Bài viết nghiên cứu định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm, cũng như xây dựng công thức bào chế.
Trang 175
Nghiên cứu định lượng BERBERIN CHLORID trong
“viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hồ Cảnh Hậu*; Hoàng Văn Thêm*; Nguyễn Thị Lan Hương*
Nguyễn Văn Thuận**; Nguyễn Cẩm Vân***; Nguyễn Tuấn Quang***
Tóm tắt
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng berbein chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đối tượng và phương pháp: “Viên nén đại tràng 105”
do Bệnh viện Quân y 105 sản xuất được tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC với cột: RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 345 nm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha
động là hỗn hợp methanol-acetonitril-dung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3) Kết quả: phương
pháp xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng và độ lặp lại Giới hạn phát hiện của berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 0,02 µg/ml Áp dụng xác định hàm lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 37,65 ± 1,02 (mg/viên)
Kết luận: phương pháp xây dựng đảm bảo yêu cầu và có thể được dùng để định lượng
berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”
* Từ khóa: Berberin chlorid; “Viên nén đại tràng 105”; Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Quantitative Study on Berberin Chloride in “Vien nen dai trang 105”
by High Performace Liquid Chromatography
Summary
Objective: To establish the quantitative methodology measuring the amount of berberin chloride in “Vien nen dai trang 105” by high performance liquid chromatography (HPLC) Subjects and methodology: “Vien nen dai trang 105” produced by 105 Hospital is analysed using the HPLC system with a column of RP18 (150 x 4.6 mm, 5 µm), the wave length of 345 nm, the flow rate water of 1.2 ml/min, injection volume: 20 µl, a mixture of methanol- acetonitrile-acide
phosphoric 0.1% with ratio (5:3:3) as mobile phase Results: This methodology ensures the
specificity, compatibility, linearity, preciseness and repeatability The limitation of berberin chlorid in “Vien nen dai trang 105” found is 0.02 µg/ml As a result, the amount of berberin
chlorid measured in “Vien nen dai trang 105” is 37.65 ± 1.02 (mg/pill) Conclusion: The methodology
meets all the requirements and can be used to measure the amount of berberin chlorid in “Vien
nen dai trang 105”
* Key words: Berberin chlorid; “Vien nen dai trang 105”; High performance liquid chromatography
* Bệnh viện Quân y 105
** Bệnh viện Quân y 7
*** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (drquang2000@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 24/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 12/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 26/01/2015
Trang 277
Đặt vấn đề
“Viên nén đại tràng 105” là đề tài đang
được Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục
Hậu cần nghiên cứu phát triển từ bài
thuốc y học cổ truyền để điều trị viêm đại
tràng cấp và mạn tính rất có hiệu quả
Thành phần của “Viên nén đại tràng 105”
có sự kết hợp của các dược liệu và hoạt
chất từ dược liệu như Hoàng đằng, cao Bồ
giác, berberin chlorid…, trong đó, berberin
chlorid chiếm tỷ lệ khá cao và được coi là
thành phần chính của dược phẩm Berberin
chlorid được chiết xuất từ các dược liệu
như Vàng đắng, Hoàng liên,… [1, 2, 5],
có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn
Shigella, Bacillus cholerae, Staphylococus
aureus …, tác dụng chống vi khuẩn tả Vibrio
cholerae, tác dụng với lỵ amip Đặc biệt,
dùng berberin điều trị nhiễm khuẩn đường
ruột không ảnh hưởng đến sự phát triển
của hệ vi khuẩn có ích ở ruột [3, 9]
Việc nghiên cứu định lượng berberin
chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” góp
phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản
phẩm, cũng như xây dựng công thức bào
chế Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu định lượng berberin trong “Viên nén
đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp
nghiên cứu
1 Nguyên liệu và thiết bị
xuất tại Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục
Hậu cần
phosphoric 0,1%, nước cất đạt tiêu chuẩn
cho HPLC; chất chuẩn berberin chlorid
(Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, 99%); các hóa chất dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích
Shimadzu 10 Avp (Nhật Bản) gồm hệ bơm
4 kênh dung môi, autosampler, detector UV, cột RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và bảo vệ cột cùng loại
- Dụng cụ: cân phân tích Sartorius (độ chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ thí nghiệm khác
2 Phương pháp nghiên cứu
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột: RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) + Bước sóng phát hiện: 345 nm + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 20 µl
+ Pha động: hỗn hợp methanol-acetonitril- dung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3), thêm vào mỗi 100 ml hỗn hợp 0,1 g natri lauryl sulfat (TT) [4, 8, 9]
- Phương pháp xử lý mẫu:
+ Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn được pha bằng cách hòa tan berberin chlorid chuẩn trong pha động để có nồng độ 30 µg/ml, lọc qua màng 0,45 µm thu được dung dịch thử
+ Mẫu thử: cân chính lượng bột viên tương đương khoảng 15 mg berberin chlorid vào bình định mức 50 ml, hòa tan
và pha loãng vừa đủ bằng pha động (dung dịch A) Hút chính xác 3 ml dung dịch A, pha loãng vừa đủ thành 25 ml với pha động, lọc qua màng 0,45 µm Dịch lọc dùng để tiêm mẫu
+ Mẫu trắng: pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm
Trang 378
- Thẩm định phương pháp: với các tiêu
chí về tính đặc hiệu, tính tương thích, tính
tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn
phát hiện [4, 7]
KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn
1 Tính đặc hiệu
Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn,
mẫu thử và mẫu trắng Kết quả trên sắc
ký đồ (SKĐ) cho thấy: mẫu thử cho pic có
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu
của mẫu chuẩn berberin chlorid; pic của
berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng
105” ở mẫu thử rõ ràng, cân đối, tách
hoàn toàn khỏi pic tạp Đồng thời, mẫu
trắng không thấy xuất hiện pic có thời
gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn và
mẫu thử (hình 2, hình 3 và hình 4)
Minutes
0.0000
0.0025
0.0050
0.0075
0.0100
Hình 1: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu trắng
Minutes
0.0
0.1
0.2
0.3
Hình 2: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu chuẩn berberin chlorid
Minutes
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
Hình 3: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của
mẫu thử
2 Tính tương thích
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch mẫu chuẩn berberin chlorid có nồng độ khoảng 30 µg/ml vào hệ thống sắc ký
Bảng 1: Tính tương thích của hệ thống
sắc ký
(phót)
DiÖn tÝch pic (µAU*s)
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic berberin chlorid lần lượt là 0,05% và 0,28% Như vậy, phương pháp phân tích hoàn toàn phù hợp với hệ thống sắc ký
Trang 479
3 Tính tuyến tính
Pha một dãy các dung dịch chuẩn trong
pha động có nồng độ berberin chlorid từ
5 - 60 µg/ml Tiến hành sắc ký các dung
dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu, lặp lại
thí nghiệm 3 lần
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tuyến
tính
Phương trình hồi quy: y = 93990x - 26295
Hệ số tương quan: r = 0,9995
Hình 4: Đồ thị khảo sát sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic berberin chlorid
Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự
tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa
nồng độ berberin chlorid và diện tích pic với hệ số tương quan r ≈ 1
4 Khảo sát độ đúng của phương pháp
Tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu được các dung dịch mẫu tự tạo có nồng độ 20, 30,
40 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 thí nghiệm riêng biệt Tiến hành định lượng lại lượng chuẩn trong các mẫu trên, từ đó tính toán được % thu hồi
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của
phương pháp
Nồng độ ban đầu (àg/ml)
100,
2
100,
6
101,
2
100,
5
Phương pháp có độ thu hồi berberin chlorid từ 98,2 - 101,2% (nằm trong giới hạn 98 -102%) với RSD là 1,07% (nằm
Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic của
Berberin clorid và nồng độ
y = 93990x - 26295
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
Nồng độ (µg/ml)
Đường hồi quy tuyến tinh giữa diện tích pic của
berberin chlorid và nồng độ
Trang 580
trong giới hạn < 2%) Do đó, phương
pháp đạt yêu cầu về độ đúng
5 Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp được xác định trên 6 mẫu thử khác nhau theo các điều kiện sắc ký đã nêu
Bảng 4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp (n = 6)
Hàm lượng berberin
Hàm lượng berberin chlorid trung bình = 15,01 (mg); RSD = 0,87
Hàm lượng berberin chlorid trong mẫu thử trung bình = 15,01 (mg), định lượng lặp lại với n = 6 cho RSD% = 0,87% chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt
6 Giới hạn phát hiện (LOD)
Pha loãng dần dung dịch chuẩn, tiêm vào hệ thống sắc ký Tại nồng độ berberin chlorid khoảng 0,02 µg/ml thì trên sắc ký đồ, pic của berberin chlorid thu được vẫn cân đối, riêng biệt Tỷ số S/N là 6 Như vậy, giá trị 0,02 µg/ml đáp ứng được yêu cầu là giới hạn phát hiện của phương pháp
M in u te s
- 0 0 0 0 2
- 0 0 0 0 1
0 0 0 0 0
0 0 0 0 1
0 0 0 0 2
Hình 6: Sắc ký đồ của berberin chlorid tại LOD
7 Kết quả định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”
Trang 680
Từ phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” Kết quả cho thấy: hàm lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 37,65 ± 1,02 (mg/viên) (n = 6)
Kết luận
Đã xây dựng được phương pháp định
lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại
tràng 105” bằng phương pháp HPLC
Phương pháp xây dựng có tính đặc hiệu
và tính tương thích cao với hệ thống sắc
ký, độ đúng và độ lặp lại đảm bảo yêu
cầu phân tích, giới hạn phát hiện của
berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng
105” là 0,02 µg/ml Hàm lượng berberin
chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là
37,65 ± 1,02 (mg/viên)
TÀI LIệU THAM KHảO
1 Đỗ Huy Bích và CS Cây thuốc và động
vật làm thuốc ở Việt Nam Tập II Nhà xuất
bản Khoa học và Kỹ thuật 2004, tr.1051-1054
2 Bộ Y tế Bài giảng Dược liệu Tập 2
Nhà xuất bản Y học 2007, tr.96-98,102-104.
3 Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV Nhà
xuất bản Y học 2009, tr.91-92
4 Nguyễn Minh Đức Sắc ký lỏng hiệu
năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên Nhà xuất bản Y học Thành phố Hồ Chí Minh 2006, tr.138,148-149
5 Đỗ Tất Lợi Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam
Nhà xuất bản Y học 1999, tr.195
6 Web Cây thuốc quý 2007 Berberin www cây thuốc quý.info.vn
7 ICH Validation of analytical procedures:
text and methodology Q2R1 2005
8 Pharmacopoeia of the People’s Republic
of China 2005, Vol III, pp.94-96
9 Tarte P S., Shedharkar G R Force
degradation study of berberine chloride by using stability indicating HPLC method Int J PharmTech Res 2004, 6 (5) pp.1490-1500.
Trang 780