Xây dựng quy trình định lượng đồng thời diosmin và quercetin trong vi nhũ tương DQM bằng phương pháp HPLC-UV

Bài viết Xây dựng quy trình định lượng đồng thời diosmin và quercetin trong vi nhũ tương DQM bằng phương pháp HPLC-UV được nghiên cứu nhằm xây dựng phương pháp định lượng đồng thời diosmin và quercetin trong DQM bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

vietnam medical journal n01 - october - 2022 Độc tính phác đồ chủ yếu độc tính huyết học tăng men gan, tăng creatinin độ 1,2 Trong 41 bệnh nhân bệnh nhân biểu viêm phổi kẽ (1 bệnh nhân độ 1, bệnh nhân độ 4), bệnh nhân tăng glucose xuất độ khơng có định điều trị đái tháo đường Các tác dụng phụ miễn dịch suy giáp, cường giáp, suy tuyến thượng thận không ghi nhận nhiều bệnh nhân khơng theo dõi nồng độ hormon phần lớn độc tính nghiên cứu phần lớn xảy độ – 2, triệu chứng kín đáo tỷ lệ xuất thấp.4,5 V KẾT LUẬN Sự kết hợp pembrolizumab hóa chất có platinum cho tỷ lệ đáp ứng 61%, tỷ lệ kiểm soát bệnh 83% thời gian sống thêm bệnh không tiển triển cho bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IV với mPFS lên đến 11,9 tháng Độc tính phác đồ chủ yếu hệ huyết học, gan, thận với 10% trường hợp xảy độc tính độ 3,4 TÀI LIỆU THAM KHẢO Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries CA Cancer J Clin 2021;71(3):209-249 doi:10.3322/caac.21660 Bracci L, Schiavoni G, Sistigu A, Belardelli F Immune-based mechanisms of cytotoxic chemotherapy: implications for the design of novel and rationale-based combined treatments against cancer Cell Death Differ 2014;21(1):15-25 doi:10.1038/cdd.2013.67 Garon EB, Rizvi NA, Hui R, et al Pembrolizumab for the Treatment of Non–SmallCell Lung Cancer N Engl J Med 2015;372(21):2018-2028 doi:10.1056/NEJMoa1501824 Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non–Small-Cell Lung Cancer | NEJM Accessed August 13, 2022 https://www nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1810865 Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non–Small-Cell Lung Cancer | NEJM Accessed August 13, 2022 https:// www.nejm.org/doi/full/10.1056/nejmoa1801005 Socinski MA, Obasaju C, Gandara D, et al Current and Emergent Therapy Options for Advanced Squamous Cell Lung Cancer J Thorac Oncol Off Publ Int Assoc Study Lung Cancer 2018; 13(2):165-183 doi:10.1016/j.jtho.2017.11.111 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI DIOSMIN VÀ QUERCETIN TRONG VI NHŨ TƯƠNG DQM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-UV Vũ Lê Hà1, Võ Thanh Hóa2, Nguyễn Đức Hạnh1 TÓM TẮT 61 Diosmin quercetin hai hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm tăng cường thành mạch, nghiên cứu bào chế dạng hệ vi nhũ tương (DQM) dùng Nghiên cứu thực nhằm xây dựng phương pháp định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Các phương pháp chuẩn bị mẫu sàng lọc lựa chọn Phương pháp định lượng thẩm định theo hướng dẫn ICH tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính, độ xác độ Hỗn hợp dung môi gồm methanol (80%) dimethyl sulfoxid (20%) chọn để chiết đồng thời diosmin quercetin torng DQM Điều kiện HPLC chọn để xác định đồng thời diosmin quercetin gồm cột 1Đại 2Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Đức Hạnh Email: duchanh@ump.edu.vn Ngày nhận bài: 28.7.2022 Ngày phản biện khoa học: 19.9.2022 Ngày duyệt bài: 28.9.2022 252 Syncronis C18 (250 × 4,6 mm; μm), bước sóng phát 268 nm, nhiệt độ cột 30 ° C, tốc độ dòng 0,8 ml / phút thể tích tiêm 20 μl Pha động hỗn hợp acetonitril 0,2% axit fomic pha nước Tỷ lệ acetonitril tương ứng 31%, 35% 55% 0-2 phút, 3-4 phút 5-15 phút Giữa diện tích đỉnh nồng độ diosmin (r2 = 0,9991) nồng độ quercetin (r2 = 0,9988) có mối tương quan tuyến tính Giá trị % RSD độ xác trung gian diosmin quercetin 1,60% 0,60% Độ đạt yêu cầu với tỷ lệ phục hồi diosmin quercetin 98,47-103,40% 99,66 - 101,53% Phương pháp HPLC-UV định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương DQM xây dựng thẩm định thành công ứng dụng để kiểm sốt chất lượng DQM sản phẩm liên quan Từ khóa: HPLC, diosmin, quercetin, vi nhũ tương SUMMARY DEVELOPMENT OF AN HPLC-UV METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF DIOSMIN AND QUERCETIN IN DQM MICROEMULSION Diosmin and quercetin, two active ingredients possess the antioxidant, anti-inflammatory, and TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 519 - THÁNG 10 - SỐ - 2022 vascular wall strengthening effects, have been simultaneously developed as a microemulsion (DQM) for a topical product This study was carried out to develop a method for the simultaneous determination of diosmin and quercetin in DQM by high performance liquid chromatography (HPLC) The sample preparation methods were screened and selected The HPLC method was validated according to the ICH guidelines for its specificity, system suitability, linearity, precision, and accuracy The sample preparation method was selected using a mixture of methanol (80%) and dimethyl sulfoxide (20%) as solvent for the simultaneous extraction of diosmin and quercetin The best HPLC condition for the simultaneous determination of diosmin and quercetin employed a Syncronis C18 column (250 × 4.6 mm; μm), a detection wavelength of 268 nm, a column temperature of 30 °C, a flow rate of 0.8 ml/min and an injection volume of 20 μl The mobile phase was a mixture of acetonitrile and 0.2% formic acid in water in gradient mode The ratios of acetonitrile were 31%, 35% and 55% at 0-2 min, 3-4 and 5-15 min, respesctively The good correlations were found between peak areas and diosmin concentrations (r2 = 0.9991) or quercetin concentration (r2 = 0.9988) The % RSD values of inter-day precision of diosmin and quercetin were 1.60% and 0.60%, respectively The recovery percentages of diosmin and quercetin were 98.47-103.40 % and 99.66 – 101.53%, respectively The HPLC-UV method for simultaneous quantification of diosmin and quercetin in DQM microemulsions has been reported for the first time The quantitation method met the requirements of validation and could be useful for quality control of DQM and its related products Keywords: HPLC, diosmin, quercetin, microemulsion I ĐẶT VẤN ĐỀ Diosmin quercetin (Hình 1) hai hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, có tác dụng chống oxy hoá, kháng viêm, làm bền thành mạch [2] Tuy nhiên, hai hoạt chất diosmin quercetin có độ tan nước [3,4] Vì vậy, diosmin quercetin nghiên cứu phối hợp bào chế dạng vi nhũ tương (DQM) để cải thiện độ tan làm tăng sinh khả dụng [1] hoạt chất, hướng tới mục tiêu phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị suy giãn tĩnh mạch (a) (b) Hình Cấu trúc hóa học (a) diosmin (b) quercetin Việc kiểm soát đồng thời hàm lượng hoạt chất diosmin quercetin trình bào chế đảm bảo chất lượng sản phẩm vi nhũ tương nhu cầu cấp thiết trình nghiên cứu phát triển sản phẩm Vì vậy, nghiên cứu thực với mục tiêu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương phương pháp HPLC II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nguyên liệu Diosmin chuẩn làm việc (hàm lượng 98,51%) quercetin chuẩn làm việc (hàm lượng 98,92%) cung cấp Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Acetonitril (Macron, Hà Lan) nước cất lần đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC Methanol (Merck, Đức) dimethyl sulfoxide (DMSO) đạt tiêu chuẩn phân tích Khảo sát điều kiện HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương Khảo sát điều kiện HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Azura, detector UV- Vis (Đức) Cột sắc ký C18 Syncronis TM (250 x 4,6 mm; μm) tiền cột HQ 105 C18 (10 x 4,6 mm; µm) (Thermo Scientific, Mỹ) Nhiệt độ cột 30 oC, bước sóng phát 268 nm, thể tích tiêm mẫu 20 μl, tốc độ dòng 0,8 ml/phút Thăm dò số điều kiện pha động (Bảng 1) Chọn điều kiện HPLC cho pic diosmin pic quercetin tách hoàn toàn khỏi pic tạp mẫu thử thông số sắc ký đạt yêu cầu Bảng Các pha động khảo sát điều kiện định lượng đồng thời diosmin quercetin Điều kiện I Điều kiện II Điều kiện III Điều kiện IV Thời gian (phút) Nước cất Acid formic 0,2% Aceto nitril 0-12 70 - 30 0-12 45 - 55 12 12 69 69 65 65 45 45 - 69 69 65 65 45 45 31 31 35 35 55 55 31 31 35 35 55 55 253 vietnam medical journal n01 - october - 2022 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Chọn loại dung môi chuẩn bị mẫu thử Mẫu thử chuẩn bị với dung mơi methanol: Cân xác khoảng 0,0714 g vi nhũ tương chứa diosmin quercetin vào bình định mức 5ml, thêm khoảng ml dung môi methanol, siêu âm 10 phút, bổ sung dung mơi methanol tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 µm Mẫu thử chuẩn bị với dung môi methanol: DMSO (8:2): Tiến hành tương tự cách điều chế mẫu thử chuẩn bị với dung môi methanol sử dụng dung môi hỗn hợp methanol:DMSO (8:2) So sánh hàm lượng diosmin quercetin mẫu thử chuẩn bị dung môi khác sử dụng phương pháp HPLC theo điều kiện sắc ký chọn Dựa vào kết HPLC, lựa chọn loại dung môi chiết tốt đồng thời diosmin quercetin Chọn tỷ lệ pha loãng vi nhũ tương dung môi chuẩn bị mẫu thử Dùng dung môi chiết xuất chọn để tiếp tục khảo sát chọn tỷ lệ pha loãng vi nhũ tương để chuẩn bị mẫu thử Tiến hành thực nghiệm với tỷ lệ sau: − Tỷ lệ (pha lỗng 100 lần): Cân xác khoảng 0,05 g vi nhũ tương chứa diosmin quercetin vào bình định mức ml, thêm khoảng ml dung môi chọn, siêu âm 10 phút, bổ sung dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 µm − Tỷ lệ (pha lỗng 70 lần): Cân xác khoảng 0,07 g vi nhũ tương chứa diosmin quercetin vào bình định mức ml, thêm khoảng ml dung môi chọn, siêu âm 10 phút, bổ sung dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 µm Chuẩn bị mẫu thử riêng biệt cho tỷ lệ khảo sát So sánh khả chiết diosmin quercetin tỉ lệ khảo sát phương pháp HPLC theo điều kiện sắc ký chọn Thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương Quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương thẩm định theo hướng dẫn ICH tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ [5] III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương Kết khảo sát điều kiện pha động HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương trình bày Hình Hình Sắc ký đồ HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương với điều kiện pha động khác Hình cho thấy điều kiện I không rửa giải pic diosmin quercetin sau 12 phút Ở điều kiện II rửa giải quercetin, nhiên độ phân giải pic diosmin chưa tốt Điều kiện III pic diosmin cịn dính với pic tạp Điều kiện IV tách pic diosmin quercetin khỏi pic tạp, đồng thời pic diosmin quercetin đạt yêu cầu độ phân giải Vì 254 vậy, chọn điều kiện IV làm hệ dung môi rửa giải để định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương Khảo sát quy trình xử lý mẫu Chọn loại dung mơi chuẩn bị mẫu thử Kết HPLC khảo sát dung môi chuẩn bị mẫu thử trình bày Hình TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 519 - THÁNG 10 - SỐ - 2022 Hình Kết HPLC khảo sát dung môi chuẩn bị mẫu thử (a) methanol (b) hỗn hợp methanol: DMSO (8:2) Hình cho thấy sử dụng dung môi methanol để điều chế mẫu thử, lượng diosmin tìm thấy thấp pic diosmin có độ phân giải so với trường hợp sử dụng hỗn hợp methanol: DMSO (8:2) Vì vậy, hỗn hợp methanol: DMSO (8:2) chọn làm dung môi để điều chế mẫu thử Chọn tỷ lệ pha loãng vi nhũ tương dung môi chuẩn bị mẫu thử Kết hàm lượng diosmin quercetin xác định với hai tỷ lệ pha lỗng khảo sát trình bày Bảng Bảng Hàm lượng diosmin quercetin xác định với hai tỷ lệ pha loãng khảo sát Tỷ lệ pha loãng VNT (lần) 100 70 Hàm lượng diosmin VNT (%, kl/kl) 0,005 ± 0,002 0,005 ± 0,001 Bảng cho thấy hàm lượng diosmin quercetin chiết với tỉ lệ pha loãng VNT dung mơi khảo sát khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, tăng tỷ lệ pha loãng vi nhũ tương, tăng lượng dung môi chiết xuất từ 70 đến 100 lần, lượng diosmin quercetin chiết không tăng thêm Vậy, tỷ lệ pha loãng VNT chọn 70 lần Quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác khoảng 0,0714 g vi nhũ tương chứa diosmin quercetin vào bình định mức ml, thêm khoảng ml dung môi methanol:DMSO (8:2), siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 µm Điều kiện HPLC: Máy HPLC Azura detector UV- Vis, cột sắc ký C18 Syncronis TM (250 x 4,6 mm; μm) tiền cột HQ 105 C18 (10 x 4,6 Hàm lượng quercetin VNT (%,kl/kl) 0,01 ± 0,002 0,01 ± 0,001 mm; µm), nhiệt độ cột 30 oC, bước sóng phát 268 nm, thể tích tiêm mẫu 20 μl Pha động gồm acetonitril dung dịch acid formic 0,2 % tỷ lệ theo điều kiện IV (Bảng 1) Hàm lượng diosmin quercetin (%) vi nhũ tương tính theo cơng thức: St, Sc: Diện tích pic diosmin (hoặc quercetin) mẫu thử mẫu chuẩn C: Nồng độ dung dịch diosmin (hoặc quercetin) chuẩn (µg/ml) m: Khối lượng vi nhũ tương (mg) Thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương Tính tương thích hệ thống Kết khảo sát tính tương thích hệ thống trình bày Bảng Bảng Tính tương thích hệ thống phương pháp định lượng đồng thời diosmin quercetin STT TB %RSD tR (phút) 4,73 4,63 4,67 4,62 4,77 4,70 4,69 1,24 S (mAU.s) 26,53 26,19 27,01 26,74 26,37 26,76 26,60 1,12 Diosmin RS1 1,57 1,56 1,74 1,61 1,65 1,53 1,61 RS2 1,67 1,54 1,52 2,03 1,64 1,89 1,72 As 1,12 1,13 1,14 1,15 1,20 1,13 1,15 N 27074 22462 25096 27439 24764 22763 24933 255 vietnam medical journal n01 - october - 2022 Quercetin STT tR (phút) S (mAU.s) RS1 RS2 As N 9,33 132,32 1,68 1,78 1,12 112280 9,57 127,11 1,67 1,72 1,14 112673 9,18 129,62 1,77 1,90 1,20 112280 9,28 128,82 1,68 1,75 1,15 112673 9,27 130,45 1,90 1,64 1,18 100421 9,10 130,03 1,74 1,51 1,16 111889 TB 9,29 129,73 1,74 1,72 1,16 110369,3 % RSD 1,71 1,34 Yêu cầu RSD