Xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin và 2,3,5,4’ tetrahydroxystilben 2 o β d glucoside trong hà thủ ô đỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC -o0o - MÀO TƯỜNG VY XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ 2,3,5,4’-TETRAHYDROXYSTILBEN-2-O-β-D-GLUCOSIDE TRONG HÀ THỦ Ô ĐỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP BỘ PHẬN PHÁT HIỆN ĐA SÓNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC MÀO TƯỜNG VY XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ 2,3,5,4’-TETRAHYDROXYSTILBEN-2-O-β-D-GLUCOSIDE TRONG HÀ THỦ Ô ĐỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP BỘ PHẬN PHÁT HIỆN ĐA SÓNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: ThS BÙI THỊ THƯƠNG TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp khóa luận hồn thành tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS Bùi Thị Thương – Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận TS Nguyễn Thị Thanh Bình – Chủ nhiệm Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội dạy tơi nhiều kiến thức bổ ích đưa lời nhận xét, góp ý giúp tơi hồn thiện khóa luận Tôi xin cảm ơn thầy cô Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng ban Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội toàn thể thầy giáo Trường kiến thức dạy suốt năm học tập, sinh hoạt rèn luyện Trường Tôi xin cảm ơn Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số CS.20.03) Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè, người ln bên cạnh động viên, khích lệ giúp đỡ sống học tập để tơi thực hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Mào Tường Vy DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril DAD Bộ phận phát đa sóng (Diode Array Detector) DĐHK Dược điển Hồng Kông DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam EM Emodin EtOH Ethanol HDL Lipoprotein tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HTOĐ Hà thủ ô đỏ ICH LDL Hội nghị quốc tế hài hòa thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MeOH Methanol MPP+ 1-methyl-4-phenylpyridinium PE Polyetylen RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) TC Cholesterol toàn phần (Total cholesterol) TG Triglycerid THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside UV-VIS Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet-Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các nghiên cứu định lượng EM THSG phương pháp HPLC Bảng Thông tin mẫu Hà thủ ô đỏ sử dụng nghiên cứu 12 Bảng Chương trình gradient pha động ACN : H2O 20 Bảng Thông số pic EM dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 254 nm 21 Bảng 3 Thông số pic THSG dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 320 nm 22 Bảng Chương trình gradient pha động ACN : H2O 23 Bảng Thông số pic EM dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 290 nm 23 Bảng Thông số pic THSG dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 322 nm 24 Bảng Thông số pic dung dịch chuẩn hỗn hợp EM 50 µg/ml THSG 50 µg/ml điều kiện sắc ký tối ưu 26 Bảng Thông số pic mẫu thử điều kiện sắc ký tối ưu 27 Bảng Thông số pic mẫu thử thêm chuẩn điều kiện sắc ký tối ưu 28 Bảng 10 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic EM 29 Bảng 11 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic THSG 30 Bảng 12 Kết xác định tỷ lệ phục hồi EM 34 Bảng 13 Kết xác định tỷ lệ phục hồi THSG 34 Bảng 14 Kết xác định độ lặp lại phương pháp EM 35 Bảng 15 Kết xác định độ lặp lại phương pháp THSG 35 Bảng 16 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp EM 36 Bảng 17 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp THSG 37 Bảng 18 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết 38 Bảng 19 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết 39 Bảng 20 Kết khảo sát ảnh hưởng số lần chiết 40 Bảng 21 Kết định lượng EM THSG mẫu Hà thủ ô đỏ 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Cây Hà thủ ô đỏ hoa (A) Các dạng củ lát cắt Hà thủ ô đỏ (B) Hình Cơng thức cấu tạo EM THSG Hình Sắc ký đồ dung dịch EM chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 254 nm 20 Hình Phổ hấp thụ UV-VIS pic EM dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml 21 Hình 3 Sắc ký đồ dung dịch THSG chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 320 nm 21 Hình Phổ hấp thụ UV-VIS pic THSG dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml 22 Hình Sắc ký đồ dung dịch EM chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 290 nm 23 Hình Sắc ký đồ dung dịch THSG chuẩn nồng độ 100 µg/ml bước sóng phát 322 nm 24 Hình Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp EM 50 µg/ml THSG 50 µg/ml bước sóng phát 290 nm (A) 322 nm (B) 25 Hình Sắc ký đồ mẫu trắng bước sóng phát 290 nm (C) 322 nm (D) 26 Hình Sắc ký đồ mẫu thử bước sóng phát 290 nm (E) 322 nm (F) 27 Hình 10 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn bước sóng phát 290 nm (G) 322 nm (H) 28 Hình 11 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic EM 30 Hình 12 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic THSG 31 Hình 13 Sắc ký đồ EM LOD (S/N=2,6) 32 Hình 14 Sắc ký đồ EM LOQ (S/N=10,2) 32 Hình 15 Sắc ký đồ THSG LOD (S/N=2,8) 33 Hình 16 Sắc ký đồ THSG LOQ (S/N=9,7) 33 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố phận dùng 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Công dụng tác dụng sinh học 1.4 Độc tính 1.5 Các phương pháp định lượng EM THSG Hà thủ ô đỏ 1.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép phận phát đa sóng 10 CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Hóa chất 12 2.3 Thiết bị, dụng cụ 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 13 2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 14 2.4.3 Thẩm định quy trình định lượng 15 2.4.3.1 Thẩm định tính đặc hiệu 15 2.4.3.2 Thẩm định tính tuyến tính xác định miền giá trị 16 2.4.3.3 Xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 16 2.4.3.4 Thẩm định độ 16 2.4.3.5 Thẩm định độ xác 16 2.4.3.6 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 17 2.4.4 Định lượng EM THSG số mẫu Hà thủ ô đỏ 19 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 20 3.1.1 Xác định bước sóng phát 20 3.1.2 Xác định chương trình rửa giải 22 3.2 Thẩm định quy trình định lượng 25 3.2.1 Thẩm định tính đặc hiệu 25 3.2.2 Thẩm định tính tuyến tính xác định miền giá trị 29 3.2.3 Xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 31 3.2.4 Thẩm định độ 33 3.2.5 Thẩm định độ xác 34 3.2.6 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 37 3.3 Định lượng EM THSG số mẫu Hà thủ ô đỏ 41 3.4 Bàn luận 43 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU Hà thủ đỏ (HTOĐ) có tên khoa học Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, phân bố rộng rãi giới, tập trung nhiều nước Châu Á Trung Quốc, Nhật Bản Ở Việt Nam, HTOĐ sử dụng làm thuốc chữa bệnh y học cổ truyền với tác dụng bổ huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng, làm đen râu tóc, kéo dài tuổi thọ, [2] Xét thành phần hóa học, emodin (EM) 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben2-O-β-D-glucoside (THSG) xác định chất đánh dấu hóa học HTOĐ Dược điển Trung Quốc (DĐTQ) (2015) [10], Dược điển Hồng Kông (DĐHK) (2008) [9],… nhiều công bố quốc tế [12,15,27] Hai hoạt chất có nhiều tác dụng dược lý chứng minh tác dụng bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa, chống lão hóa, chống viêm, chống tăng lipid máu, điều hòa miễn dịch [12,19] Tại Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng HTOĐ dừng mức đạt theo chuyên luận Dược điển Việt Nam (DĐVN) V với quy định hàm lượng chất chiết ethanol (EtOH) 30% hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo EM physcion (PS)) [2] Do đó, nhiều hoạt chất có HTOĐ chưa đánh giá dẫn đến chất lượng chưa đảm bảo Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng số thành phần hóa học có HTOĐ cần thiết, giúp cho công tác kiểm soát chất lượng dược liệu Việt Nam chặt chẽ Trên sở đó, đề tài tiến hành với hai mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM THSG HTOĐ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép phận phát đa sóng Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng EM THSG số mẫu HTOĐ thị trường CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố phận dùng HTOĐ có tên khoa học Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, hay Polygonum multiflorum (Thunb.), thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), Cẩm chướng (Caryophyllales) Ngoài ra, dược liệu cịn có tên gọi khác như: Dạ giao đằng, Dạ hợp, Địa tinh,… [1,3] Cây HTOĐ loại dây leo thân quấn, sống lâu năm Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào Mặt ngồi thân có màu xanh tía có vân bì khổng lồ, mặt thân nhẵn, khơng có lơng Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ ngun có hình giống củ khoai lang Lá mọc so le, có cuống dài Phiến hình tim hẹp dài 4-8 cm, rộng 3-4 cm, đầu nhọn, phía cuống hình tim hình mũi tên, mép nguyên lượn sóng, hai mặt nhẵn khơng có lơng [1,3] Cụm hoa mọc kẽ đầu cành thành chùy phân nhánh, hoa nhỏ nhiều, đường kính mm, có cuống ngắn 1-3 mm Cánh hoa màu trắng Nhị với nhị dài Bầu hình cạnh, vịi ngắn gồm rời nhau, nuốm hình mào gà, rủ xuống Quả hình cạnh, nhẵn bóng, nằm bao hoa mà mảnh phát triển thành cánh rộng Mùa hoa tháng 9-11; mùa tháng 12-2 hàng năm [1,3] Ở Việt Nam, HTOĐ mọc hoang rừng núi, nhiều tỉnh phía Tây Bắc Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La sau đến tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hịa Bình… HTOĐ loại ưa khí hậu ẩm mát vùng cận nhiệt đới nhiệt đới núi cao, ưa sáng chịu bóng Nơi mọc tự nhiên thích hợp quần thể rừng núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm 20oC Ngồi cịn mọc nước khác Trung Quốc (Giang Tô, Quảng Đông, Tứ Xuyên, Hồ Bắc), Nhật Bản, Ấn Độ [1,3] Bộ phận dùng phần rễ củ phơi hay sấy khô HTOĐ Thu hoạch thường tiến hành vào mùa thu mùa xuân Đào rửa đất, bổ đơi hay bổ tư, đồ phơi khơ, có nơi khơng đồ mà phơi ngay, muốn có hà thủ miếng hái cịn tươi, đem thái ngay, đồ chín phơi đồ chín thái phơi [3] 3,72 3,69 3,73 0,05 1,37 3,79 Giá trị RSD thí nghiệm thẩm định độ lặp lại EM nhỏ 1,74%; THSG nhỏ 1,37% Bảng 16 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp EM STT Nồng độ dung dịch (µg/ml) 200 50 Ngày Diện tích pic (mAU.min) 123,48 122,79 122,13 32,02 31,46 31,83 1,73 1,68 1,75 36 Diện tích pic trung bình (mAU.min) SD 122,80 0,68 0,55 31,77 0,28 0,90 1,72 0,04 2,10 RSD (%) Bảng 17 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp THSG STT Nồng độ dung dịch (µg/ml) 200 100 Diện tích pic Ngày (mAU.min) 82,54 81,29 82,07 41,87 40,91 41,16 3,52 3,44 3,38 Diện tích pic trung bình (mAU.min) SD 81,97 0,63 0,77 41,31 0,50 1,21 3,45 0,07 2,04 RSD (%) Giá trị RSD thí nghiệm thẩm định độ xác trung gian EM nhỏ 2,10%; THSG nhỏ 2,04% 3.2.6 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu a) Khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết Tiến hành khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết theo theo phương pháp mô tả mục 2.4.3.6 Kết trình bày bảng 3.18 37 Bảng 18 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết Khối Độ lượng Mẫu/Dung ẩm mơi chiết cân (%) (mg) Diện tích pic sắc ký (mAu.min) EM EtOH 30% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 90% Nồng độ dung dịch định lượng THSG Hàm lượng (%) Hàm lượng EM EM THSG 0,007 0,837 ± ± 0,001 0,04 0,016 0,882 ± ± 0,001 0,01 0,014 0,744 ± ± 0,001 0,02 0,017 0,423 ± ± 0,002 0,05 X ± SD (%) (µg/ml) EM THSG THSG 500,9 0,935 32,375 0,585 78,381 0,006 0,869 10,1 500,5 0,946 29,406 0,603 71.086 0,007 0,789 500,5 0,990 31,774 0,674 76,904 0,007 0,853 500,4 1,428 32,711 1,388 79,207 0,015 0,879 10,1 500,4 1,467 32,547 1,451 78,804 0,016 0,874 500,6 1,454 33,195 1,430 80,396 0,016 0,892 500,4 1,404 27,263 1,349 65,820 0,015 0,730 10,1 500,3 1,369 27,337 1,292 66,001 0,014 0,733 500,3 1,357 28,719 1,273 69,399 0,014 0,770 500,3 1,644 18,267 1,740 43,717 0,019 0,485 10,1 500,4 1,508 15,205 1,517 36,194 0,017 0,402 500,3 1,474 14,480 1,463 34,412 0,016 0,382 38 Kết từ Bảng 3.18 cho thấy: Mẫu dược liệu chiết dung môi EtOH 50% cho hàm lượng EM THSG cao (0,016 ± 0,001 0,882 ± 0,01) Vì vậy, EtOH 50% lựa chọn dung môi chiết nghiên cứu b) Nhiệt độ chiết Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết theo theo phương pháp mô tả mục 2.4.3.6 Kết trình bày bảng 3.19 Bảng 19 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết Nhiệt độ chiết Khối Độ lượng ẩm cân (%) (mg) Diện tích pic sắc ký (mAu.min) EM 50oC 70oC 80oC Nồng độ dung dịch định lượng THSG Hàm lượng (%) (µg/ml) EM THSG EM THSG 500,7 1,435 30,973 1,399 74,936 0,015 0,831 10,1 500,7 1,389 32,289 1,324 78,170 0,015 0,867 500,4 1,310 29,875 1,196 72,239 0,013 0,802 500,4 1,428 32,711 1,388 79,207 0,015 0,879 10,1 500,4 1,467 32,547 1,451 78,804 0,016 0,874 500,6 1,454 33,195 1,430 80,396 0,016 0,892 500,5 1,399 30,390 1,340 73,504 0,015 0,815 10,1 500,8 1,399 30,752 1,340 74,393 0,015 0,825 500,4 1,387 28,393 1,321 68,597 0,015 0,761 39 Hàm lượng trung bình X ± SD (%) EM THSG 0,014 0,833 ± ± 0,001 0,03 0,016 0,882 ± ± 0,001 0,01 0,801 0,015 ± 0,03 90oC 500,2 1,291 32,970 1,165 79,843 0,013 0,886 10,1 500,8 1,272 27,470 1,134 66,329 0,012 0,735 500,4 1,423 29,400 1,380 71,071 0,015 0,789 0,013 0,803 ± ± 0,001 0,08 Kết từ Bảng 3.19 cho thấy: Mẫu dược liệu chiết nhiệt độ 70oC cho hàm lượng EM THSG cao (0,016 ± 0,001 0,882 ± 0,01) Vì vậy, 70oC lựa chọn nhiệt độ chiết nghiên cứu c) Số lần chiết Tiến hành khảo sát ảnh hưởng số lần chiết theo theo phương pháp mô tả mục 2.4.3.6 Kết trình bày bảng 3.20 Bảng 20 Kết khảo sát ảnh hưởng số lần chiết Số lần chiết Khối Độ lượng ẩm cân (%) (mg) Diện tích pic sắc ký (mAu.min) EM lần lần Nồng độ dung dịch định lượng THSG Hàm lượng (%) (µg/ml) EM THSG EM X ± SD (%) THSG EM THSG 0,013 0,772 ± ± 0,001 0,05 0,014 0,791 ± ± 0,002 0,06 500,5 1,379 31,016 1,308 75,042 0,014 0,833 10,1 500,4 1,270 27,565 1,130 66,563 0,012 0,739 500,4 1,248 27,752 1,095 67,022 0,012 0,744 500,5 1,435 32,037 1,399 77,551 0,015 0,860 10,1 500,4 1,270 28,176 1,130 68,064 0,012 0,755 500,4 1,289 28,252 1,161 68,251 0,013 0,757 40 Hàm lượng trung bình lần 500,5 1,435 32,063 1,399 77,614 0,015 0,861 10,1 500,4 1,270 28,176 1,130 68,064 0,012 0,755 500,4 1,289 28,252 1,161 68,251 0,013 0,757 0,014 0,791 ± ± 0,002 0,06 Kết từ Bảng 3.20 cho thấy: Hàm lượng EM THSG mẫu dược liệu chiết lần so với chiết 2, lần không khác biệt đáng kể Vì vậy, lựa chọn chiết lần để đơn giản trình xử lý mẫu tiết kiệm thời gian, dung môi Từ kết khảo sát xác định quy trình xử lý mẫu dược liệu sau: Cân xác 0,5 g mẫu thử cho vào bình cầu cổ nhám dung tích 100 ml, thêm 50,00 ml dung môi EtOH 50% (tt/tt), thấm ẩm dược liệu 10 phút, cân ghi lại khối lượng (m1) Tiến hành chiết hồi lưu 70oC Để bình nguội nhiệt độ phịng bổ sung EtOH 50% đến khối lượng ban đầu Lọc qua màng celulose acetat tái sinh 0,45 µm (Minisart RC, Sartorius, Đức) thu dung dịch để sắc ký 3.3 Định lượng EM THSG số mẫu Hà thủ ô đỏ Tiến hành theo phương pháp mô tả mục 2.4.4 lô HTOĐ khác Kết trình bày Bảng 3.21 Bảng 21 Kết định lượng EM THSG mẫu Hà thủ ô đỏ Mẫu HTOĐ.M1 Độ ẩm (%) Khối lượng cân (mg) Diện tích pic sắc ký Nồng độ dung dịch định lượng (mAu.min) EM THSG 500,0 3,74 500,1 3,49 Hàm lượng (%) (µg/ml) EM THSG EM Hàm lượng trung bình X ± SD (%) THSG EM THSG 103,57 5,153 253,307 0,057 2,711 0,055 2,729 102,63 4,745 250,998 0,052 2,778 ± ± 9,8 41 500,0 3,67 103,12 5,039 252,202 0,055 2,699 0,002 0,016 500,4 1,428 32,711 1,388 79,207 0,015 0,879 500,4 1,467 32,547 1,451 78,804 0,016 0,874 500,6 1,454 33,195 1,430 80,396 0,016 0,892 500,1 0,92 19,26 0,560 46,157 0,006 0,494 500,0 0,94 20,12 0,593 48,271 0,006 0,517 500,1 0,93 19,87 0,577 47,656 0,006 0,510 500,1 2,444 30,011 3,042 72,573 0,033 0,801 500,5 2,482 30,890 3,104 74,732 0,034 0,824 500,1 2,305 29,570 2,816 71,489 0,031 0,789 500,1 2,371 20,855 2,923 50,076 0,032 0,559 HTOĐ.M5 10,52 500,4 2,564 22,640 3,238 54,462 0,036 0,607 500,2 2,402 21,630 2,974 51,981 0,033 0,580 HTOĐ.M2 HTOĐ.M3 HTOĐ.M4 10,1 6,7 9,58 0,04 0,882 ± ± 0,01 0,001 0,006 0,507 ± 0,01 0,033 0,805 ± ± 0,002 0,02 0,034 0,582 ± ± 0,002 0,02 Kết bảng 3.21 cho thấy: − Hàm lượng EM mẫu HTOĐ nghiên cứu nằm khoảng từ 0,006% đến 0,055% − Hàm lượng THSG mẫu HTOĐ nghiên cứu nằm khoảng từ 0,507% đến 2,729% 42 3.4 Bàn luận Về xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM THSG phương pháp HPLC – DAD DĐTQ (2015) [10], DĐHK (2008) [9] xác định EM THSG chất đánh dấu cho dược liệu Tuy nhiên, hai Dược điển chưa xây dựng phương pháp định lượng đồng thời EM THSG Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi hướng đến xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM THSG có thời gian phân tích không dài, đảm bảo độ đặc hiệu, độ đúng, độ xác HPLC phương pháp phổ biến, áp dụng nhiều phân tích đánh giá chất lượng dược liệu nói chung, dược liệu HTOĐ nói riêng Rất nhiều nghiên cứu giới áp dụng phương pháp xây dựng phương pháp định tính, định lượng đánh giá chất lượng dược liệu HTOĐ Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả tách phát chất phân tích HPLC loại cột sử dụng, chương trình dung mơi detector Cột tách có vai trị quan trọng phép tách sắc ký, định hiệu tách trình EM THSG chất phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có chất phân cực giống chất phân tích Vì vậy, điều kiện có phịng thí nghiệm, sử dụng cột silica gel pha đảo Eclipse XDB - C18 (4,6 x 250mm, 5µm) để tách THSG, EM định lượng chúng Đây loại pha tĩnh sử dụng phổ biến phòng kiểm nghiệm dược liệu nên dễ dàng áp dụng thực tế Chương trình sắc ký xây dựng dựa tham khảo tài liệu điều kiện thực tế phòng thí nghiệm Thành phần pha động điều chỉnh để đảm bảo thời gian lưu EM THSG không dài, khả tách EM THSG, pic thu có tính đối xứng Pha động hỗn hợp H2O : ACN, dung môi dễ kiếm nên dễ dàng áp dụng thực tế Khảo sát phổ hấp thụ UV-VIS chất cần phân tích nhằm xác định bước sóng phát tối ưu 43 Trong nghiên cứu này, đầu dò DAD sử dụng có khả quét phổ hấp thụ, ứng dụng kiểm tra độ tinh khiết pic sắc ký Như vậy, xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM THSG phương pháp HPLC-DAD Pha tĩnh sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (4,6 x 250mm, 5µm), pha động hỗn hợp H2O : ACN, tốc độ dịng ml/phút Mẫu tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký 45 phút, bước sóng phát 290 nm (EM) 322 nm (THSG) Phương pháp thẩm định theo tiêu chí ICH [25] đáp ứng tiêu chí độ đặc hiệu, độ tuyến tính miền giá trị, giới hạn phát giới hạn định lượng, độ đúng, độ xác Về phương pháp xử lý mẫu dược liệu Xử lý mẫu bước đóng vai trị quan trọng phân tích định lượng giúp loại bỏ tạp chất chiết lấy hoạt chất khỏi dược liệu Để q trình phân tích nhanh đạt kết xác, q trình xử lý mẫu địi hỏi phải tối ưu hóa Nghiên cứu tiến hành khảo sát ba yếu tố quy trình xử lý mẫu tỷ lệ EtOH dung môi chiết, nhiệt độ chiết số lần chiết Phương pháp xử lý mẫu phải đảm bảo chiết tối đa chất cần phân tích khỏi dược liệu, sử dụng dung mơi độc hại, thân thiện với mơi trường, thao tác đơn giản, dễ thực Trước tiên, lựa chọn loại dung môi dùng để chiết Dựa vào tính chất biết stilben anthraquinon tan tốt dung môi hữu EtOH, MeOH, thêm vào đó, cơng thức cấu tạo THSG có chứa gốc đường glucose, lựa chọn hỗn hợp dung môi EtOH/H2O MeOH/H2O chiết THSG khỏi mẫu dược liệu kiệt hơn, hỗn hợp dung môi thường xuyên sử dụng để chiết dược liệu Trong nghiên cứu lựa chọn hỗn hợp dung mơi chiết EtOH/H2O gây độc hại thân thiện với môi trường MeOH 44 Chiết hồi lưu phương pháp ngâm chiết truyền thống sử dụng phổ biến có ưu điểm hiệu suất chiết cao Đối với phương pháp chiết hồi lưu, nhiệt độ chiết yếu tố đóng vai trị định đến hiệu suất chiết Thông thường, nhiệt độ chiết thường chọn nhiệt độ sôi nước, nhiên hợp chất hữu bền, sử dụng nhiệt độ cao dẫn đến biến đổi chất thành chất khác Nhiệt độ sôi EtOH 78,4oC, nước 100oC Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát nhiệt độ chiết hồi lưu khoảng từ 50oC đến 90oC (gần nhiệt độ sôi hỗn hợp dung môi) Bên cạnh nhiệt độ chiết, số lần chiết ảnh hưởng đến hiệu suất trình Về mặt lý thuyết, số lần chiết nhiều lấy chất tan tối đa nhất, nhiên trường hợp hiệu suất chiết tăng thêm không đáng kể tăng số lần chiết gây tốn hóa chất, lượng thời gian Do vậy, cần xác định số lần chiết cho phù hợp Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát số lần chiết lần, lần, lần Về kết định lượng EM THSG số mẫu HTOĐ Ứng dụng phương pháp HPLC-DAD định lượng đồng thời EM THSG xây dựng được, xác định mẫu HTOĐ thị trường, hàm lượng EM nằm khoảng từ 0,006% đến 0,055%, hàm lượng THSG nằm khoảng 0,507% đến 2,729% (tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối) Kết thực nghiệm cho thấy mẫu HTOĐ khác nhau, hàm lượng EM THSG dao động nhiều Hàm lượng EM THSG HTOĐ phụ thuộc vào yếu tố vị trí địa lý, thời gian trồng dược liệu Tham khảo nghiên cứu Nguyễn Thị Hà Ly cộng (2019) cho thấy hàm lượng THSG mẫu HTOĐ trồng thời gian khác (1 năm, năm, năm) khác rõ rệt, đặc biệt vùng có vị trí địa lý khác hẳn nhau, nằm khoảng từ 1,0% đến 4,0% Cũng nghiên cứu cho thấy, hàm lượng EM lớn mẫu HTOĐ xác định nghiên cứu 0,63% [20] Nghiên cứu Liang cộng (2012) cho thấy khác biệt hàm lượng EM THSG 45 mẫu HTOĐ có nguồn gốc từ Hồng Kông Trung Quốc, mẫu trồng thời gian khác Trung Quốc (1 năm, 3-4 năm, 5-6 năm) [15] Như vậy, qua tham khảo tài liệu cho thấy EM THSG hoạt chất có tác dụng dược lý chứng minh tác dụng chống lão hóa, chống viêm, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thần kinh bảo vệ gan [12,19] Đặc biệt, số báo cáo gần độc tính HTOĐ không phụ thuộc vào hàm lượng EM hay hàm lượng THSG mà phụ thuộc vào tỷ lệ tương đối hàm lượng EM hàm lượng THSG [19,28] Do đó, việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM THSG thật cần thiết, góp phần kiểm sốt chất lượng HTOĐ, đảm bảo an toàn mang lại hiệu sử dụng 46 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Nghiên cứu xây dựng thẩm định thành cơng quy trình định lượng đồng thời EM THSG HTOĐ phương pháp HPLC – DAD theo hướng dẫn ICH Các thơng số quy trình xác định sau: Pha tĩnh cột silica gel pha đảo Eclipse XDB - C18 (4,6 x 250mm, 5µm, 120 Å ), pha động hỗn hợp ACN : H2O, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, tốc độ dịng: 1,0 ml/phút, nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng (≈ 27oC), thời gian sắc ký: 45 phút, bước sóng phát hiện: 290 nm EM 322 nm THSG Mẫu dược liệu xay nhỏ đến kích thước cỡ mm, chiết hồi lưu 0,5 g mẫu dược liệu với 50 ml EtOH 50% 70oC Quá trình thực nghiệm chứng minh quy trình định lượng đồng thời EM THSG đạt yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ độ xác Phương pháp ứng dụng để định lượng EM THSG mẫu HTOĐ thị trường Hàm lượng EM dao động nhiều khoảng từ 0,006% đến 0,055%, hàm lượng THSG dao động nhiều khoảng 0,507% đến 2,729% (tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối) 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu mối quan hệ định lượng tác dụng độc tính HTOĐ với hàm lượng tuyệt đối tỷ lệ tương đối EM THSG Trên sở sử dụng EM THSG làm tiêu để kiểm soát chất lượng HTOĐ Phương pháp sở để lựa chọn nguyên liệu cho trình chế biến HTOĐ tiêu chuẩn hóa sản phẩm sau chế biến 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cộng (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập I, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tr 884-887 Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 11801181 Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 833-835 Nguyễn Thị Hà Ly (2019), Nghiên cứu phân tích đánh giá số thành phần hóa học dược liệu sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) Việt Nam, Đại học Quốc Gia Hà Nội Vụ khoa học đào tạo – Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, tr 168-176 Tiếng anh Ahn S M, Kim H N, Kim Y R, Choi Y W, et al (2016), "Emodin from Polygonum multiflorum ameliorates oxidative toxicity in HT22 cells and deficits in photothrombotic ischemia", Journal of Ethnopharmacology, 188 pp 13-20 Chen L, Zhang Y, Jin L, Gao R, et al (2018), "Preparation, characterization and antioxidant activity of polysaccharide from Fallopia multiflora (Thunb.) Harald", International Journal of Biological Macromolecules, 108 pp 259262 Chen Q, Zhang S, Ying H, Dai X, et al (2012), "Chemical characterization and immunostimulatory effects of a polysaccharide from Polygoni Multiflori Radix Praeparata in cyclophosphamide-induced anemic mice", Carbohydrate Polymers, 88 (4), pp 1476-1482 China Chinese Medicine Division - Department of Health - Government of the Hong Kong Special Administrative Region - the People's Republic of (2008), Hong Kong chinese Materia Medica Standards, pp 223-233 10.Commission Chinese Pharmacopoeia (2015), "Pharmacopoiea of the People's Republic of China Part I", Chinese Medical Science Press: Beijing, China, pp 175-177 11.Feng Y, Huang SL, Dou W, et al (2010), "Emodin, a natural product, selectively inhibits 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type and ameliorates metabolic disorder in diet-induced obese mice.", British journal of pharmacology, 161 (1) pp 113-126 12.Huang J, Zhang J P, Bai J Q, Wei M J, et al (2018), "Chemical profiles and metabolite study of raw and processed Polygoni Multiflori Radix in rats by UPLC-LTQ-Orbitrap MS(n) spectrometry", Chinese Journal of Natural Medicines, 16 (5), pp 375- 400 13.Huang X Z, Wang J, Huang C, Chen Y Y, et al (2008), "Emodin enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in prostate cancer cells: the mechanisms involve ROS-mediated suppression of multidrug resistance and hypoxia inducible factor-1", Cancer Biology & Therapy, (3), pp 468-475 14.Li S G, Chen LL, Huang XJ, Zhao BX, et al (2013), "Five new stilbene glycosides from the roots of Polygonum multiflorum", Journal of Asian Natural Products Research, 15 (11), pp 1145-1151 15.Liang Z, Chen H, Yu Z, Zhao Z, et al (2010), "Comparison of raw and processed Radix Polygoni Multiflori (Heshouwu) by high performance liquid chromatography and mass spectrometry", Chin Med, pp 29 16.Liang, Zhitao L, Hubiao Z, et al (2012), "Quality evaluation of various commercial specifications of Polygoni Multiflori Radix and its dregs by determination of active compounds", Chemistry Central journal, (1), pp 5353 17.Lin L, Ni B, Lin H, Zhang M, et al (2015), "Traditional usages, botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb.: a review", Journal of Ethnopharmacology, 159 pp 158-183 18.Liu A, Chen H, Wei W, Ye S, et al (2011), "Antiproliferative and antimetastatic effects of emodin on human pancreatic cancer", Oncology reports, 26 pp 81-89 19.Liu Y, Wang Q, Yang J, Guo X, et al (2018), "Polygonum multiflorum Thunb.: A Review on Chemical Analysis, Processing Mechanism, Quality Evaluation, and Hepatotoxicity", Front Pharmacol, pp 364 20.Nguyen Thi Ha Ly, Ta Thi Thao, Phuong Thien Thuong (2019), "Quality Evaluation of Fallopia multiflora in Vietnam Based on HPLC-FLD and Chemometrics", Journal of Medicinal Materials, vol 24, No.3 21.Nonaka Gen-Ichiro, Miwa Naoko, Nishioka Itsuo (1982), "Stilbene glycoside gallates and proanthocyanidins from Polygonum multiflorum", Phytochemistry, 21 (2), pp 429-432 22.Sun GB, Guo BJ, Li XE, Huang JN, et al (2006), "The effect of anthraquinone glycoside from Polygonum multiflorum Thunb on cellular immunological function in mice", Pharmacol Clin Chin Mater Medica, pp 30-32 23.Tang W, Li S, Liu Y, et al (2017), "Anti-diabetic activities of cis- and trans2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-O-β-Dglucopyranoside from Polygonum multiflorum.", Molecular nutrition & food research, 61 (8) pp 24.Tsai P W, Lee Y H, Chen L G, Lee C J, et al (2018), "In Vitro and In Vivo Anti-Osteoarthritis Effects of 2,3,5,4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-DGlucoside from Polygonum Multiflorum", Molecules, 23 (3), pp 25.Use The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), International conference on harmonization, Geneva, Switzerland, pp 6-13 26.Wang W, He Y, Lin P, Li Y, et al (2014), "In vitro effects of active components of Polygonum multiflorum Radix on enzymes involved in the lipid metabolism", Journal of Ethnopharmacology, 153 (3), pp 763-770 27.Wu X, Chen X, Huang Q, Fang D, et al (2012), "Toxicity of raw and processed roots of Polygonum multiflorum", Fitoterapia, 83 (3), pp 469-475 28.Yu Q, Jiang LL, Luo N, et al (2017), "Enhanced absorption and inhibited metabolism of emodin by 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucopyranoside: Possible mechanisms for Polygoni Multiflori Radix-induced liver injury", Chinese Journal of Natural Medicines, 15 (6), pp 451-457 29.Zeng C, Xiao JH, Chang MJ, Wang JL (2011), "Beneficial effects of THSG on acetic acid-induced experimental colitis: involvement of upregulation of PPAR-γ and inhibition of the Nf-Κb inflammatory pathway.", Molecules (Basel, Switzerland) 16(10) pp 8552-8568 30.Zhang Y Z, Shen J F, Xu J Y, Xiao J H, et al (2007), "Inhibitory effects of 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on experimental inflammation and cyclooxygenase activity", J Asian Nat Prod Res, (3-5), pp 355-363 ... GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y D? ?ỢC M? ?O TƯỜNG VY XÂY D? ??NG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ 2, 3,5,4’- TETRAHYDROXYSTILBEN- 2- O- β- D- GLUCOSIDE TRONG HÀ THỦ Ô ĐỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU... 2, 3,5,4′ -tetrahydroxystilben- 2- O- β- D- glucoside (THSG), 2, 3,5,4′- tetrahydroxystilben -2- O- β- D- (2' ' -O- monogalloyl estes)-glucopyranosid, 2, 3,5,4′- tetrahydroxystilben2 -O- β- D- (3'' -O- monogalloyl estes)-glucopyranosid,... gồm có emodin- 8 -O- D- glucopyranosid, emodin- 3methyl ether-8 -O- D- glucopyranosid, physcion-8 -O- β- D- glucopyranosid [14]… Hiện nay, D? ?TQ (20 15) [10] D? ?VN V (20 18) [2] quy định d? ?ợc liệu HTOĐ phải