Định tính, định lượng đồng thời acid salvianolic b, tanshinon iia bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc giáng chỉ ẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ VÂN ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID SALVIANOLIC B, TANSHINON IIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC GIÁNG CHỈ ẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ VÂN ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID SALVIANOLIC B, TANSHINON IIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC GIÁNG CHỈ ẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu, phịng Sau đại học, tồn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy bảo tạo điều kiện cho tơi có mơi trường học tập tốt suốt thời gian học tập, nghiên cứu Trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người thầy ln nhiệt tình giúp đỡ, hết lịng bảo trực tiếp hướng dẫn, định hướng, tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài, hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm đến ThS Nguyễn Thị Phượng Khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu giúp đỡ tơi trình nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ lipid thực nghiệm cao thuốc Giáng ẩm Tơi xin cảm ơn tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, giúp đỡ tạo điều kiện giúp hồn thành luận văn Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè tồn thể đồng nghiệp ủng hộ, động viên, giúp đỡ trong suốt trình thực luâ ̣n văn Do kiến thức thân cịn giới hạn, nên luận văn khơng tránh khỏi hạn chế thiếu sót Tơi mong nhận góp ý, chỉnh sửa quý thầy cô, bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2022 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phương pháp định tính, định lượng HPLC 1.1.1 Phương pháp HPLC 1.1.2 Ứng dụng phương pháp HPLC 1.1.3 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B Tan-IIA HPLC 1.2 Tổng quan lipid máu 1.2.1 Khái niệm lipid máu 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Con đường chuyển hóa tác dụng lipid thể 1.2.4 Bệnh lý rối loạn lipid máu 1.2.5 Hiện trạng nghiên cứu thuốc YHCT điều trị RLLPM 1.3 Mơ hình dược lý gây tăng lipid máu thực nghiệm 10 1.3.1 Mơ hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu nội sinh 10 1.3.2 Mơ hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu ngoại sinh 11 1.4 Phương thuốc Giáng ẩm 12 1.4.1 Công thức 12 1.4.2 Nguồn gốc xuất xứ phương thuốc 12 1.4.3 Công năng, chủ trị phương thuốc 12 1.5 Thông tin vị thuốc 13 1.5.1 Đan sâm 13 1.5.2 Câu kỷ tử 15 1.5.3 Hà thủ ô đỏ 16 1.5.4 Sơn tra 18 1.5.5 Thảo minh 19 1.6 Các nghiên cứu phương thuốc Giáng ẩm 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Động vật thí nghiệm 25 2.1.3 Thiết bị, máy móc 25 2.1.4 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B Tan-IIA cao đặc phương thuốc HPLC 27 2.2.2 Đánh giá tác dụng hạ lipid máu thực nghiệm cao đặc phương thuốc Giáng ẩm 32 2.3 Xử lí số liệu 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA cao đặc phương thuốc Giáng ẩm HPLC 35 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phương pháp chiết mẫu 35 3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thử 40 3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 40 3.1.4 Thẩm định quy trình định lượng 41 3.1.5 Định tính sắc ký lỏng hiệu cao 52 3.1.6 Định lượng Sal-B, Tan-IIA mẫu cao đặc 53 3.2 Đánh giá tác dụng hạ lipid máu thực nghiệm cao đặc phương thuốc Giáng ẩm 54 3.2.1 Ảnh hưởng cao chiết đến hàm lượng cholesterol toàn phần triglycerid toàn phần 54 3.2.2 Ảnh hưởng cao chiết đến hàm lượng HDL-C, non-HDL-C, LDL-C 57 CHƯƠNG BÀN LUẬN 61 4.1 Về định tính, định lượng đồng thời Sal-B Tan-IIA cao đặc phương thuốc Giáng ẩm 61 4.2 Về đánh giá tác dụng hạ lipid máu thực nghiệm 63 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.1.1 Về định tính, định lượng đồng thời Sal-B Tan-IIA cao đặc phương thuốc Giáng ẩm 67 5.1.2 Về đánh giá tác dụng hạ lipid máu thực nghiệm 68 5.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PL-1 1.1 Hàm ẩm vị dược liệu phương thuốc Giáng ẩm PL-1 1.2 Hàm ẩm cao đặc tỷ lệ trung bình cao khơ so với dược liệu khô kiệt PL-1 PHỤ LỤC PL-2 2.1 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm .PL-2 2.2 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Câu kỷ tử .PL-5 2.3 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Hà thủ ô .PL-7 2.4 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Sơn tra PL-9 2.5 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Thảo minh PL-10 PHỤ LỤC .PL-11 3.1 Chất chuẩn acid Salvianolic B PL-11 3.2 Chất chuẩn Tanshinon IIA PL-14 MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam DM/DL Dung môi/Dược liệu HDL-C HPLC IDL LDL-C High density lipoprotein cholesterol (Lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao) High performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) Intermediate density lipoprotein (Lipoprotein cholesterol tỷ trọng trung bình) Low density lipoprotein cholesterol (Lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) Non-HDL-C Non-High density lipoprotein cholesterol RLLPM Rối loạn lipid máu RSD Độ lệch chuẩn tương đối Sal-B Acid salvianolic B SKLM Sắc kí lớp mỏng TAG Triacylglycerol TC Cholesterol tồn phần TG Triglycerid toàn phần TT Thuốc thử Tan-IIA Tanshinon IIA VLDL YHCT Very low density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) Y học cổ truyền DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thuốc hóa chất sử dụng 26 Bảng 2.2 Liều dùng quy đổi chuột nhắt trắng 32 Bảng 3.1 Thời gian lưu pic Sal-B Tan-IIA nhiệt độ cột khác 37 Bảng 3.2 Diện tích pic Sal-B Tan-IIA chiết dung môi khác 39 Bảng 3.3 Diện tích pic Sal-B Tan-IIA chiết với nhiệt độ chiết khác 39 Bảng 3.4 Diện tích pic Sal-B Tan-IIA chiết với thời gian khác 40 Bảng 3.5 Kết độ thích hợp hệ thống Sal-B 43 Bảng 3.6 Kết độ thích hợp hệ thống Tan-IIA 44 Bảng 3.7 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng Sal-B 45 Bảng 3.8 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng Tan-IIA 46 Bảng 3.9 Độ lặp lại độ xác trung gian Sal-B 47 Bảng 3.10 Độ lặp lại độ xác trung gian Tan-IIA 48 Bảng 3.11 Kế t quả đô ̣ đúng Sal-B của phương pháp 49 Bảng 3.12 Kế t quả đô ̣ đúng Tan-IIA của phương pháp 50 Bảng 3.13 Thời gian lưu (RT) pic sắc ký đồ mẫu thử 53 Bảng 3.14 Kế t quả định lượng Sal-B Tan-IIA mẫu cao 54 Bảng 3.15 Ảnh hưởng cao chiết đến nồng độ TC TG 55 Bảng 3.16 Ảnh hưởng cao chiết đến nồng độ HDL-C, non-HDL-C, 57 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Các dược liệu phương thuốc Giáng ẩm 24 Hình 3.1 Hình ảnh phổ Sal-B Tan-IIA khoảng 230 - 350 nm 35 Hình 3.2 Sắc ký đồ Sal-B Tan-IIA với hệ pha động I (a), II (b), III (c) 36 Hình 3.3 Sắc ký đồ Sal-B Tan-IIA nhiệt độ cột 20℃ (a), 30℃ (b), 40℃ (c) 38 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu 41 Hình 3.5 Phổ mẫu thử mẫu chuẩn Sal-B 42 Hình 3.6 Phổ mẫu thử mẫu chuẩn Tan-IIA 42 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic Sal-B 45 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic TanIIA 46 Hình 3.9 Sắc ký đồ Sal-B LOD 51 Hình 3.10 Sắc ký đồ Tan-IIA LOD 52 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 52 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu cao đặc Giáng ẩm 53 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng cao chiết đến nồng độ TC (a), TG (b) 56 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng cao chiết đến nồng độ HDL-C (a), non-HDL-C (b), LDL- C (c) 59 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cấp độ toàn cầu 20 năm qua Số ca tử vong bệnh tim mạch tăng triệu người kể từ năm 2000, lên gần triệu người vào năm 2019, chiếm 16% tổng số ca tử vong nguyên nhân [73] Các yếu tố nguy gây nên bệnh tim mạch đột quỵ chế độ ăn uống không lành mạnh, lười vận động, sử dụng thuốc lá, chất kích thích Tác động yếu tố nguy biểu người tăng huyết áp, tăng đường huyết, rối loạn lipid máu (RLLPM) thừa cân, béo phì Như vậy, rối loạn lipid máu mục tiêu điều trị để phịng ngừa bệnh tim mạch Điều trị RLLPM phải kết hợp điều chỉnh lối sống điều trị thuốc Y học đại sử dụng nhóm thuốc statin, fibrate, resin chelate hóa, acid nicotinic, acid béo khơng no omega-3 có tác dụng hạ lipid máu nhanh, hiệu điều trị tốt kèm với tác dụng không mong muốn thuốc gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe sinh hoạt hàng ngày bệnh nhân đau đầu, chóng mặt, ngủ, rối loạn tiêu hóa, đau mỏi cơ, tiêu cơ,… [18], [23], [37] Vì vậy, xu hướng điều trị RLLPM ưu tiên sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên vừa có hiệu điều trị vừa hạn chế tác dụng không mong muốn thuốc tân dược Phương thuốc Giáng ẩm có xuất xứ từ sách “Thiên gia diệu phương” công ích âm, hóa ứ, giáng chỉ; chủ trị can thận âm hư, khí trệ, huyết ứ, lipid máu tăng [1], [26], biểu lưng gối đau mỏi, ngũ tâm phiền nhiệt, mệt mỏi, đầu choáng tai ù, tự hãn, miệng khô, họng [19] ứng dụng điều trị RLLPM Theo số tài liệu nghiên cứu chứng minh rằng, hai thành phần hóa học vị dược liệu Đan sâm có phương thuốc acid salvianolic B tanshinon IIA làm giảm nồng độ TC TG, LDL-C, tăng HDL-C máu có tác dụng làm hạ lipid máu [44], [58], [62], [65], [77] Vì việc định tính, định lượng hai hoạt chất có ý nghĩa quan trọng đánh giá chất lượng dược liệu hiệu điều trị phương thuốc PHỤ LỤC PHIẾU KIỂM NGHIỆM CÁC VỊ DƯỢC LIỆU CAO ĐẶC GIÁNG CHỈ ẨM 2.1 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm PL-2 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm PL-3 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm PL-4 2.2 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Câu kỷ tử PL-5 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Câu kỷ tử PL-6 2.3 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Hà thủ ô PL-7 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Hà Thủ ô đỏ PL-8 2.4 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Sơn tra PL-9 2.5 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Thảo minh PL-10 PHỤ LỤC 3.1 Chất chuẩn acid Salvianolic B PL-11 Chất chuẩn acid Salvianolic B PL-12 Chất chuẩn acid Salvianolic B PL-13 3.2 Chất chuẩn Tanshinon IIA PL-14 Chất chuẩn Tanshinon IIA PL-15 Chất chuẩn Tanshinon IIA PL-16 ... tính, định lượng đồng thời Sal-B Tan -IIA số mẫu cao đặc Giáng ẩm 31 2.2.2 Đánh giá tác dụng hạ lipid máu thực nghiệm cao đặc phương thuốc Giáng ẩm Đánh giá tác dụng hạ lipid máu phương thuốc Giáng. .. pháp sắc ký lỏng hiệu cao đánh giá tác dụng hạ lipid máu thực nghiệm cao đặc phương thuốc Giáng ẩm? ?? thực với mục tiêu sau: - Định tính, định lượng đồng thời acid salvianolic B tanshinon IIA cao đặc. .. đặc phương thuốc Giáng ẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - Đánh giá tác dụng hạ lipid máu thực nghiệm cao đặc phương thuốc Giáng ẩm mơ hình gây tăng lipid máu nội sinh CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phương