6.778 0.0040 0.0035 0.0030 0.0020 10.513 AU 0.0025 0.0015 0.0010 0.0005 0.0000 -0.0005 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Minutes 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Glucosamin - 6.808 0.010 0.008 AU 0.006 0.004 0.002 Glucosamin - 10.578 Sắc ký đồ phân tích mẫu G08 0.000 -0.002 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 Sắc ký đồ phân tích mẫu G09 14.00