Xây dựng quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt (Borassus flabellifer L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

Bài viết Xây dựng quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt (Borassus flabellifer L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao với mục đích của nghiên cứu này là xây dựng được quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt. Một quy trình định tính, định lượng dioscin nhanh chóng, hiệu quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

QUANTITATIVE ANALYSIS OF DIOSIN IN Borassus flabellifer L FLOWER BY HPLC Nguyen Pham Tuan1*, Tran Thi Que1, Nguyen Hoang Nam1, and Nguyen Hoang Thai1 An Giang Biotechnology center, Chau Thanh district, An Giang province *Corresponding author: ngphamtuan1983@gmail.com Tel: +84.0988.202055 Abstract The study introduced a HPLC method for quantitative analysis of dioscin in Borassus flabellifer flower A rapid and effective HPLC method is described for the assay of diosin in me 20 µL of dioscin solution was injected onto a C8 reverse phase column (5 àm, 120 , 4.6ì150 mm) The mobile phase employed was acetonitrile: water (65: 40, v/v) at a flow rate of 0.8 mL/min The column effluent was monitored within minutes by diot array detection at 209 nm The retention time of dioscin was found to be 5.02 minutes In the concentration range of 60 - 300 μg/mL, there was a tight linear correlation between peak area y (mAU.min) and sample concentration x (μg/mL) according to the equation y = 6854.4x + 7144.4 as the squared correlation coefficient R2 was 0.997 The limit of detection and limite of quantification were respectively and 6.6 μg/mL The method was specific to dioscin with good precision and accuracy The percentage recovery was ≤ 100 ± 4%, the relative standard deviation of the repeatability was ≤ 1.69% and the relative standard deviation of the intermediate precision was ≤ 1.85%.dicinal plant Keywords: HPLC, Borassus flabellifer, dioscin, accuracy, precision 190 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG DIOSCIN TỪ HOA THỐT NỐT (Borassus flabellifer L.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÂNG CAO Nguyễn Phạm Tuấn1*, Trần Thị Quế1, Nguyễn Hoàng Nam1 Nguyễn Hồng Thái1 Trung tâm Cơng nghệ Sinh học tỉnh An Giang, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang *Tác giả liên hệ: ngphamtuan1983@gmail.com Số điện thoại: 0988.202055 Tóm tắt Mục đích nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng dioscin từ hoa nốt Một quy trình định tính, định lượng dioscin nhanh chóng, hiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Pha tĩnh sử dụng cột sắc ký pha đảo C18 (150 mm x 4,6 mm x µm), pha động hỗn hợp acetonitril: nước (60:40, v/v), tốc độ dòng 0,8 mL/phút Mẫu tiêm với thể tích 20 µL, thời gian sắc ký phút, bước sóng phát 209 nm Thời gian lưu dioscin 5,02 phút Kết thực nghiệm cho thấy khoảng nồng độ từ 60 - 300 μg/mL, có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic y (mAU.min) nồng độ dung dịch x (μg/mL) theo phương trình y = 6854,4x + 7144,4 với hệ số xác định R2 = 0,997 Giới hạn phát giới hạn định lượng 6,6 μg/mL Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với dioscin, có độ độ xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 4%, độ lệch chuẩn tương đối độ lặp lại ≤ 1,69%, độ lệch chuẩn tương đối độ xác trung gian ≤ 1,85% Từ khóa: sắc ký lỏng, hoa nốt, độ xác, độ đúng, dioscin 191 Mở đầu Trong y học dân gian Việt Nam, hoa nốt đực (Borassus flabellifer) sử dụng để chữa sốt lợi tiểu Qua nhiều nghiên cứu tác giả ngồi nước cho thấy hoa nốt đực có chứa nhóm saponin steroid, chủ yếu spirostan dioscin Trong dioscin nghiên cứu có tác dụng chống ung thư chống viêm mạnh mô hình thử in vitro (tế bào) mơ hình in vivo Các kết gợi ý chất dioscin hoạt chất mang lại tác dụng đề cập hoa nốt đực nên sử dụng làm chất đánh dấu tiêu chí định tính định lượng (Zhao et al., 2016; Wang et al., 2018) Dioscin hợp chất steroid, hình thành diosgenin glucoside liên kết với thông qua liên kết - 1,3 glycosidic Đây hợp chất tìm thấy chủ yếu thực vật thuộc chi củ Nâu (tên khoa học Dioscora zingiberensis) Liên kết thủy phân dioscin-diosgenin quan trọng, tảng việc sản sinh nội tiết tố có tác dụng điều trị hiệu việc chống nhiễm trùng, bệnh virus, bệnh khớp, bệnh tim mạch, da liễu Bên cạnh đó, nghiên cứu gần dioscin có tác dụng chống ung thư Cơ chế chống ung thư hệ ROS diosin nghiên cứu Wang et al (2012) Nhóm tác giả kết luận dioscin, saponin glucoside phân lập từ loại củ nâu (tên khoa học Dioscora panthaica) có tác dụng bảo vệ gan chống ung thư người thông qua chế ―apoptosis‖- q trình kiểm sốt bao gồm nhiều bước, nhằm loại bỏ tế bào không mong muốn hệ thống sinh học Nghiên cứu khẳng định Dioscin ức chế tế bào ung thư gây dây chuyền phản ứng oxy hóa khử (ROS) Song song đó, Zhao et al (2016) tiến hành nghiên cứu đưa chế chống ung thư cổ tử cung Đồng thời, nghiên cứu Wang et al (2018) chứng minh khả chống ung thư phổi dioscin Cho đến thời điểm tại, nước chưa có nghiên cứu dioscin cơng bố Như vậy, phát triển nghiên cứu dioscin hướng Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm lựa chọn thuốc điều trị Xây dựng phương pháp định lượng dioscin theo tiêu chuẩn quốc tế công việc cần thiết nhằm kiểm soát chất lượng thuốc đồng thời tạo tiền đề cho nghiên cứu bào chế, đánh giá tương đương sinh học, theo dõi dược động học thuốc (a) (b) Hình Cấu trúc hóa học dioscin (a) hoa Thốt nốt (b) Vật Liệu phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu dùng nghiên cứu hoa Thốt nốt (Borassus flabellifer L.) thu hái huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang hoa Thốt nốt sau thu hái từ nhà vườn vận chuyển phòng thí nghiệm Trung tâm Cơng nghệ sinh học tỉnh An Giang 192 Thiết bị hóa chất: hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), cân phân tích (Shimadzu, Nhật Bản), màng lọc 0,45µm (Merck, Đức), methanol (Merck, Đức), Dioscin (Merck, Đức), Acetonitril (Merck, Đức),… hóa chất thiết bị cần thiết khác 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân xác 6mg chất chuẩn Dioscin (độ tinh khiết 95% - Sigma) Hòa tan chuẩn với 10 mL methanol, dung dịch chuẩn nồng độ 600µg/mL Xây dựng đường chuẩn với nồng độ dioscin 60 µg/mL; 120 µg/mL; 180 µg/mL; 240 µg/mL; 300 µg/mL Chuẩn bị mẫu thử Lấy 10 gam bột nguyên liệu, cho vào túi giấy lọc, chiết Soxhlet với 300 ml cồn 96% (16 giờ) Dịch chiết cô áp suất thấp thu cắn Hòa cắn 20 ml nước cất, chuyển vào bình lắng gạn 100 mL Chiết dịch nước với diethyl ether lần, lần 20 mL Dịch nước tiếp tục chiết với n-butanol bão hòa nước lần, lần 20 mL Tập trung phần dịch n-butanol lại đến cắn Pha lỗng mẫu 250 lần với methanol lọc qua màng 0,45 µm tiêm dịch lọc vào hệ thống HPLC Ghi nhận diện tích peak, hàm lượng dioscin tính dựa đường chuẩn Hệ thống HPLC Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: Bơm LC-20AT, tiêm mẫu tự động SIL20AHT, detector UV-vis, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh số liệu máy HPLC Phần mềm Excel (Microsoft Office) sử dụng để tính tốn kết Điều kiện sắc ký - Detector: SPD-M20A; pump: LC-30AD 15 - Cột sắc ký: Merck C18 (15cm x 4,6 mm x 5µm) - Thể tích tiêm mẫu: 20 µL - Tốc độ dịng: 0,8 mL/phút - Pha động: Acetonitril: H2O = 60: 40 (v/v) - Bước sóng: 209 nm Thẩm định quy trình định lƣợng dioscin Quy trình đánh giá theo hướng dẫn tài liệu tham khảo (Trần Cao Sơn cs., 2010), việc khảo sát tiêu sau đây: độ đặc hiệu, độ tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp Khảo sát hàm lƣợng dƣợc chất diện phần hoa nốt Hai phận phát hoa (hoa cuống) sau tách riêng để xử lý Lấy 10 gam loại, cho vào túi giấy lọc, chiết Soxhlet với 300 mL cồn 96% (16 giờ) Dịch chiết cô áp suất thấp thu cắn Hòa cắn 20 mL nước cất, chuyển vào bình lắng gạn 100 mL Chiết dịch nước với diethyl ether lần, lần 20 mL Dịch nước tiếp tục chiết với n-butanol bão hòa nước lần, lần 20 mL Tập trung 193 phần dịch n-butanol lại đến cắn Pha lỗng mẫu 250 lần với methanol lọc qua màng 0,45µm tiêm dịch lọc vào hệ thống HPLC, ghi nhận lại diện tích peak Kết thảo luận 3.1 Thẩm định quy trình phân tích Thẩm định q trình phân tích trình thiết lập thực nghiệm thông số đặc trưng phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến (Trần Cao Sơn cs., 2010) 3.1.1 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu hay cịn gọi tính chọn lọc quy trình phân tích khả quy trình cho phép xác định xác đặc hiệu chất cần phân tích mà khơng bị ảnh hưởng có mặt chất khác có mẫu thử (Trần Cao Sơn cs., 2010) Hình (a) Sắc ký đồ mẫu blank; (b) Sắc ký đồ dioscin chuẩn; (c) Sắc ký đồ mẫu hoa Thốt nốt Tiến hành phân tích mẫu blank (methanol), mẫu chuẩn dioscin, mẫu hoa nốt theo điều kiện sắc ký lựa chọn Các sắc ký đồ thu trình bày Hình Kết thu cho thấy tín hiều peak chất dioscin xuất thời gian lưu (tR ~ 5,0 phút) Trên sắc ký đồ mẫu blank, khơng thấy xuất tín hiệu peak thời gian lưu sắc ký đồ mẫu thử hoa nốt có xuất tín hiệu peak này, tín hiệu tách khỏi tín hiệu khác sắc ký đồ Điều chứng tỏ, phương pháp có tính đặc hiệu chọn lọc phù hợp cho phân tích dioscin nguyên liệu nốt 3.1.2 Khảo sát tính thích hợp hệ thống Để đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký, tiến hành pha 01 mẫu đối chiếu có nồng độ 150 µg/mL Tiến hành sắc ký lặp lại lần với điều kiện lựa chọn, kết trình bày Bảng 194 Bảng Kết định lƣợng mẫu với lần lặp lại Lần Lần 5,06 Lần 5,013 Lần 5,008 Lần 4,96 TB RSD (%) 5,0242 1,96 Lần Thời gian lƣu (phút) 5,24 4,91 Speak (AU.s) 707.254 713.959 707.348 709.825 710.842 712.549 710.296 0,349 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian diện tích peak 1,96% 0,349% (đều < 2%) Kết cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống HPLC sử dụng phù hợp đảm bảo ổn định phép phân tích định lượng chất dioscin 3.1.3 Độ tuyến tính khoảng tuyến tính phƣơng pháp định lƣợng Tính tuyến tính quy trình phân tích khả luận kết phương pháp dựa vào đường biểu diễn tương quan tỷ lệ đại lượng đo y nồng độ x Cả hai trường hợp điều yêu cầu đại lương đo nồng độ phải có phụ thuộc tuyến tính (Trần Cao Sơn cs., 2010) Chuẩn bị dãy gồm 05 dung dịch mẫu đối chiếu dioscin tiến hành chạy phân tích sắc ký lỏng cao áp theo quy trình nghiên cứu Kết phân tích định lượng dioscin với mức nồng độ khác (60 - 300 µg/mL) trình bày Bảng Dựa vào kết phân tích định lượng dioscin, tiến hành xây dựng phương trình đường chuẩn dioscin tình tốn giá trị hệ số tương quan (Hình 3) Kết xây dựng phương trình đường chuẩn giá trị hệ số tương quan có tương quan tuyến tính nồng độ chất đối chiếu dioscin (x) diện tích peak (y) với phương trình hồi quy: y = 6854,4x + 7144,4 hệ số tương quan R2 = 0,997 Bảng Kết định lƣợng mẫu dioscin chuẩn Nồng độ (µg/mL) 60 Diện tích peak (AU.s) 413.219 120 180 240 300 871.046 1.184.602 1.661.538 2.074.301 Hình Phƣơng trình đƣờng chuẩn dioscin 195 3.1.4 Khảo sát độ Độ quy trình phân tích mức độ sát gần giá trị tìm thấy với giá trị thực áp dụng quy trình đề xuất mẫu thử làm đồng điều kiện xác định (Trần Cao Sơn cs., 2010) Độ phương pháp xác định phương pháp thêm chất chuẩn, tức thêm vào mẫu M1 xác định hàm lượng lượng xác chất dioscin cho tổng nồng độ chúng nằm khoảng tuyến tính khảo sát Cụ thể, pha dung dịch mẫu chuẩn dioscin có nồng độ 20 µg/mL mẫu thử pha dung dịch thử Hút xác mL dịch thử mL dung dịch chất đối chiếu dioscin, lắc tiến hành định lượng Hiệu suất thu hồi tính theo cơng thức sau: (%) = [(𝑆𝑐 + 𝑆𝑀) ∗ 100]/𝑆𝑇 Trong đó: SC: Diện tích peak chất chuẩn SM: Diện tích peak chuẩn; STH: Diện tích peak thu hồi Bảng Xác định độ phương pháp % Thu hồi TT Mẫu TR (phút) Diện tích peak (AU.s) Đối chiếu 4,534 113.250 Mẫu 4,896 2.256.430 Thu hồi 4,55 1.141.758 96,36 Thu hồi 4,602 1.190.152 100,45 Thu hồi 5,194 1.196.070 100,95 Thu hồi 4,848 1.170.689 98,81 Thu hồi 4,883 1.165.151 98,34 Thu hồi 4,936 1.162.215 98,09 RSD (%) 1,69 Trung bình 98,83 Độ phương pháp xác định từ tỷ lệ (%) thu hồi chất thu từ kết định lượng so với lượng chất chuẩn thêm vào Kết phân tích cho thấy, quy trình định lượng chất dioscin có khả thu hồi cao (>96%, RSD