Nghiên cứu định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bài viết nghiên cứu định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm, cũng như xây dựng công thức bào chế.

Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Nghiên cứu định lượng BERBERIN CHLORID “viên nén đại tràng 105” phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Hồ Cảnh Hậu*; Hoàng Văn Thêm*; Nguyễn Thị Lan Hương* Nguyễn Văn Thuận**; Nguyễn Cẩm Vân***; Nguyễn Tuấn Quang*** Tóm tắt Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng berbein chlorid “Viên nén đại tràng 105” sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đối tượng phương pháp: “Viên nén đại tràng 105” Bệnh viện Quân y 105 sản xuất tiến hành phân tích hệ thống HPLC với cột: RP18 (150 x 4,6 mm, µm), bước sóng 345 nm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha động hỗn hợp methanol-acetonitril-dung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3) Kết quả: phương pháp xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ độ lặp lại Giới hạn phát berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” 0,02 µg/ml Áp dụng xác định hàm lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” 37,65 ± 1,02 (mg/viên) Kết luận: phương pháp xây dựng đảm bảo yêu cầu dùng để định lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” * Từ khóa: Berberin chlorid; “Viên nén đại tràng 105”; Sắc ký lỏng hiệu cao Quantitative Study on Berberin Chloride in “Vien nen dai trang 105” by High Performace Liquid Chromatography Summary Objective: To establish the quantitative methodology measuring the amount of berberin chloride in “Vien nen dai trang 105” by high performance liquid chromatography (HPLC) Subjects and methodology: “Vien nen dai trang 105” produced by 105 Hospital is analysed using the HPLC system with a column of RP18 (150 x 4.6 mm, µm), the wave length of 345 nm, the flow rate water of 1.2 ml/min, injection volume: 20 µl, a mixture of methanol- acetonitrile-acide phosphoric 0.1% with ratio (5:3:3) as mobile phase Results: This methodology ensures the specificity, compatibility, linearity, preciseness and repeatability The limitation of berberin chlorid in “Vien nen dai trang 105” found is 0.02 µg/ml As a result, the amount of berberin chlorid measured in “Vien nen dai trang 105” is 37.65 ± 1.02 (mg/pill) Conclusion: The methodology meets all the requirements and can be used to measure the amount of berberin chlorid in “Vien nen dai trang 105” * Key words: Berberin chlorid; “Vien nen dai trang 105”; High performance liquid chromatography * Bệnh viện Quân y 105 ** Bệnh viện Quân y *** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (drquang2000@yahoo.com) Ngày nhận bài: 24/12/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 12/01/2015 Ngày báo đăng: 26/01/2015 75 Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Đặt vấn đề “Viên nén đại tràng 105” đề tài Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục Hậu cần nghiên cứu phát triển từ thuốc y học cổ truyền để điều trị viêm đại tràng cấp mạn tính có hiệu Thành phần “Viên nén đại tràng 105” có kết hợp dược liệu hoạt chất từ dược liệu Hoàng đằng, cao Bồ giác, berberin chlorid…, đó, berberin chlorid chiếm tỷ lệ cao coi thành phần dược phẩm Berberin chlorid chiết xuất từ dược liệu Vàng đắng, Hồng liên,… [1, 2, 5], có tác dụng ức chế vi khuẩn Shigella, Bacillus cholerae, Staphylococus aureus…, tác dụng chống vi khuẩn tả Vibrio cholerae, tác dụng với lỵ amip Đặc biệt, dùng berberin điều trị nhiễm khuẩn đường ruột không ảnh hưởng đến phát triển hệ vi khuẩn có ích ruột [3, 9] Việc nghiên cứu định lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm, xây dựng công thức bào chế Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu định lượng berberin “Viên nén đại tràng 105” phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu thiết bị - “Viên nén đại tràng 105” sản xuất Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục Hậu cần - Hóa chất: acetonitril, methanol, axít phosphoric 0,1%, nước cất đạt tiêu chuẩn cho HPLC; chất chuẩn berberin chlorid 77 (Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, 99%); hóa chất dung mơi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu 10 Avp (Nhật Bản) gồm hệ bơm kênh dung môi, autosampler, detector UV, cột RP18 (150 x 4,6 mm, µm) bảo vệ cột loại - Dụng cụ: cân phân tích Sartorius (độ xác 0,1 mg) dụng cụ thí nghiệm khác Phương pháp nghiên cứu - Điều kiện sắc ký: + Cột: RP18 (150 x 4,6 mm, µm) + Bước sóng phát hiện: 345 nm + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút + Thể tích tiêm: 20 µl + Pha động: hỗn hợp methanol-acetonitrildung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3), thêm vào 100 ml hỗn hợp 0,1 g natri lauryl sulfat (TT) [4, 8, 9] - Phương pháp xử lý mẫu: + Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn pha cách hòa tan berberin chlorid chuẩn pha động để có nồng độ 30 µg/ml, lọc qua màng 0,45 µm thu dung dịch thử + Mẫu thử: cân lượng bột viên tương đương khoảng 15 mg berberin chlorid vào bình định mức 50 ml, hòa tan pha lỗng vừa đủ pha động (dung dịch A) Hút xác ml dung dịch A, pha loãng vừa đủ thành 25 ml với pha động, lọc qua màng 0,45 µm Dịch lọc dùng để tiêm mẫu + Mẫu trắng: pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 - Thẩm định phương pháp: với tiêu chí tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát [4, 7] 0.4 0.3 5.170 Tớnh c hiu Volts 0.2 Kết nghiên cøu vµ bµn luËn 0.0 Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu trắng Kết sắc ký đồ (SKĐ) cho thấy: mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mẫu chuẩn berberin chlorid; pic berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” mẫu thử rõ ràng, cân đối, tách hoàn toàn khỏi pic tạp Đồng thời, mẫu trắng khơng thấy xuất pic có thời gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn mẫu thử (hình 2, hình hình 4) Berberin 0.1 Minutes Hình 3: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu mẫu thử Tính tương thích Tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch mẫu chuẩn berberin chlorid có nồng độ khoảng 30 µg/ml vào hệ thống sắc ký Bảng 1: Tính tương thích hệ thống sắc ký 0.0100 0.0075 stt Thêi gian l-u (phót) DiƯn tÝch pic 5,175 2498965 5,172 2515328 5,173 2516250 5,172 2515583 5,170 2516382 5,167 2516104 TB 5,172 2513102 SD 0,003 6937,51 RSD% 0,05 0,28 Volts 0.0050 (Berberin) 0.0025 (µAU*s) 0.0000 Minutes Hình 1: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu mẫu trắng 0.3 Volts 0.2 Berberin 5.172 0.1 0.0 Minutes Hình 2: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu mẫu chuẩn berberin chlorid 78 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích pic berberin chlorid 0,05% 0,28% Như vậy, phương pháp phân tích hồn tồn phù hợp với hệ thống sắc ký Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Tính tuyến tính Pha dãy dung dịch chuẩn pha động có nồng độ berberin chlorid từ - 60 µg/ml Tiến hành sắc ký dung dịch theo điều kiện sắc ký nêu, lặp lại thí nghiệm lần Bảng 2: Kết khảo sát tính tuyến tính Nồng độ (àg/ml) Diện tích pic (mAU.s) 472499 10 939110 20 1828049 30 2730267 40 3677890 50 4789210 60 nồng độ berberin chlorid diện tích pic với hệ số tương quan r ≈ Khảo sát độ phương pháp Tiến hành phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu dung dịch mẫu tự tạo có nồng độ 20, 30, 40 µg/ml, nồng độ tiến hành thí nghiệm riêng biệt Tiến hành định lượng lại lượng chuẩn mẫu trên, từ tính tốn % thu hồi Bảng 3: Kết khảo sát độ phương pháp Nồng độ ban đầu (àg/ml) 20,12 20,34 5586820 20,68 Phương trình hồi quy: y = 93990x - 26295 Hệ số tương quan: r = 0,9995 29,82 Diện tích PIC 187606 187418 189298 275298 Diện tích pic (µAU.s) Đường hồi quy tuyến tinh diện tích pic Đường hồi quy tuyếnchlorid tính berberin diện nồngtích độ pic Berberin clorid nồng độ 6000000 y = 93990x - 26295 5000000 R2 = 0.999 4000000 30,12 3000000 40,56 30,36 281596 284979 377560 2000000 40,90 1000000 373518 Nồng độ thu hồi (àg/ml) 20,24 % thu hồi 100, 20,22 99,3 20,42 98,4 29,57 98,7 30,24 30,60 100, 101, 40,45 40,02 99,6 100, 0 20 40 60 80 Nồng độ (µg/m l) Hình 4: Đồ thị khảo sát tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic berberin chlorid Trong khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính chặt chẽ 79 40,23 371168 39,77 98,2 Trung bình 99,6 RSD (%) 1,07 Phương pháp có độ thu hồi berberin chlorid từ 98,2 - 101,2% (nằm giới hạn 98 -102%) với RSD 1,07% (nằm Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 giới hạn < 2%) Do đó, phương pháp đạt yêu cầu độ Độ lặp lại phương pháp xác định mẫu thử khác theo điều kiện sắc ký nêu Độ lặp lại Bảng 4: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp (n = 6) Mẫu Diện tích pic Hàm lượng berberin chlorid (mg) Thử Thử Thử Thử Thử Thử 3384720 3332455 3341579 3388796 3328205 3385202 15,12 14,89 14,93 15,14 14,87 15,12 Hàm lượng berberin chlorid trung bình = 15,01 (mg); RSD = 0,87 Hàm lượng berberin chlorid mẫu thử trung bình = 15,01 (mg), định lượng lặp lại với n = cho RSD% = 0,87% chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt Giới hạn phát (LOD) Pha loãng dần dung dịch chuẩn, tiêm vào hệ thống sắc ký Tại nồng độ berberin chlorid khoảng 0,02 µg/ml sắc ký đồ, pic berberin chlorid thu cân đối, riêng biệt Tỷ số S/N Như vậy, giá trị 0,02 µg/ml đáp ứng yêu cầu giới 186 35 hạn phát phương pháp 0 0 213 V o lt s 0 0 1 1796 0 0 B e r b e r in - 0 0 - 0 0 2 M in u te s Hình 6: Sắc ký đồ berberin chlorid LOD Kết định lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” 80 Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Từ phương pháp xây dựng, tiến hành xác định hàm lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” Kết cho thấy: hàm lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” 37,65 ± 1,02 (mg/viên) (n = 6) Kết luận Nguyễn Minh Đức Sắc ký lỏng hiệu Đã xây dựng phương pháp định lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” phương pháp HPLC Phương pháp xây dựng có tính đặc hiệu tính tương thích cao với hệ thống sắc ký, độ độ lặp lại đảm bảo yêu cầu phân tích, giới hạn phát berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” 0,02 µg/ml Hàm lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” 37,65 ± 1,02 (mg/viên) TÀI LIệU THAM KHảO Đỗ Huy Bích CS Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập II Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 2004, tr.1051-1054 Bộ Y tế Bài giảng Dược liệu Tập Nhà xuất Y học 2007, tr.96-98,102-104 Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất Y học 2009, tr.91-92 80 cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên Nhà xuất Y học Thành phố Hồ Chí Minh 2006, tr.138,148-149 Đỗ Tất Lợi Cây thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học 1999, tr.195 Web Cây thuốc quý 2007 Berberin www thuốc quý.info.vn ICH Validation of analytical procedures: text and methodology Q2R1 2005 Pharmacopoeia of the People’s Republic of China 2005, Vol III, pp.94-96 Tarte P S., Shedharkar G R Force degradation study of berberine chloride by using stability indicating HPLC method Int J PharmTech Res 2004, (5) pp.1490-1500 Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 80 ... Đức Sắc ký lỏng hiệu Đã xây dựng phương pháp định lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” phương pháp HPLC Phương pháp xây dựng có tính đặc hiệu tính tương thích cao với hệ thống sắc ký, ... chất lượng sản phẩm, xây dựng cơng thức bào chế Vì vậy, tiến hành nghiên cứu định lượng berberin “Viên nén đại tràng 105” phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên. .. quân số 2-2015 Từ phương pháp xây dựng, tiến hành xác định hàm lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” Kết cho thấy: hàm lượng berberin chlorid “Viên nén đại tràng 105” 37,65 ± 1,02 (mg/viên)