KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ IBUPROFEN TRONG CÁC DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ IBUPROFEN TRONG CÁC DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC Giáo viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Ngọc Hưng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thành Lộc Lớp: Hóa 4C Thành phố Hồ Chí Minh – tháng năm 2013 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Paracetamol 1.1.1 Cấu tạo 1.1.2 Tính chất vật lý hóa học 1.1.3 Dược tính 1.2 Ibuprofen 1.2.1 Cấu tạo 1.2.2 Tính chất vật lý hóa học 1.2.3 Dược tính 1.3 Các loại dược phẩm chứa Paracetamol Ibuprofen 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.4.1 Phân tích Paracetamol 1.4.2 Phân tích Ibuprofen 1.4.3 Phân tích đồng thời Paracetamol Ibuprofen 1.5 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.5.1 Khái niệm 1.5.2 Nguyên tắc trình sắc ký 1.5.3 Phân loại sắc ký hấp phụ 1.5.4 Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ 1.5.5 Hệ thống HPLC 13 1.5.6 Phương pháp chọn điều kiện sắc ký 16 1.5.7 Các bước tiến hành sắc ký 19 Chương THỰC NGHIỆM 21 2.1 Hóa chất dụng cụ 21 2.1.1 Hóa chất 21 2.1.2 Dụng cụ - Thiết bị 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký HPLC 23 2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng hỗn hợp Paracetamol Ibuprofen 26 2.2.3 Ứng dụng quy trình phân tích mẫu dược phẩm 27 2.2.4 Phương pháp xử lý đánh giá kết 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký 31 3.1.1 Chọn cột thể tích vịng mẫu 31 3.1.2 Đặt bước sóng cho detector 31 3.1.3.Khảo sát nồng độ acid phosphoric 33 3.1.4 Khảo sát thành phần pha động 35 3.1.5 Khảo sát tốc độ dòng 37 3.2 Xây dựng phương pháp định lượng 39 3.2.1 Xác định LOD LOQ thiết bị 39 3.2.2 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 39 3.2.3 Khảo sát độ lặp lại phép đo 42 3.3 Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thật 43 3.3.1 Quy trình chiết mẫu 43 3.3.2 Xác định hệ số thu hồi phương pháp 44 3.3.3 Định lượng Paracetamol Ibuprofen số mẫu dược phẩm 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Đề xuất 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Trang MỞ ĐẦU Ngày với tốc độ phát triển nhanh chóng khoa học kỹ thuật, công nghệ bào chế thuốc không ngừng có bước đột phá số lượng chất lượng Cùng với xu hội nhập giới, Việt Nam chế phẩm thuốc chuyên giảm đau, hạ sốt, kháng viêm… sản xuất đa dạng, thành phần không chứa dược chất có hoạt tính mà cịn chứa nhiều loại tá dược nhằm tăng hiệu điều trị Dược phẩm loại hàng hóa đặc biệt nên khâu kiểm nghiệm chất lượng thuốc trở nên quan trọng; điều đem lại cho người bệnh hiệu an toàn Trên thị trường nay, chế phẩm ngồi nước có tác dụng điều trị bệnh thông thường cảm cúm, nhức đầu, giảm đau, kháng viêm, hạ sốt… thường có thành phần Paracetamol, Ibuprofen Caffein… Vì nhu cầu phân tích định tính định lượng dược chất quan tâm Ở Việt Nam, nhà phân tích nghiên cứu ứng dụng nhiều phương pháp phân tích đại trắc quang, điện di mao quản, sắc ký lỏng, sắc ký khí… để xây dựng quy trình phân tích cho loại dược phẩm khác Trên xu hướng đó, nhiều cơng trình nghiên cứu định tính định lượng Paracetamol, Ibuprofen Caffein loại dược phẩm thực Trong dược điển Mỹ USP30 (United State Pharmacy), phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (viết tắt HPLC) phương pháp quy định cho phép định lượng đồng thời Paracetamol Ibuprofen chế phẩm hai thành phần có chứa đồng thời hai dược chất chế phẩm thành phần chứa Paracetamol Ibuprofen Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC để phân tích dược phẩm có chứa hai thành phần hạn chế, chưa nghiên cứu sâu Cùng với trang thiết bị đại sở vật chất vốn có phịng thí nghiệm Bộ mơn Hóa Phân Tích – Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chúng tơi định chọn đề tài: “Xác định đồng thời Paracetamol Ibuprofen dược phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” để nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích mẫu dược phẩm có chứa Paracetamol Ibuprofen chứa hai thành phần Trang Chương TỔNG QUAN 1.1 Paracetamol [1] Paracetamol (còn gọi Acetaminophen) dược chất phổ biến nước ta có tác dụng giảm đau, hạ sốt nhanh… 1.1.1 Cấu tạo Công thức phân tử: C H NO Khối lượng phân tử: 151,17 g/mol Danh pháp IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl)acetamide 1.1.2 Tính chất vật lý hóa học Tỷ trọng: 1,263 g/cm3 Nhiệt độ nóng chảy: 1690C (3360F) Độ hịa tan nước: 0,1 – 0,5 g/100 ml 200C Paracetamol chất khơng mùi, có vị đắng, tinh thể dạng bột màu trắng Nó hịa tan dung mơi hữu methanol ethanol tan nước ether Dung dịch bão hịa có pH = 5,5 – 6,5 1.1.3 Dược tính Paracetamol thuốc giảm đau, hạ sốt có tác dụng chống viêm aspirin So với loại thuốc khác, Paracetamol có tác dụng phụ theo liều điều trị phép bán khơng cần kê đơn Điều trị nhanh chóng hiệu đau đầu, hạ sốt, triệu chứng cảm cúm, đau sau tiêm vaccin, đau mọc không trị viêm 1.2 Ibuprofen [1] Ibuprofen loại dược chất danh mục thuốc thiết yếu tổ chức Y tế Thế giới, biết đến loại thuốc chống viêm dùng liều thấp có hiệu cao điều trị 1.2.1 Cấu tạo Công thức phân tử: C 13 H 18 O Khối lượng phân tử: 206,28 g/mol Danh pháp IUPAC: 2-[4-(2-methylpropyl)phenyl]propanoic acid Trang 1.2.2 Tính chất vật lý hóa học Ibuprofen tồn dạng bột kết tinh khơng màu, có mùi đặc biệt Thực tế không tan nước, tan ethanol, cloroform, ether acetone Tan dung dịch kiềm loãng hydroxide carbonate Về mặt hóa học Ibuprofen acid hữu yếu Nhiệt độ nóng chảy 760C Ibuprofen ổn định mơi trường khơng có O , nhiệt độ 105 – 1100C, Ibuprofen bền vững ngày 1.2.3 Dược tính Ibuprofen thuốc chống viêm khơng steroid, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm, dạng bào chế phổ biến viên nén Điều trị đau từ nhẹ đến vừa tình trạng viêm, đau bụng kinh, nhức nửa đầu, đau hậu phẫu, đau răng, bệnh xương khớp, viêm khớp, viêm đa khớp dạng thấp, thấp khớp niên, bệnh quanh khớp, viêm bao gân, mô mềm, bong gân, căng 1.3 Các loại dược phẩm chứa Paracetamol Ibuprofen Danh mục thuốc có chứa Ibuprofen: Alaxan, Amfadol plus, Apo – Ibuprofen, Doaxan – S, Do – Parafen F, Hagifen, Hapacol đau nhức, Ibuprovon, I – Pan, Mofen 400, Parofen, Protamol, Sotstop, Tatanol Extra, Vell, Ibufene Choay… Danh mục thuốc có chứa Paracetamol: Aceralgin, Alaxan, Andol S, Decolgen Forte, Panadol 500, Hapacol Extra, Efferalgan 500, Tiffy, Tatanol plus… Các loại thuốc bán rộng rãi nước, đại lý thuốc tây, bệnh viện nhà thuốc tư nhân 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.4.1 Phân tích Paracetamol Nghiên cứu “Định lượng đồng thời Paracetamol Cafein chế phẩm phương pháp đo quang” năm 2008 tác giả Đặng Thanh Thủy xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Paracetamol Cafeine phương pháp quang phổ tử ngoại đạo hàm đạo hàm tỷ đối Đồng thời áp dụng phương pháp để định lượng Paracetamol Cafeine số biệt dược thông dụng thị trường [2] Cũng năm 2008, tác giả Đặng Quỳnh Chi nghiên cứu đề tài: “Định lượng đồng thời Paracetamol Codein Phosphat phương pháp điện di mao quản” Với Trang nghiên cứu này, tác giả xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Paracetamol Codein phosphat Trong điều kiện điện di, thời gian di chuyển Codein Phosphat 2,5 phút Paracetamol 2,9 phút, khoảng nồng độ tuyến tính 0,06 – 0,40 mg/ml Codein Phosphat 0,19 – 0,120 mg/ml Paracetamol Phương pháp nhằm khảo sát phù hợp độ lặp lại độ Những chế phẩm có hàm lượng hai thành phần chênh lệch 20 lần phân tích mẫu thử phải tiến hành độ pha loãng khác Phương pháp áp dụng để định lượng hàm lượng hoạt chất viên nén Para Codein công ty dược phẩm 3/2 [3] Năm 2009, tác giả Deodhar MN cộng áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao dùng cột pha đảo (RP - HPLC) để phân tích định lượng Paracetamol Aceclofenac với điều kiện cột pha đảo C 18 ( 250x4,6 mm, 10 µm), pha động hỗn hợp methanol : nước có tỷ lệ 70 : 30 thể tích (v/v), tốc độ dịng ml/phút với đầu dị (detector) đặt bước sóng 275 nm Thời gian lưu Aceclofenac Paracetamol 1,8 2,7 phút Khoảng tuyến tính – 50 ppm cho Aceclofenac – 50 ppm cho Paracetamol Độ thu hồi cho Aceclofenac Paracetamol 100,6 % 100,7 % Phương pháp đánh giá có độ xác, độ chọn lọc cao nhanh chóng định lượng đồng thời Aceclofenac Paracetamol [4] 1.4.2 Phân tích Ibuprofen Một phương pháp thường gặp nghiên cứu định lượng Ibuprofen phương pháp phổ huỳnh quang Năm 2001, tác giả Patricia C Damiani cộng áp dụng phương pháp để phân tích Ibuprofen mẫu dược phẩm, kem si rô Bước sóng kích thích 263 nm phát xạ 288 nm Khoảng nồng độ tuyến tính – 73 mg/l Phương pháp có độ chọn lọc cao nên có mặt chất khác tá dược khơng ảnh hưởng đến kết phân tích, ngoại trừ Chlorzoxazone viên nén Chlorzoxazone hấp thụ mạnh mẽ phạm vi quang phổ Ngoài nhiều phương pháp khác biết đến nhiều phương pháp HPLC [5] Năm 2003, S.A Kulichenko S.O Fessenko nghiên cứu độ hòa tan tính acid – base Ibuprofen hệ có chất hoạt động bề mặt, sau đề xuất phương pháp chuẩn độ Ibuprofen dạng tinh khiết Giá trị pK a nhỏ (4,43) độ hòa tan lớn (8,1 mg/ml) Ibuprofen đạt sử dụng chất hoạt động bề mặt dung dịch tridecylpyridinium bromide 0,1 M Phép chuẩn độ thực với dung dịch chuẩn KOH 0,05 M, thị xanh xylenol Qua đó, nghiên cứu đề xuất điều kiện xác định Ibuprofen Novocaine hydrocloride [6] Trang Năm 2007, Nguyễn Hữu Mỹ cộng nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để định lượng Ibuprofen huyết tương chó Với điều kiện sắc ký sau: cột pha đảo C 18 (RP-18) kích thước cột 150 x 4,6 mm, kích thước hạt µm; đầu dị (detector) đặt bước sóng 223 nm, pha động hỗn hợp acetonitril (ACN) dung dịch đệm phosphat 0,02 M có pH = 6,5 (tỷ lệ 30 : 70 v/v) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút Khoảng nồng độ tuyến tính Ibuprofen từ - 20 μg/ml, giới hạn định lượng μg/ml Phương pháp có độ lặp lại cao, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) < 3%, độ xác, hệ số thu hồi (R%) > 96%, hiệu suất chiết cao > 80%, trình chuẩn bị mẫu đơn giản, phù hợp cho nghiên cứu dược động học [7] Sau đó, năm 2008, tác giả Phạm Thanh Huyền dùng phương pháp HPLC để định lượng Ibuprofen huyết tương Nhưng đối tượng bệnh nhân nhi nhằm phục vụ công tác theo dõi điều trị bệnh Điều kiện tách sắc ký sử dụng cột RP 18 (150 x 4,6 mm; mm), đầu dị (detector) đặt bước sóng 223 nm, pha động hỗn hợp ACN dung dịch đệm phosphat 0,01M có pH = 6,5 (tỷ lệ 60 : 40 v/v) với tốc độ dòng 1,0 ml/phút Khoảng nồng độ tuyến tính Ibuprofen từ - 50 μg/ml, giới hạn định lượng μg/ml Phương pháp có độ lặp lại cao (RSD < 5%), độ xác (R% > 95%), hiệu suất chiết cao (83%) [8] 1.4.3 Phân tích đồng thời Paracetamol Ibuprofen Năm 2010, tác giả Phạm Thu Quế xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Paracetamol Ibuprofen phương pháp quang phổ đạo hàm, lấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) làm phương pháp đối chiếu Ứng dụng phương pháp để định lượng Paracetamol Ibuprofen số lô chế phẩm: Alaxan, Dibulaxan Febro [9] Sau đó, tác giả M.R Khoshayand cộng ứng dụng phương pháp quang phổ định lượng ba thành phầnParacetamol, Ibuprofen Caffein loại thuốc, tiến hành quét phổ hấp thụ khoảng 200 nm đến 400 nm dung môi hỗn hợp methanol : HCl 0,1 M (3 : 1) [10] Năm 2005, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), tác giả Thái Duy Thìn cộng nghiên cứu định lượng Paracetamol, Ibuprofen nhiều dược chất khác mẫu chế phẩm dược nội ngoại Với điều kiện: cột pha đảo C 18 (5μm, 150mm x 4,6mm), pha động hỗn hợp ACN dung dịch axit phosphoric 0,1% (60: 40 v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút với bước sóng đầu dị (detector) đặt miền tử ngoại 224 nm Thời gian lưu Ibuprofen Paracetamol 2,04 8,22 phút Với Trang điều kiện này, tiến hành khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) [11] Tác giả Prasanna Reddy Battu MS Reddy năm 2009 định lượng thành công Paracetamol Ibuprofen phương pháp HPLC dùng cột pha đảo C 18 (5 µm, 150 mm x 4,6 mm), pha động hỗn hợp dung môi ACN dung dịch đệm phosphat (pH = 7,04) tỷ lệ 60: 40 v/v, tốc độ dòng 0,8 ml/phút với đầu đò UV 260 nm Thời gian lưu Ibuprofen, Paracetamol 2,48 4,45 phút Nghiên cứu khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, LOD, LOQ… định lượng Paracetamol, Ibuprofen loại dược phẩm bán thị trường [12] 1.5 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC chữ viết tắt chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography), trước gọi sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp đời năm 1967 – 1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện phương pháp HPLC ngày phát triển đại hóa cao nhờ phát triển nhanh chóng ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay, phương pháp ứng dụng lớn nhiều ngành kiểm nghiệm kiểm nghiệm thuốc Và tại, công cụ đắt lực phép phân tích định tính định lượng loại dược phẩm đa thành phần 1.5.1 Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn hay chất mang biến đổi liên kết hoá học với nhóm chức hữu Q trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) 1.5.2 Nguyên tắc trình sắc ký Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký lọai sắc ký Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ Nếu pha tĩnh chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh gel ta có sắc ký gel hay rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích khỏi cột, cần có pha động Như nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C… vào cột phân tích, kết Trang chất A, B, C… tách khỏi sau qua cột Quyết định hiệu tách sắc ký tổng hợp tương tác Chất phân tích A +B+C F1 Pha tĩnh F2 F3 Pha động Hình 1.1 Sơ đồ thể ảnh hưởng lực rửa giải Tổng tương tác định chất rửa giải khỏi cột trước tiên lực lưu giữ cột nhỏ (F ) ngược lại Đối với chất, lưu giữ quy định ba lực F , F , F Trong F F giữ vai trò định, F yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở F lực giữ chất phân tích cột, F lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột Như với chất khác F F khác Kết chất khác di chuyển cột với tốc độ khác tách khỏi khỏi cột hình 1.2 Hình 1.2 Quá trình rửa giải tách peak chất A chất B 1.5.3 Phân loại sắc ký hấp phụ Quá trình sắc ký dựa hấp phụ mạnh yếu khác pha tĩnh chất tan rửa giải (phản hấp phụ) pha động để kéo chất tan khỏi cột Sự tách hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học chất hấp phụ Trong loại có hai kiểu hấp phụ: + Sắc ký hấp phụ pha thường (NP): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực Trang Loại sắc ký áp dụng rộng rãi, thành công để tách hỗn hợp chất có tính chất gần tương tự thuộc loại khơng phân cực, phân cực yếu hay trung bình vitamin, thuốc hạ nhiệt, giảm đau … Chủ yếu sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP) Trong dược điển Mỹ USP (United State Pharmacy) tra cứu cột có giá trị tương ứng sau: L : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m L7: RP Kích thước hạt tương ứng từ – 10 m L3: Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m Và số loại cột khác cột Diol –Si-(CH ) -O-CH -CH(OH)-CH OH, cột aminopropyl –Si-(CH ) - NH , cột cyanopropyl –Si(CH ) -(CH ) - CN… 1.5.4 Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ mV trB trA t’rA t’rB to Chất A Chất B thời gian t : thời gian lưu chết t rA : thời gian lưu chất A t rB : thời gian lưu chất B t’ rA : thời gian lưu thực chất A t’ rB : thời gian lưu thực chất B Hình 1.3 Sắc ký đồ chất A chất B 1.5.4.1 Thời gian lưu thực t’R Thời gian lưu chất thời gian tính từ bơm mẫu vào cột chất khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu chất định chất Trang khác thời gian lưu khác điều kiện sắc ký chọn Vì thời gian lưu đại lượng để phát định tính chất Thời gian lưu phụ thuộc vào yếu tố: + Bản chất sắc ký pha tĩnh + Bản chất, thành phần, tốc độ pha động + Cấu tạo chất phân tử chất tan + Trong số trường hợp thời gian lưu phụ thuộc vào pH pha động Trong phép phân tích t R ’ nhỏ tách kém, cịn t R ’ q lớn peak bị dỗng độ lặp lại peak kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác hao tốn dung mơi, hố chất, độ xác phép phân tích Để thay đổi thời gian lưu dựa vào yếu tố trình bày 1.5.4.2 Hệ số dung lượng K’ Hệ số dung lượng chất cho biết khả phân bố chất hai pha động với sức chứa cột tức tỷ số lượng chất tan pha tĩnh lượng chất tan pha động thời điểm cân K'= t R − t0 t0 (1.1) Nếu K’ nhỏ t R nhỏ tách Nếu K’ lớn peak bị dỗng Trong thực tế K’ từ - tối ưu 1.5.4.3 Độ chọn lọc α Độ chọn lọc cho biết hiệu tách hệ thống sắc ký, hai chất A B có K’ A K’ B khác có khả tách, mức độ tách biểu thị độ chọn lọc α= với K B' K A' (với K’ B > K’ A ) khác khả tách rõ ràng (1.2) Hình 1.4 Ảnh hưởng độ chọn lọc đến hiệu tách peak hai chất A B Trang 10 1.5.4.4 Số đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết đại lượng biểu thị hiệu cột điều kiện sắc ký định Mỗi đĩa lý thuyết cột săc ký giống lớp pha tĩnh có chiều cao H Tất nhiên lớp có tính chất động tức khu vực hệ phân tách mà cân nhiệt động học thiết lập nồng độ trung bình chất tan pha tĩnh pha động Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố: + Đường kính độ hấp phụ hạt pha tĩnh + Tốc độ độ nhớt (độ phân cực) pha động + Hệ số khuếch tán chất cột Vì với điều kiện sắc ký xác định chiều cao H định chất phân tích số đĩa lý thuyết cột xác định Số đĩa lý thuyết tính theo cơng thức sau:  t N = 5,54 R  Wo , Trong đó,     (1.3) t R thời gian lưu chất phân tích W 0,5 độ rộng ½ peak Trong thực tế N nằm khoảng 2500 đến 5500 vừa đủ 1.5.4.5 Độ phân giải Độ phân giải đại lượng biểu thị độ tách chất khỏi điều kiện sắc ký cho Độ phân giải hai peak cạnh phải tính theo cơng thức sau: ' ' t rB − t rA R=2 WB + W A (1.4) Trong thực tế peak cân đối độ phân giải tối thiểu để hai peak tách R = 1,0 Trong phép định lượng R = 1,5 phù hợp + Nếu R nhỏ peak chưa tách hẳn, việc tính tốn diện tích peak khơng xác, lúc phải tìm cách tăng R theo ba cách sau: * Làm thay đổi K’ cách thay đổi lực rửa giải pha động (thay đổi độ phân cực RP - HPLC, thay đổi cường độ ion IE – HPLC …) * Làm tăng số đĩa lý thuyết cột cách dùng cột dài cột có kích thước nhỏ Trang 11 * Làm tăng độ chọn lọc cách dùng cột khác phù hợp với trình tách thay đổi thành phần pha động + Nếu R lớn thời gian phân tích lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy Để khắc phục ta thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient dung mơi Tuy nhiên q trình chạy sắc ký dùng chương trình dung mơi số pha động có tỷ lệ thay đổi kéo theo thay đổi đường làm ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu diện tích peak ta phân tích Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung mơi mà chủ yếu phải tìm hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng yêu cầu trình phân tích 1.5.4.6 Hệ số khơng đối xứng Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng peak sắc ký đồ thu T tính tỷ số độ rộng hai nửa peak điểm 1/10 chiều cao peak: T= a b (1.5) a b Hình 1.5 Cách tích hệ số khơng đối xứng peak Peak dạng đối xứng hình Gauss thực tế khó đạt phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T * Khi T 2,5 phép định lượng chấp nhận * Khi T > 2,5 điểm cuối peak khó xác định, phép định lượng cần phải thay đổi điều kiện sắc ký để làm cho peak cân đối theo cách sau: + Làm giảm thể tích chết tức đoạn nối từ cột đến detector + Thay đổi thành phần pha động cho khả rửa giải tăng lên + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu Trang 12 1.5.5 Hệ thống HPLC (5) (3) (2) (4) (1) injector (8) (7) (6) Hình 1.6 Các thiết bị hệ thống HPLC Trong đó: - Bình chứa dung mơi pha động - Bộ phận khử khí - Bơm cao áp - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm syringe hay auto sampler) - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngồi mơi trường hay có thiết bị điều nhiệt - Đầu dị detector (nhận tín hiệu) - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu điều khiển toàn hệ thống – Thiết bị in liệu 1.5.5.1 Bình đựng dung mơi Hiện máy HPLC thường có đường dung mơi vào đầu bơm cao áp, cho phép sử dụng bình chứa dung môi lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn tổng tỷ lệ dung môi đường 100% Tuy nhiên theo kinh nghiệm sử dụng đường dung mơi lúc mà sử dụng tối đa đường hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản để trình rửa giải ổn định Hiện đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradient dung môi theo thời gian công tác xây dựng tiêu chuẩn Trang 13 Lưu ý: Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung mơi tinh khiết có ghi rõ nhãn dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích Tất hóa chất dùng để pha mẫu pha hệ đệm phải sử dụng hóa chất tinh khiết phân tích phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo peak tạp trình phân tích 1.5.5.2 Bộ phận khử khí Mục đích khử khí nhằm loại trừ bọt nhỏ cịn sót lại dung mơi pha động Nếu q trình phân tích mà dung mơi pha động cịn sót bọt khí số tượng sau sảy ra: - Tỷ lệ pha động đường dung môi lấy không làm cho thời gian lưu peak thay đổi - Trong trường hợp bọt q nhiều, khử khí khơng thể loại trừ hết Pump khơng hút dung mơi (bị e) áp suất khơng lên máy sắc ký ngừng hoạt động Trong trường hợp nêu cho kết phân tích sai 1.5.5.3 Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Bơm phải tạo áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI 250 - 500 atm (1atm = 0,98 bar) bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút Hiện có nhiều loại pump có áp suất cao lên đến 1200 bar Máy sắc ký lỏng thường có áp suất tối đa 412 bar Tốc độ dòng 0,1- 9,999 ml/phút Tốc độ bơm định theo thông số cài đặt Hiện bơm có pistone để thay phiên đẩy dung môi liên tục 1.5.5.4 Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp khơng ngừng dịng chảy Với dung tích loop – 100 l Có cách lấy mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công (tiêm syringe) tiêm mẫu tự động (auto sampler) Trang 14 1.5.5.5 Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh coi trái tim hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ = - 10 m Ngồi cịn có số trường hợp đặc biệt kích thước kích cỡ hạt … Với chất nhồi cột cỡ = 1,8 - m dùng cột ngắn - 10 cm nhỏ (đường kính - 4,6 mm) loại cột có hiệu tách cao Chất nhồi cột tùy theo lọai cột kiểu sắc ký (trong dược điển USP 23, 24 có tiêu chuẩn hóa lọai cột) Thơng thường chất nhồi cột silicagel (pha thường) silicagel Silan hóa bao lớp mỏng hữu (pha đảo), ngồi người ta cịn dùng loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion * Đối với số phương pháp phân tích địi hỏi phải có nhiệt độ cao thấp nhiệt độ phịng cột đặt thiết bị điều nhiệt Lưu ý: tuyệt đối khơng đánh siêu âm làm hư cột 1.5.5.6 Đầu dò Đầu dò (hay gọi detector) phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp phải thoả mãn điều kiện vùng nồng độ định chất phân tích A = k.C Trong đó: (1.6) A tín hiệu đo C Nồng độ chất phân tích k số thực nghiệm detector chọn Tín hiệu là: độ hấp thụ quang; cường độ phát xạ; cường độ điện thế; độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết suất … Trên sở người ta chế tạo lọai detector sau: + Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/Vis): từ 190 đến 900 nm + Detector huỳnh quang để phát chất hữu phát huỳnh quang tự nhiên dẫn chất có huỳnh quang Đây loại detector có độ chọn lọc cao Trang 15 + Loại đại có detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) detector có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thu cực đại chất Ngồi cịn có số loại detector khác là: + Detector điện hóa: đo dịng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng… + Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ + Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt 1.5.5.7 Bộ phận ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát detector truyền sang + Trong máy hệ cũ sử dụng máy ghi đơn giản vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích peak, chiều cao… + Các máy hệ dùng phần mềm chạy máy tính lưu tất thông số, phổ đồ thông số peak tính đối xứng, hệ số phân giải q trình phân tích đồng thời xử lý, tính tốn thơng số theo u cầu người sử dụng như: nồng độ, RSD… 1.5.5.8 Thiết bị in liệu Sau phân tích xong mẫu ta in kết phần mềm tính tốn giấy để hồn thiện hồ sơ 1.5.6 Phương pháp chọn điều kiện sắc ký Muốn có kết tốt ta phải tìm điều kiện sắc ký tốt cho hỗn hợp mẫu, điều kiện bao gồm: Pha tĩnh: - Loại pha tĩnh - Kích thước cột Pha động: - Thành phần tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ… chương trình rửa giải isocratic -Thành phần tỷ lệ, pH, tốc độ dịng, nhiệt độ chương trình dung mơi… chương trình rửa giải gradient 1.5.6.1 Lựa chọn pha tĩnh Dựa vào tài liệu, dược điển, thành phần tính chất chất có mẫu phân tích; ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp cột pha thường, cột pha đảo hay loại cột khác nhau… Trang 16 Thông thường ngành ta dùng loại cột pha thường (NP) cột pha đảo (RP) Ngồi ta dùng số loại cột khác cột cyanopropyl, cột aminopropyl, cột diol Cột pha thường (NP): silicagel trung tính Pha tĩnh: loại cột dùng để tách chất khơng phân cực hay phân cực Trên bề mặt hoạt động có chứa nhóm – OH phân cực ưa nước Pha động : dùng cho loại dung mơi khơng phân cực hay phân cực như: methanol, benzen, acetonitril, chlorofom … Cột pha đảo (RP): silicagel alkyl hóa Pha tĩnh: loại cột dùng để tách chất khơng phân cực, phân cực, chất phân cực tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động nhóm – OH bị alkyl hóa tức thay nguyên tử H mạch carbon thẳng (C hay C 18 tương đương RP-8 hay RP-18) hay mạch carbon vịng (phenyl- tương đương cột phenyl) Vì phân cực hay phân cực Pha động : Pha động dùng loại dung môi có phân cực như: methanol, acetonitril, nước hay loại dung dịch đệm, hỗn hợp dung môi - đệm Sự tách chất nhồi loại cột có độ lặp lại cao ứng dụng chủ yếu phân tích dược phẩm Hiện sử dụng loại chủ yếu Hiện pha tĩnh silicagel có hàng trăm chất khác tùy thuộc vào nhóm nguyên tử H, ngồi cịn có lọai pha tĩnh oxid nhôm, chất hữu cao phân tử, mạch carbon … 1.5.6.2 Lựa chọn pha động Dựa vào tài liệu, dược điển, thành phần tính chất chất có mẫu phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp q trình rửa giải tách hồn tồn chất có mẫu đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn peak trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm dung mơi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu hoạt động thiết bị Pha động làm thay đổi: + Độ chọn lọc α + Thời gian lưu + Hiệu tách cột + Độ phân giải + Tính đối xứng peak Trang 17 Do đó, pha tĩnh chọn ta chọn pha động có thành phần phù hợp ta có hiệu suất tách sắc ký tốt hỗn hợp chất cần phân tích Chính pha động cần có cầu yêu cầu sau: + Pha động phải trơ với pha tĩnh Không làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5) + Pha động phải hịa tan chất phân tích rửa giải chúng đặc biệt phải ý thay đổi pha động phải rửa cột dung môi phù hợp để không làm tủa chất có cột, hay pha động có sẵn cột Ví dụ: đệm phosphat rửa ACN hay MeOH bị kết tủa cột + Pha động phải bền vững theo thời gian: bền lâu tốt pha động khơng bị phân hủy suốt thời gia phân tích mẫu + Phải có độ tinh khiết cao: dung mơi cho HPLC, hố chất tinh khiết phân tích + Phải nhanh đạt cân trình sắc ký + Phải phù hợp với loại detector: detector UV/Vis dung mơi khơng hấp thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ bước sóng thấp < 220 nm) Detector huỳnh quang dung môi không phát quang + Phải kinh tế, không đắt Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC), pha động dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu vài amin hay aminoacid … + Ngoài dung mơi thành phần pha động nhiều trường hợp tách RP- HPLC cịn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo rửa giải tốt + Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E dung môi theo bảng sau: Bảng 1.1 Lực rửa giải số dung môi Dung môi Lực rửa giải E n-Hexan 0,1 Tetra chloro carbon 1,6 Toluen 2,4 Methanol 5,11 Acetonitril 5,8 Nước cất H O 10,20 Trang 18