ĐẶT VẤN ĐỂ Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ngày càng tăng. Do vậy, thuốc đa thành phần ngày càng trở nên phổ biến, nhằm kết hợp tác dụng điều trị và thuận tiện hơn cho người sử dụng. Tuy nhiên, trong các dược điển hiện hành của nhiều nước chủ yếu chỉ có các chuyên luận cho các thuốc chứa một thành phần. Chính vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng thuốc có nhiều thành phần là rất cần thiết. Ascorin, một chế phẩm của hãng GLENMARK PHARMA (Ấn độ), là thuốc đa thành phần có công thức : Salbiitamol sulphattương đương với salbutamol 2 mg Bromhexin hydroclorid 8 mg Guaifenesin 100 mg Thuốc này đang được chuẩn bị nhập vào Việt Nam, công tác quản lý chất lượng đòi hỏi một phương pháp định lượng đơn giản, nhanh, phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm ở các trung tâm kiểm nghiệm. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định lượng salbutamol, guaifenesin, bromhexin hydroclorìd trong viên nén Ascorin (Ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định tính và định lượng ba thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc Ascorin thử nghiệm bằng phương pháp HPLC.
p m BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN HỮU VÃN ĐỊNH LƯỢNG SABUTAMOL, GUAIFENESIN, BROMHEXIN HYDROCLORID TRONG VIÊN NÉN ASCORIN (ẤN Độ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2001- 2006) Người hướng dẫn: Th.s Đặng Trần Phương Hồng PGS.TS Trần Tử An Nơi thực hiện: Phòng vật lý- Viện kiểm nghiệm Trường Đại học Dược Hà Nội íầ Hà nội, 5-2006 m % LỜI CẢM ƠN Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm. Trong quá trình thực hiện khoá luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình của các thầy, cô hướng dãn, các giảng viên của bộ môn Hoá phân tích và độc chất, và các cán bộ của phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế. Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - PGS-TS Trần Tử An - Chủ nhiệm bộ môn Hoá phân tích và độc chất - Trường đại học Dược Hà Nội. - Th.s Đặng Trần Phương Hồng - Trưởng phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế. Đã trực tiếp giúp đỡ tôi những tài liệu và hướng dẫn những kỹ năng cần thiết để tôi thực hiện khoá luận này. Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá phân tích và độc chất- Trường đại học Dược Hà Nội, các cán bộ của phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm đã giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận. Tôi xin cám ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo nhà trường tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện khoá luận này. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi trong học tập, cũng như trong quá trình thực hiện khoá luận. Hà nội, tháng 5-2006 Sinh viên Nguyễn Hữu Văn MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề 1 Phần 1- Tổng quan 2 1.1. Salbutamol 2 1.2. Bromhexin hydroclorid 3 1.3. Guaifenesin 4 1.4. Phương pháp HPLC 5 1.4.1. Khái quát chung 5 1.4.2. Nguyên tắc cấu tạ o 5 1.4.3. Các đại lượng đặc trưng 7 1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC 9 1.4.5. Pha động trong HPLC 10 1.4.6. Nguyên tắc lựa chọn pha động và pha tĩnh 11 1.4.7. Cách tính kết quả 12 1.5. Một số quy trình định lượng ba hoạt chất trên trong các chế phẩm đa thành phần 13 Phần 2- thực nghiệm và kết quả 15 2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 15 2.1.1. Hoá chất- Dụng cụ 15 2.1.2. Đối tượng- Nội dung- Phương pháp nghiên cứu 15 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 18 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 18 2.2.2. Thẩm định chương trình sắc ký 24 2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 24 2 2 2 2 . Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 25 2.2.2.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp 28 2.2.2.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp 31 2.3. So sánh hiệu quả của phưcỉng pháp tìm được với một số phương pháp định lượng đã được chấp nhận 37 2.4. Bàn luận về kết quả 42 Phần 3: Kết luân 43 CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BH : Bromhexin hydroclorid GU : Guaifenesin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao. SA Salbutamol SA.S Salbutamol sulfat STT Số thứ tự TB Trung bình USP Dược điển Mỹ ĐẶT VẤN ĐỂ Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ngày càng tăng. Do vậy, thuốc đa thành phần ngày càng trở nên phổ biến, nhằm kết hợp tác dụng điều trị và thuận tiện hơn cho người sử dụng. Tuy nhiên, trong các dược điển hiện hành của nhiều nước chủ yếu chỉ có các chuyên luận cho các thuốc chứa một thành phần. Chính vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng thuốc có nhiều thành phần là rất cần thiết. Ascorin, một chế phẩm của hãng GLENMARK PHARMA (Ấn độ), là thuốc đa thành phần có công thức : Salbiitamol sulphat tương đương với salbutamol 2 mg Bromhexin hydroclorid 8 mg Guaifenesin 100 mg Thuốc này đang được chuẩn bị nhập vào Việt Nam, công tác quản lý chất lượng đòi hỏi một phương pháp định lượng đơn giản, nhanh, phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm ở các trung tâm kiểm nghiệm. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định lượng salbutamol, guaifenesin, bromhexin hydroclorìd trong viên nén Ascorin (Ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ” với mục tiêu cụ thể sau: - Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định tính và định lượng ba thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc Ascorin thử nghiệm bằng phương pháp HPLC. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. SALBUTAMOL. 1.1.1. Công thức cấu tạo : [ 1] - Tên khác : Albuterol, Ventolin, Sultamol, Proventil. - Tên khoa học ; 1- (4’ - hydroxyl- 3’ - hydroxyl methyl- phenyl) - 2- tertbuthyl amino ethanol. Hoạt chất được sử dụng trong phương pháp định lượng là salbutamol sulfat. 1.1.2. Tính chất ( dạng muôi sulfat) [15]: - Bột kết tinh trắng, không mùi, vị hơi đắng. - Tan trong nước, ít tan hơn trong cồn, cloroform, ether. - Hấp thụ tử ngoại, cực đại hấp thụ ở 276 nm. 1.1.3. Một sô phương pháp định lượng: - Phương pháp HPLC. Bảng 1: Điều kiện định lượng SA bằng HPLC Cột Pha động (tỷ lệ) Detector ƯV(nm) Tốc độ dòng (ml/phút) Tài liệu CN (200 X 5 mm, 5 ụm) Nước- amoni acetat- isopropanol, (65 : 30 : 5) 276 1,0 [15] c 18 (150x 4,6 mm) (natri-l-hexan sulfonat 1,13 g và acid acetic 12 ml trong 1200 ml nước): methanol (60 : 40) 276 1,5 [19] RP 18 (250x5mm, 10 ụm) natri dihydrophosphat pH 3,1 ±0,05 : methanol, (85 : 15). 276 [18] Bảng 2: Điều kiện định lượng SA bằng phương pháp đo quang Mẫu trắng Bước sóng (nm) Aì% ^ ì cm Tài liệu Nước cất 276 59 [5] 1.2. BROMHEXIN HYDROCLORID. 1.2.1. Công thức cấu tạo [17]: C1 Tên khoa học : 2- amino- 3,5 - dibromo benzyl methyl cyclohexyl amin hydroclorid. 1.2.2. Tính chất [17]: - Trắng hay hầu như trắng. - Tan trong ethanol 95% và trong methanol, tan nhẹ trong cloroíorm, rất ít tan trong nước. 1.2.3. Một sô phương pháp định lượng : Bảng 3: Điều kiện định lượng BH bằng phương pháp đo quang Mẫu trắng Bước sóng (nm) Al% ^ I cm Tài liệu acid acetic 317 87 [17] ethanol 249 270 [18] 1.3. GUAIFENESIN. 1.3.1. Công thức hoá học [19]: 0 - Tên khoa học: 3- ( 2 -methoxy phenoxyl) - 1,2 propadiol. 1.3.2. Tính chất [19]: - Bột trắng hoặc gần như trắng, không mùi. - Tan trong ethanol 95%, cloroíorm, ít tan trong nước, ether. 1.3.3. Một sô phương pháp định lượng: Bảng 4: Điều kiện định lượng GU bằng HPLC Cột Pha động Detector ƯVịnm) Tốc độ dòng (mUphút) Tài liệu RP18 (250 X 4,6 mm, 10 |Jm) Nước- Methanol (55 : 45) 276 2,0 [19] 1.4. PHƯƠNG PHÁP HPLC. 1.4.1. Khái quát chung : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau. Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là một chất lỏng được bao trên một chất mang rắn, hoặc một chất mang rắn đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện gọi là detector. 1.4.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC [3]: Hệ thống kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính: - Bình chứa dung môi: Bình thường làm bằng thuỷ tinh, - Bơm cao áp: Bơm này có chức năng bơm dung môi vào cột để thực hiện quá trình tách. Bơm này được điều chỉnh áp suất để tạo ra được những tốc độ ổn định nhất của các chất cho phù hợp với quá trình sắc ký. - Van bơm mẫu : Van này để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Các van này có thể tích thay đổi, thường là 20, 50, 100 pl. [...]... trình sắc ký có thể định lượng đồng thời ba thành phần trên trong viên nén Ascorin 2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký: - Lựa chọn thành phần pha động: Dựa trên hàm lượng của các chất trong chế phẩm thì thấy SA có hàm lượng nhỏ nhất (2 mg), sau đó đến BH (8 mg) và lớn nhất là GU (100 mg) Vì vậy, chúng tôi định hướng sẽ tìm hệ pha động ưu tiên SA Theo Dược điển Anh [15], SA.S được định lượng bằng HPLC trong. .. mẫu được trình bày trong bảng cho thấy: Với chương trình sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng đồng thời SA, GU, BH có độ lặp lại cao, sai số tương đối của phương pháp nhỏ, của SA là 0,512%; của GU là 0,766% và của BH là 0,467% Kết quả này cho phép áp dụng chương trình để định lượng các thành phần hoạt chất trong công thức 2.2.2.4 Khảo sát độ đúng của phương pháp: Độ đúng của phương pháp được tiến hành... chuẩn - Phương pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử - Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất tương ứng các thành phần cần phân tích trong mẫu thử Tiến hành sắc ký cả hai... (250 X 4 mm, 5 Mm) trong methanol, pH=6,7 (Điều chỉnh pH bằng NaOH 0,1 N trong methanol), (2:8) * Kết luận: Theo các nghiên cứu trước đây, các tác giả sử dụng cả hai loại sắc ký là pha thuận (cột Si 60) và sắc ký pha đảo (cột RP 18) Như vậy, BH và GU có khả năng thích hợp với cả hai loại sắc ký này Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành trên cả sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo, dựa vào... chuẩn trong cùng một điều kiện sắc ký Kết quả được tính toán dựa vào sự tăng diện tích hoặc chiều cao pic - Phương pháp tính theo phần trăm diện tích pic: Hàm lượng phần trăm của các chất cần phân tích trong mẫu thử được tính bằng phần trăm diện tích pic của 12 nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ Phương pháp này chỉ đúng khi đáp ứng hai yêu cầu: Tất cả các chất trong mẫu... chính xác của phương pháp được tiến hành trên mẫu thử : * Xử lý mẫu th ử : Cân chính xác 20 viên nén Ascorin Tính khối lượng trung bình của một viên Sau đó mang nghiền nhỏ 20 viên nói trên thành bột mịn Cân chính xác lượng bột tương ứng với 1 viên nén vào bình định mức có nút mài 50 ml Thêm khoảng 30 ml pha động Lắc siêu âm trong thời gian 15 phút, rồi đem ra lọc thô qua giấy lọc thường (trong quá trình... SA, BH, và GU trong viên nén Ascorin Để xây dựng chương trình, chúng tôi khảo sát và lựa chọn các điều kiện : - Lựa chọn thành phần pha động - Cột tách sử dụng - Tốc độ dòng - Với detector u v sẵn có, chọn bước sóng thích hợp phát hiện và định lượng các chất • Thẩm định chương trình sắc ký đã xây dựng: Thẩm định chương trình sắc ký theo các thông số: - Tính thích hợp của hệ thống sắc ký - Độ tuyến... chính xác của phương pháp: Độ chính xác của phương pháp được biểu thị bằng độ lặp lại hay độ tái hiện Vì thời gian khảo sát trong một ngày, do cùng một người thực hiện trong cùng một điều kiện nên chúng tôi tiến hành khảo sát độ chính xác của phương pháp bằng độ lặp lại 28 Độ lặp lại được xác định dựa trên các dữ liệu của 6 phép thử song song trên cùng một mẫu, trong cùng một điều kiện, ở trong một thời... ì n n -\ Ẻ (^,-ĩF - Phương sai s^: - Sai số chuẩn: A^-1 = - Sai số tương đối: - Độ lệch chuẩn tương đối: 5” R S D (% ) = — 100 17 ' ^ 'ễ Ẽ ^ ' r ^ ỉĩí -J ^ ^ V X • \ ^ l „' - Khoảng tin cậy : // X_ 2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT Vì chưa có tiêu chuẩn định lượng đồng thời cả ba thành phần trong viên nén Ascorin, nên nhà sản xuất định lượng ba thành phần riêng biệt bằng phương pháp đo quang Nếu áp... sắc ký trong cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử Tương ứng với mỗi loại chất nhồi như thế người ta có một kỹ thuật sắc ký riêng HPLC • Điều kiện đối với một pha tĩnh : - Phải trơ và bền với các điều kiện của môi trường sắc ký - Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những điều kiện nhất định - Tính chất bề mặt phải ổn định, . HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN HỮU VÃN ĐỊNH LƯỢNG SABUTAMOL, GUAIFENESIN, BROMHEXIN HYDROCLORID TRONG VIÊN NÉN ASCORIN (ẤN Độ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược. tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định lượng salbutamol, guaifenesin, bromhexin hydroclorìd trong viên nén Ascorin (Ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ” với mục tiêu cụ thể sau: -. 10 |Jm) Nước- Methanol (55 : 45) 276 2,0 [19] 1.4. PHƯƠNG PHÁP HPLC. 1.4.1. Khái quát chung : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách dựa vào ái lực khác nhau của các chất với