Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống bệnh thối nhũn vi khuẩn cho cây sâm báo tại huyện vĩnh lộc, tỉnh thanh hóa

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - LÊ THỊ YẾN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC PHÒNG CHỐNG BỆNH THỐI NHŨN VI KHUẨN CHO CÂY SÂM BÁO TẠI HUYỆN VĨNH LỘC, TỈNH THANH HÓA Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC PHÒNG CHỐNG BỆNH THỐI NHŨN VI KHUẨN CHO CÂY SÂM BÁO TẠI HUYỆN VĨNH LỘC, TỈNH THANH HÓA Người thực hiện: LÊ THỊ YẾN Mã sinh viên: 621925 Lớp: K62KHMTA Khóa: 62 Giáo viên hướng dẫn: TS Vũ Thị Hồn Địa điểm thực hiện: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Hà Nội - 2022 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập- Tự do- Hạnh phúc Ngày 31 tháng 03 năm 2022 BẢN GIẢI TRÌNH SỬA CHỮA LUẬN VĂN Kính gửi: - Ban Chủ nhiệm khoa Tài nguyên Môi trường - Bộ môn: Vi sinh vật Tên là: Lê Thị Yến Mã SV: 621925 Sinh viên ngành: Khoa học môi trường Lớp: K62KHMTA Khóa: 62 Đã bảo vệ khóa luận tốt nghiệp Tiểu ban 03 ngày 25 tháng 03 năm 2022 Tên đề tài: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phịng chống bệnh thơi nhũn vi khuẩn cho sâm báo huyện Vĩnh Lộc, tỉnh Thanh Hóa Người hướng dẫn: TS Vũ Thị Hoàn Tiểu ban chấm luận tốt nghiệp yêu cầu chỉnh sửa trước nộp khóa luận tốt nghiệp nội dung sau: STT Nội dung yêu cầu chỉnh sửa Nội dung giải trình Tại trang Sửa lại lỗi tả, chỉnh sửa Đã chỉnh sửa lại lỗi tả, chỉnh Tất format tài liệu tham khảo sửa format tài liệu tham khảo Tơi chỉnh sửa hồn thiện khóa luận tốt nghiệp theo yêu cầu Tiểu ban Vậy tơi kính mong thầy/cơ hướng dẫn xác nhận cho tơi để tơi có sở nộp khóa luận tốt nghiệp theo quy định Học viện Tôi xin trân trọng cảm ơn! NGƯỜI HƯỚNG DẪN SINH VIÊN iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Tất số liệu nghiên cứu khóa luận trung thực, chưa công bố khác xin cam đoan thơng tin trích dẫn viết rõ nguồn gốc Tôi xin cảm ơn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thực tốt đề tài Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Lê Thị Yến iv năm 2022 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực khóa luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực thân, em nhận nhiều giúp đỡ để em hồn thành đề tài nghiên cứu “ Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống bệnh thối nhũn vi khuẩn cho sâm Báo huyện Vĩnh Lộc, tỉnh Thanh Hóa” Đầu tiên em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Hồn trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ em suốt thời gian thực khoá luận tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn quý thầy, cô giáo Học viện Nông Nghiệp Việt Nam tận tình truyền đạt kiến thức năm em học tập, đặc biệt tồn thể thầy, giáo Khoa Tài nguyên Môi trường Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu để em áp dụng vào thực tế cách vững tự tin Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cơ, cán quản lý phịng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh vật bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè người thân ln động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Trong trình nghiên cứu hạn chế kiến thức, tài liệu thời gian nên khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy để nội dung khóa luận em hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày….tháng… năm 2022 Sinh viên Lê Thị Yến v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iv LỜI CẢM ƠN .v MỤC LỤC vi DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi TÓM TẮT KHÓA LUẬN xii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu .2 1.1 Chế phẩm sinh học 1.1.1 Khái niệm .3 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Vai trò chế phẩm sinh học trồng trọt 1.1.4 Ứng dụng chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh hại trồng 1.2 Vi sinh vật đối kháng chế đối kháng 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng Việt Nam giới 11 1.3.1 Trên giới 11 1.3.2 Tại Việt Nam 13 1.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật .17 1.4.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 17 1.4.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc 18 1.4.3 Ảnh hưởng thời gian 18 1.4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ .19 1.4.5 Ảnh hưởng pH .19 vi 1.4.6 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống 20 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu .21 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1 Hoạt hóa đánh giá chất lượng giống gốc 22 2.2.2 Xác định điều kiện nhân giống cấp cho chủng vi sinh vật: 22 2.2.3 Xác định điều kiện lên men nhân sinh khối cho chủng vi sinh vật: 22 2.2.4 Đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản 22 2.2.5 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu .22 2.3.1 Phương pháp hoạt hoá đánh giá chất lượng giống gốc 22 2.3.2 Phương pháp xác định điều kiện nhân giống cấp .24 2.3.3 Xác định điều kiện lên men nhân sinh khối 26 2.2.4 Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm khả tồn chủng vi khuẩn chế phẩm sau thời gian bảo quản 28 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 3.1 Hoạt hóa đánh giá chất lượng giống gốc 29 3.2 Lựa chọn điều kiện nhận giống cấp 33 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường nhân giống .33 3.2.2 Ảnh hưởng pH .35 3.2.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc 36 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy .38 3.2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ .39 3.2.6 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến chất lượng giống .40 3.3 Lựa chọn điều kiện lên men sinh khối 42 3.3.1 Ảnh hưởng môi trường 42 3.3.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc 44 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian 45 vii 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ .47 3.3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống 48 3.3 Đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản 50 3.4 Quy trình sản xuất chế phẩm 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận .53 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 59 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết đánh giá chất lượng giống gốc sau tăng sinh 24h 31 Bảng 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn lựa chọn 32 Bảng 3.3 Ảnh hưởng môi trường nhân giống đến khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn 33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn trình nhân giống 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn trình nhân giống .36 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn trình nhân giống .38 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn trình nhân giống .40 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn trình nhân giống .41 Bảng 3.9 Kết xác định điều kiện nhân giống chủng vi khuẩn thí nghiệm 42 Bảng 3.10 Ảnh hưởng môi trường đến mật độ hoạt tính đối kháng vi khuẩn trình nhân sinh khối 43 Bảng 3.11 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến mật độ hoạt tính đối kháng vi khuẩn trình nhân sinh khối 44 Bảng 3.12 Ảnh hưởng thời gian đến mật độ hoạt tính đối kháng vi khuẩn trình lên men sinh khối .46 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mật độ hoạt tính đối kháng vi khuẩn trình nhân sinh khối 47 Bảng 3.14 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến mật độ hoạt tính đối kháng vi khuẩn trình lên men sinh khối 48 Bảng 3.15 Điều kiện tối ưu cho trình lên men nhân sinh khối 50 Bảng 3.16 Chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản 50 ix DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Kết lây nhiễm chủng Bs số mẫu thực vật 30 Hình 3.2 Kết thử nghiệm hoạt tính đối kháng giống gốc 31 Hình 3.3 Kết nhân giống gốc 31 Hình 3.4 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng VK 32 Hình 3.5 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến hoạt tính đối kháng VK B3 34 Hình 3.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến mật độ hoạt tính đối kháng VK BH2 37 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến mật độ hoạt tính đối kháng VK B3 .39 Hình 3.8 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt tính đối kháng chủng BH2 .45 Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến mật độ hoạt tính đối kháng VK B3 .47 Hình 3.10 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến mật độ hoạt tính đối kháng VK BH2 49 Hình 3.11 Chất lượng sản phẩm theo thời gian bảo quản 51 Hình 3.12 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng bệnh thối nhũn sâm Báo 52 x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết Việt Nam quốc gia phát triển lên từ nông nghiệp Trong suốt chiều dài phát triển dân tộc, nông nghiệp ngành có đóng góp tích cực phát triển kinh tế - xã hội đất nước Hiện trạng sản xuất nông nghiệp nước ta cho thấy sử dụng ngày nhiều phân bón hóa học thuốc bảo vệ thực vật Điều làm cho cấu trúc đất bị thay đổi, đồng ruộng dần độ phì nhiêu, môi trường bị ô nhiễm sức khỏe người bị ảnh hưởng nghiêm trọng Chính vậy, xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học phân bón hữu thay cho phân bón hóa học loại hóa chất bảo thực vật canh tác nhằm cải tạo đất, đảm bảo an toàn sinh học, nâng cao suất trồng bảo vệ môi trường mục tiêu tái cấu nông nghiệp Việt Nam Cây sâm Báo có tên khoa học Abelmoschus sagittifolius Kurz septentrionalis Gagnep, họ Bông Malvaceae trước mọc núi Báo làng Bồng Thượng thuộc xã Vĩnh Hùng, huyện Vĩnh Lộc, tỉnh Thanh Hóa mệnh danh “Đệ danh sâm” Ngày nay, Sâm Báo coi dược liệu quý mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân huyện Vĩnh Lộc Do đó, Sâm Báo trồng quan tâm Điều kiện khí hậu nước ta thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, có vi sinh vật gây bệnh thực vật Bệnh thối nhũn bệnh gây tổn thất lớn suất chất lượng củ sâm Để kiểm soát bệnh thực vật vi sinh vật gây mà không ảnh hưởng đến chất lượng thân thiện với môi trường nhận quan tâm nhà nghiên cứu khoa học Một hướng nghiên cứu theo xu hướng sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế quần thể vi sinh vật gây bệnh, vi khuẩn nhóm có nhiều tiềm tỷ lệ lồi có khả đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cao Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học từ vi khuẩn đối kháng có ý nghĩa 61 lớn cơng tác bảo vệ thực vật nói chung sâm nói riêng Vì ngồi việc phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh cho trồng việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ lồi vi khuẩn có vai trị vơ quan trọng sản xuất nơng nghiệp an tồn bền vững Xuất phát từ lý trên, em thực đề tài: “Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống bệnh thối nhũn vi khuẩn cho Sâm Báo” 1.2 Giả thiết khoa học Chế phẩm sinh học sản xuất theo quy trình có khả xử lý bệnh thối nhũn vi khuẩn sâm Báo mang lại hiệu cao an tồn với mơi trường 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học đạt Tiêu chuẩn Việt Nam 62 PHẦN 2: NỘI DUNG THỰC HIỆN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Chế phẩm sinh học 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Vai trò chế phẩm sinh học trồng trọt 1.1.4 Ứng dụng chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh hại trồng 1.2 Vi khuẩn đối kháng chế đối kháng 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng Việt Nam giới 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Tại Việt Nam 1.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật 1.4.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 1.4.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc 1.4.3 Ảnh hưởng thời gian 1.4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 1.4.5 Ảnh hưởng pH 1.4.6 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống 63 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu Vi khuẩn gây bệnh thối nhũn sâm báo vi khuẩn đối kháng cung cấp đề tài nghiên cứu TS Vũ Thị Hoàn – mơn Vi sinh vật Trong vi khuẩn gây bệnh ký hiệu Bs; Vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh ký hiệu BH2; B3; K48 Các thiết bị, dụng cụ, máy móc sử dụng để nghiên cứu thuộc phịng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh vật Khoa Tài nguyên Môi trường, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Hóa chất, mơi trường: King's B: Pepton: 20g; Glycerin: 10 ml; K HPO : 1,5g; MgS0 7H 0: 1,5g; Agar: 18g; Nước cất 1000 ml Bacillus: Pepton: 10g; Cao thịt: 4g; NaCl: 5g; Agar: 20g; Nước cất 1000 ml Pepton thường: Pepton: 20g; NaCl: 5g; Agar: 20g; pH: 7,2–7,4; Nước cất: 1000ml Thạch thường: Pepton:10g; NaCl: 5g; Cao thịt: 4g; Agar 20g; pH: 7,4– 7,6; Nước cất: 1000ml TSA: Triptone: 17g; Soytone: 3g; Dextro: 2,5g; NaCl: 5g; KH PO 4: 0,5g; Agar; 20g; Nước cất: 1000ml Môi trường nước chiết giá đỗ: 200g/1000ml nước, đun sôi 30 phút Môi trường nước chiết khoai tây: 200g/1000ml nước, đun sôi 30 phút Môi trường nước chiết đậu tương : 200g/1000ml nước, đun sôi 30 phút Môi trường rỉ đường: 50g/1000ml nước, đun sôi 15 phút; 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu Địa điểm: Bộ môn vi sinh vật – Khoa Tài nguyên Môi trường Thời gian: Từ tháng 9/2021 đến tháng 1/2022 2.2.Nội dung nghiên cứu 64 2.2.1 Hoạt hóa đánh giá chất lượng giống gốc 2.2.2 Xác định điều kiện nhân giống cấp cho chủng vi sinh vật Môi trường; tốc độ lắc; thời gian; nhiệt độ; pH; tỷ lệ tiếp giống 2.2.3 Xác định điều kiện lên men nhân sinh khối cho chủng vi sinh vật Môi trường; tốc độ lắc; thời gian; nhiệt độ; tỷ lệ tiếp giống 2.2.4 Đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản 2.2.5 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm 2.3.Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp hoạt hoá đánh giá chất lượng giống gốc Giống gốc cung cấp dạng bảo quản glycerin điều kiện 0oC Các giống gốc hoạt hóa cách ủ nhiệt độ 300C 24h, tăng sinh môi trường lỏng máy lắc ổn nhiệt tốc độ 150 vòng/phút; 30oC;48h Sau cấy mơi trường chun tính bán rắn dạng thạch nghiêng ủ 30oC, 48h, bảo quản tủ lạnh để sử dụng cho nghiên cứu Đánh giá chất lượng giống gốc bao gồm: Với chủng vi khuẩn gây bệnh Bs đánh giá khả gây bệnh theo phương pháp lây bệnh nhân tạo theo hướng dẫn Perombelon Van Der Wolf (2002) Mẫu bắp cải, khoai tây, cà rốt rễ sâm sau rửa ngâm dung dịch nước dịch NaClO 1% phút, rửa lại nước vô trùng; làm khô mẫu đặt đĩa petri Dùng kim tiêm chích chủng Bs lên mẫu để nhiệt độ phịng Theo dõi hình thành vết bệnh sau 24 - 48h Với chủng vi khuẩn đối kháng đánh giá hoạt tính đối kháng phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo Sumathi and Reetha (2012) Cụ thể sau: Tiến hành nhỏ 50 μL dịch vi khuẩn gây bệnh Bs lên đĩa môi trường King’s B dùng que trang trải Sau 15 phút tiến hành đục lỗ đường kính mm đĩa thạch nhỏ vào lỗ 50 μL dịch vi khuẩn đánh giá BH2; B3; K48; 65 đem ủ 37°C 24 Hoạt tính đối kháng xác định cách đo đường kính vịng đối kháng (vịng suốt bao quanh lỗ đục): D-d(mm); D đường kính vịng đối kháng, d: Đường kính lỗ đục Phương pháp xác định khả sinh enzym ngoại bào (CMCaza, Amylaza, Proteaza)của chủng vi khuẩn đối kháng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Xác định hoạt tính sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (William, 1983) Cụ thể sau: Lấy vòng que cấy VSV cho vào 9ml dung dịch mơi trường chun tính khử trùng chờ nguội; Ni lắc với tốc độ 150 vòng/phút Sau 48 lấy dịch ni cấy để đánh giá hoạt tính enzym Mơi trường đánh giá hoạt tính enzyme: Enzym Hóa chất Tỷ lệ CMCaza CMC 0,2% Thạch Amylaza Tinh bột Thạch 1,5% 0,2% 1,5% Proteaza Gelatin Thạch 0,2% 1,5% Cách làm sau: Môi trường sau khử trùng 121oC, atm 20 phút, đổ đĩa petri (dày khoảng 2mm) chờ nguội Dùng khoan khử trùng khoan lỗ đĩa thạch với đường kính mm Hút 0,1 ml dịch chuẩn bị nhỏ vào lỗ đục, chờ khô Đặt đĩa petri tủ lạnh để enzym khuếch tán, sau đặt vào tủ nuôi 30oC 48 đem nhuộm màu dung dịch lugol Nếu xuất vịng phân giải tiến hành đo đường kính vịng phân giải; Hoạt tính enzyme tính cơng thức: D - d (mm), D: đường kính vịng phân giải, d: đường kính lỗ đục 2.3.2 Phương pháp xác định điều kiện nhân giống cấp Các thí nghiệm xác định điều kiện nhân giống cấp tiến hành 66 môi trường dịch thể khử trùng 121oC 20 phút, máy lắc ổn nhiệt Dịch vi sinh vật để đánh giá chuẩn bị sau: Lấy vòng que cấy giống pha lỗng 9ml nước vơ trùng để mật độ 10-1 Bổ sung 1ml dịch vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa 9ml mơi trường dịch thể khử trùng để tiến hành thí nghiệm xác định điều kiện nhân giống cấp Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm mật độ tế bào/mL kích thước vịng đối kháng D(mm)); Trong đó: Mật độ tế bào phương pháp đo OD 600 Kích thước vịng đối kháng (Hoạt tính đối kháng vi khuẩn xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo Sumathi and Reetha (2012) Cụ thể sau: Tiến hành nhỏ 50 μL dịch vi khuẩn gây bệnh lên đĩa môi trường King’s B dùng que trang trải Sau 15 phút tiến hành đục lỗ đường kính mm đĩa thạch nhỏ vào lỗ 50 μL dịch vi khuẩn đánh giá, đem ủ 37°C 24 Hoạt tính đối kháng xác định cách đo đường kính vịng đối kháng (vịng suốt bao quanh lỗ đục): D-d(mm); D đường kính vịng đối kháng, d: Đường kính lỗ đục Các thí nghiệm xác định điều kiện nhân giống cấp bao gồm: a Lựa chọn mơi trường nhân giống Thí nghiệm gồm công thức với lần lặp lại; Các mơi trường thí nghiệm lựa chọn môi trường thường dùng để nuôi cấy vi khuẩn gồm: King's B; Bacillus; Pepton thường; Thạch thường Các chủng vi khuẩn thí nghiệm nhân máy lắc ổn nhiệt 30oC, 48h, tốc độ lắc 150 vòng/phút Kết thí nghiệm xác định mơi trường nhân giống phù hợp (có mật độ tế bào kích thước vòng ĐK tốt nhất) lựa chọn áp dụng 67 cho thí nghiệm b Phương pháp xác định pH mơi trường nhân giống thích hợp Các chủng vi khuẩn thí nghiệm nhân mơi trường phù hợp lựa chọn từ thí nghiệm bổ sung 10% dung dịch đệm Sorensen có pH từ đến 8, đem nuôi nhiệt độ 30oC 48h, tốc độ lắc 150 vòng/phút; tỷ lệ tiếp giống 1%; Kết xác định pH môi trường nhân giống thích hợp (có mật độ tế bào kích thước vòng ĐK tốt nhất) để thực nghiên cứu c Phương pháp xác định tốc độ lắc thích hợp Thí nghiệm tiến hành với tốc độ lắc là: 100 vòng/phút; 125 vòng/phút; 150 vòng/ phút; 200 vòng/phút; 250 vòng/phút Các chủng vi khuẩn nhân mơi trường lỏng có pH phù hợp chọn từ thí nghiệm trên, lắc nhiệt độ 30oC 48h, tốc độ 150 vòng/phút; tỷ lệ tiếp giống 1%; Kết thí nghiệm xác định tốc độ lắc phù hợp (mật độ tế bào kích thước vịng ĐK tốt nhất) áp dụng cho thí nghiệm d Phương pháp xác định thời gian nhân giống thích hợp Thí nghiệm tiến hành mốc thời gian là: 24h; 48h; 72h; 96h Các chủng vi khuẩn nhân môi trường, pH tốc độ lắc phù hợp chọn từ thí nghiệm trên, nhiệt độ 30oC; Tỷ lệ tiếp giống 1%; Kết xác định thời gian phù hợp áp dụng cho thí nghiệm e Phương pháp xác định nhiệt độ thích hợp Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ: 20oC; 25 oC; 30 oC; 35 oC; 40 oC Các chủng vi khuẩn nhân môi trường, pH, tốc độ thời gian phù hợp chọn từ thí nghiệm trên; Tỷ lệ tiếp giống 1%; Kết xác định thời gian phù hợp áp dụng cho thí nghiệm Kết xác định nhiệt độ áp dụng cho thí nghiệm f Phương pháp xác định tỷ lệ tiếp giống thích hợp 68 Thí nghiệm tiến hành với tỷ lệ tiếp giống 1,3,5,7% Các chủng vi khuẩn nhân môi trường, pH, tốc độ thời gian, nhiệt độ phù hợp chọn từ thí nghiệm trên; Kết xác định tỷ lệ tiếp giống phù hợp áp dụng cho thí nghiệm 2.3.3 Xác định điều kiện lên men nhân sinh khối Trong thí nghiệm xác định điều kiện nhân sinh khối vi sinh vật nuôi riêng rẽ môi trường dịch thể khử trùng điều kiện nhân sinh khối khác bao gồm: môi trường, tốc độ lắc, thời gian, nhiệt độ tỉ lệ tiếp giống Dịch vi sinh vật thí nghiệm xác định điều kiện nhân sinh khối giống cấp nhân điều kiện tối ưu lựa chọn từ thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi mật độ vi sinh vật hữu ích Mật độ vi sinh vật hữu ích xác định theo phương pháp pha đo OD 600; Các thí nghiệm cụ thể sau: a Lựa chọn môi trường nhân sinh khối thích hợp Thí nghiệm: gồm cơng thức lần lặp lại, công thức 45ml môi trường: CT1- ĐC: Mơi trường chun tính CT2: Mơi trường nước chiết giá đỗ CT3: Môi trường nước chiết khoai tây CT4: Môi trường nước chiết đậu tương CT5: Môi trường nước rỉ đường Cách tiến hành: Bổ sung giống cấp môi trường thử nghiệm với tỉ lệ tiếp giống 5%; Trong thí nghiệm chủng vi khuẩn nuôi lắc 30oC, 48 h; tốc độ 150 vịng/phút; Kết thí nghiệm lựa chọn mơi trường nhân sinh khối phù hợp áp dụng thí nghiệm b Xác định tốc độ lắc Thí nghiệm tiến hành tốc độ gồm: 100 vòng/phút; 125 vòng/phút; 69 150 vòng/ phút; 200 vòng/phút Vi sinh vật nhân sinh khối mơi trường thích hợp lựa chọn từ thí nghiệm 30oC, 48 h; tốc độ 150 vòng/phút; tỉ lệ tiếp giống 5% Kết lựa chọn tốc độ lắc phù hợp áp dụng thí nghiệm c Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối thích hợp Thí nghiệm tiến hành mốc thời gian là: 24h; 48h; 72h; 96h Vi sinh vật nhân sinh khối mơi trường tốc độ lắc thích hợp lựa chọn từ thí nghiệm trên; 30oC, tỷ lệ tiếp giống 5% Kết xác định thời gian nhân sinh khối phù hợp áp dụng cho thí nghiệm d Phương pháp xác định nhiệt độ nhân sinh khối thích hợp Thí nghiệm tiến hành ngưỡng nhiệt độ là: 25 oC; 30 oC; 35 oC; 40 o C Vi sinh vật nhân sinh khối môi trường, tốc độ lắc thời gian thích hợp lựa chọn từ thí nghiệm trên; tỉ lệ tiếp giống 5% Kết xác định nhiệt độ nhân sinh khối phù hợp áp dụng cho thí nghiệm e Phương pháp xác định tỷ lệ tiếp giống Tỷ lệ tiếp giống áp dụng cho thí nghiệm là: 5%; 7%; 10%; 15% Vi sinh vật nhân sinh khối môi trường, tốc độ lắc; thời gian nhiệt độ thích hợp lựa chọn từ thí nghiệm Kết xác định tỷ lệ tiếp giống phù hợp áp dụng cho thí nghiệm 2.2.4 Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm khả tồn chủng vi khuẩn chế phẩm sau thời gian bảo quản Chế phẩm sản xuất theo phương pháp hợp chủng sau nhân sinh 70 khối riêng rẽ chủng vi sinh vật hữu ích; sau bảo quản nhiệt độ phòng; Chỉ tiêu đánh giá chất lượng gồm: mật độ vi sinh vật hữu ích mật độ vi sinh vật tạp Thời gian đánh giá: Ngay sau sản xuất 10 ngày, 20 ngày; 30 ngày Mật độ vi sinh vật hữu ích đánh giá theo phương pháp pha lỗng Koch, ni cấy mơi trường chun tính bán rắn Mẫu đồng hóa pha lỗng thập phân; 0,1 ml độ pha lỗng thích hợp dàn đĩa thạch chứa mơi trường chun tính Số lượng tế bào xác định cách đếm số khuẩn lạc phát triển đĩa có số lượng nằm khoảng 30–250 sau ủ 30°C 48 Tổng số vi khuẩn ml mẫu thử tính theo cơng thức: 𝑁𝑁 = ∑𝐶𝐶/𝑉𝑉(𝑛𝑛1 + 0,1·𝑛𝑛2)𝑑𝑑 Trong đó: N tổng số vi khuẩn sống có ml mẫu thử (CFU/ ml); ∑C tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa chọn; V thể tích cấy đĩa (ml); n1 số đĩa đếm độ pha loãng thứ giữ lại; n2 số đĩa đếm nồng độ pha loãng thứ hai giữ lại; d hệ số pha loãng nồng độ pha loãng thứ Mật độ vi sinh vật xác định chế phẩm thời điểm khác so sánh với TCVN 6168:2002 để đánh giá chất lượng 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập, nghiên cứu tổng hợp xử lý thống kê phần mềm Excel 71 CHƯƠNG III: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Hoạt hóa đánh giá chất lượng giống gốc 3.2.Xác định điều kiện nhân giống cấp 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường nhân giống 3.2.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 3.2.4.Ảnh hưởng nhiệt độ 3.2.5.Ảnh hưởng pH 3.3 Xác định điều kiện lên men nhân sinh khối 3.3.1.Ảnh hưởng môi trường nhân giống 3.3.2.Ảnh hưởng tốc độ lắc 3.3.3.Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 3.3.4.Ảnh hưởng nhiệt độ 3.3.5.Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống 3.4 Đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản 3.5 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kiến nghị PHẦN 3: KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU STT Nội dung thực Thời gian thực (Tháng) 10 11 12 Lập đề cương nghiên cứu Viết tổng quan, làm TN X X X Làm TN; Xử lý số liệu X X X Hồn thành khóa luận, thơng qua X X X GVHD Nộp bảo vệ khóa luận tốt nghiệp (Ghi chú: X thời gian thực hiện) X Giảng viên hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên thực đề tài (Ký ghi rõ họ tên) Vũ Thị Hồn Lê Thị Yến 73 BỘ MƠN QUẢN LÝ SINH VIÊN Trường môn (Ký ghi rõ họ tên) Đinh Hồng Duyên 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO https://caythuocquy.info.vn/ky-thuat-trong-cay-sam-bao Hiện trạng ô nhiễm môi trường hóa chất bảo vệ thực vật tồn lưu thuộc nhóm chất hữu khó phân hủy Việt Nam (2015)-Tổng cục môi trường: Dự án xây dựng lực nhằm loại bỏ hóa chất bảo vệ thực vật POP tồn lưu Việt Nam 75