XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRỊNH HƯƠNG GIANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC HÀ NỘI – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRỊNH HƯƠNG GIANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN A TRONG BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Chử Văn Mến HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, ban Giám đốc Học viện Quân y, phòng Đào tạo, hệ quản lý học viên Dân sự, trung tâm thử nghiệm lâm sàng tương đương sinh học – Viện nghiên cứu y dược học quân - Học viện Quân y quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để học tập suốt năm qua thực khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy: PGS.TS Chử Văn Mến Là người thầy tận tình hướng dẫn khoa học, giảng dạy kiến thức kinh nghiệm thực tế quý báu cho em trình học tập, nghiên cứu thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Trịnh Nam Trung – Viện trưởng Viện Đào tạo Dược, DS Nguyễn Thị Thanh Hằng toàn thể thầy giáo, cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Kiểm nghiệm – Độc chất môn khác thuộc trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em tiến hành nghiên cứu, học tập để hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người đồng hành, ủng hộ động viên em trình học tập q trình thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Trịnh Hương Giang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 BÀI THUỐC NHẤT GAN LINH 1.2 TỔNG QUAN VỀ BERBERIN VÀ SAIKOSAPONIN 1.2.1 Hợp chất Berberin (BER) 1.2.2 Hợp chất Saikosaponin A (SAIKO) 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN TÍCH SAIKOSAPONIN VÀ BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.3.1 Một số nghiên cứu phân tích thành phần BER hoàng bá HPLC 1.3.2 Một số nghiên cứu phân tích thành phần SAIKO sài hồ HPLC 10 1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 11 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 11 1.4.2 Các thông số đặc trưng trình sắc ký 11 1.4.3 Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao thường dùng .14 1.4.4 Thẩm định quy trình phân tích 14 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU .19 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Nguyên vật liệu .19 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 19 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu .19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO 20 2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO 21 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu .23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .24 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 24 3.1.1 Kết xây dựng phương pháp định lượng 24 3.1.2 Kết thẩm định phương pháp định lượng 27 3.2 BÀN LUẬN 36 3.2.1 Về phương pháp xử lý mẫu 36 3.2.2 Về lựa chọn điều kiện sắc ký 37 3.2.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký 38 3.3 VỀ KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 39 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Thành phần thuốc Nhất gan linh 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng nghiên cứu 18 3.1 Chương trình 23 3.2 Chương trình 23 3.3 Chương trình dung mơi pha động 26 3.4 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 27 3.5 Diện tích pic nồng độ dung dịch chuẩn BER SAIKO 29 3.6 Kết đánh giá độ xác ngày khác ngày 31 3.7 Kết khảo sát độ 33 3.8 Kết khảo sát LOD, LLOQ 34 3.9 Một số phương pháp xử lý mẫu BER SAIKO 37 3.10 So sánh số điều kiện kết phân tích BER, SAIKO HPLC 39 DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình Trang 1.1 Cơng thức hóa học Berberin 1.2 Cơng thức hóa học Saikosaponin A 3.1 SKĐ với chương trình (a) chương trình (b) 11 3.2 SKĐ tốc độ dòng 0,2mL/phút (a) 0,3mL/phút (b) 24 3.3 Kết khảo sát độ chọn lọc - đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng (a), SKĐ mẫu thử (b), SKĐ mẫu chuẩn (c) 25 3.4 Đường chuẩn thể mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ BER SAIKO 29 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ Chữ viết tắt ACN Acetonitrile BER Berberin CS Cộng DĐVN V DMF DMSO HPLC ICH LLOQ Dược điển Việt Nam V Dimethylformamide Dimethyl sulfoxide High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) International Conference Harmonization Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol NGL Nhất gan linh RSD Độ lệch chuẩn tương đối SAIKO Saikosaponin SKĐ Sắc ký đồ TCCS Tiêu chuẩn sở TFA YHCT Acid trifluoroacetic Y học cổ truyền ĐẶT VẤN ĐỀ Y học đại y học cổ truyền Việt Nam nỗ lực tìm phương pháp, nghiên cứu để điều trị xơ gan Có nhiều vị thuốc, thuốc có giá trị điều trị xơ gan ứng dụng điều trị có hiệu Tuy nhiên, điều trị cịn cục bộ, chưa có phương pháp chung để lượng giá, đánh giá theo y học đại, chưa thống phương pháp chẩn đoán, điều trị bệnh theo y học cổ truyền Bài thuốc Nhất gan linh kết hợp vị thuốc kết hợp hai cổ phương "Nhất quán tiễn" "Trư linh thang" đồng thời gia, giảm thêm số vị thuốc Từ năm 2013 đến năm 2017, Viện YHCT Quân đội sử dụng thuốc Nhất gan linh dạng thuốc sắc điều trị cho 86 bệnh nhân xơ gan đạt hiệu tốt [5] Tuy nhiên đường dùng phức tạp, bệnh nhân phải nằm nội trú để điều trị nên tỷ lệ bệnh nhân điều trị khơng nhiều Ngồi ra, sử dụng dạng thuốc sắc gặp phải hạn chế thuốc YHCT sử dụng phương pháp sắc truyền thống chiết nước nên không chiết kiệt gia nhiệt cao làm hoạt chất bị phân hủy, …Vì vậy, việc chuyển thuốc NGL sang dạng bào chế đại có ý nghĩa quan trọng, giải nhược điểm trên, đồng thời góp phần tăng hiệu điều trị sử dụng cho bệnh nhân điều trị ngoại trú Những nghiên cứu gần cho thấy, thành phần berberin Hoàng bá saikosaponin sài hồ có tác dụng bảo vệ gan điều trị bệnh gan [5,6,10] Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân tích đồng thời berberin saikosaponin hạn chế, có số nghiên cứu nhằm phát có mặt chúng thuốc cổ truyền Trung Quốc Do vậy, để phục vụ nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến vào chuyển dạng bào chế thuốc Nhất gan linh, tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình định lượng 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Về phương pháp xử lý mẫu Bảng Một số phương pháp xử lý mẫu BER SAIKO STT Tác giả Đề tài khóa luận In-Seon Park CS [27] Jung Won Choi CS [28] Mục đích phân tích Dung Phương mơi, tỉ lệ pháp dung môi/ chiết nguyên liệu Định lượng đồng thời BER SAIKO Siêu âm thuốc NGL Định lượng Saikosaponin A Sài hồ Ngâm Định lượng đồng thời dẫn xuất saikosaponin Siêu âm Sài hồ Định lượng Berberin Theo thuốc J.V.Srinivasan YHCT Soxhlet CS [29] Dược điển Việt Nam V [30] Định lượng đồng thời berberin clorid palmitin clorid Siêu âm Hoàng bá 38 Thời gian chiết/ lần Methanol 10/1 2h/lần Ethanol 35/1 7h Ethanol 70% 8/1 2h, chiết lần Methanol 10/1 12h Methanol 250/1 30 phút Để định lượng xác hàm lượng BER SAIKO thuốc NGL, dung môi phương pháp chiết xuất phải đảm bảo chiết kiệt hoạt chất Để phân tích thành phần BER SAIKO, tác giả sử dụng phương pháp chiết xuất khác (bảng 4.1) Qua bảng 3.9 cho thấy, tác giả Jung Won Choi CS [28] Dược điển Việt Nam V [30] sử dụng phương pháp chiết siêu âm, dung môi Methanol/ Ethanol Bài thuốc NGL bào chế dạng viên nang Do để phục vụ nghiên cứu đánh giá tác dụng dược lý thuốc, việc chiết Methanol hợp lý Đối với nghiên cứu định lượng BER SAIKO, tác giả sử dụng dung môi Methanol/ Ethanol Việc sử dụng dung mơi có khả hịa tan tốt hay phương pháp chiết phù hợp, hiệu chiết xuất tăng, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu Do vậy, để định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL, nghiên cứu sử dụng dung môi MeOH, phương pháp siêu âm để chiết xuất phù hợp với nghiên cứu công bố 3.2.2 Về lựa chọn điều kiện sắc ký Nhiều nghiên cứu phân tích thành phần có tác dụng sinh học Hồng bá, Sài hồ, hay định tính hợp chất thuốc YHCT lựa chọn cột sắc ký loại C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm Kết cho thấy, nghiên cứu In-Seon Park CS [27] định lượng đồng thời chất Sài hồ, Dược điển Việt Nam V [30] định lượng đồng thời chất đại hoàng, điều cho thấy khả phân tách hợp chất cột C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm tốt, pic chất phân tích mẫu chuẩn cân đối, sắc nét, mẫu thử tách hồn tồn khỏi pic tạp Do đó, nghiên cứu lựa chọn loại cột sắc ký C18 1,7micromet; 2,1 x 100mm Bên cạnh cố định loại cột sắc ký, đề tài cố định số điều kiện khác gồm: loại dung môi pha động, thể tích tiêm 10μL, nhiệt độ cột 30ºC nhằm giảm thời gian chi phí nghiên cứu 39 3.2.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký Bảng 3.10 So sánh số điều kiện kết phân tích BER, SAIKO HPLC STT Tác giả Dung môi Thời gian lưu (phút) Tốc độ dòng (mL/ phút) BER Thời gian phân tích SAIKO mẫu (phút) Đề tài khóa luận ACN/ acid phosphoric 0,01% 0,2 8,77 11,49 15 In-Seon Park CS [27] ACN/ nước - 12,20 40 Jung Won Choi CS [28] ACN/ nước 1,1 - 30,70 60 Theo J.V.Srinivasan CS [29] ACN/ nước 0,6 8,89 - 30 Theo Kalma CS [8] ACN/ acid orthophosphoric 0,05% 10,08 - 25 Theo Lin Ma CS [12] ACN/ triethanolamine 0,3% 8,82 - 15 Qua bảng so sánh kết nghiên cứu (bảng 3.10) cho thấy: 40 Nghiên cứu định lượng SAIKO Sài hồ, In-Seon Park CS [27] định lượng SAIKO kết thời gian lưu SAIKO 12,20 phút với thời gian phân tích mẫu 40 phút, hay Jung Won Choi CS [28] định lượng SAIKO kết thời gian lưu SAIKO 30,70 phút với thời gian phân tích mẫu 60 phút Nghiên cứu định lượng BER Hoàng bá, J.V.Srinivasan CS [29] định lượng BER kết thời gian lưu BER 8,89 phút, Kalma CS [9] định lượng BER kết thời gian lưu BER 10,08 phút, hay Lin Ma CS [12] định lượng BER kết thời gian lưu BER 8,82 phút Như vậy, nghiên cứu BER hoàng bá SAIKO Sài hồ có kết thời gian lưu lớn, thời gian phân tích mẫu kéo dài, gây tốn thời gian chi phí phân tích Trong đó, phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL nghiên cứu cho thời gian lưu BER SAIKO 8,77 11,49 phút, rút ngắn thời gian phân tích mẫu cịn 15 phút, tiết kiệm thời gian chi phí cho việc phân tích nghiên cứu Ngoài ra, điều kiện khác mà nghiên cứu khảo sát tốc độ dòng pha động Đề tài lựa chọn khảo sát tốc độ dịng nhằm đánh giá ảnh hưởng đến kết phân tích Kết thực tế cho thấy, so với tốc độ dòng 0,3 mL/phút, tốc độ dòng 0,2 mL/phút cho pic có đỉnh nhọn đáy hẹp hơn, pic thử tách hồn tồn khỏi pic tạp, pic khơng có tượng dính Do đó, đề tài lựa chọn tốc độ dòng pha động 0,2 mL/phút 3.3 VỀ KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Phương pháp định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn ICH với tiêu: Tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ xác Phương pháp định lượng có khoảng nồng độ tuyến tính khoảng 5,0 – 50,0 μg/mL, đảm bảo phân tích mẫu với nồng độ chất phân tích khác 41 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu, rút kết luận sau: Đã xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL Đã lựa chọn điều kiện sắc ký gồm: Cột: Acquity UPLC BEH C18 1,7micromet; 2,1 × 100mm (Mỹ), detector PDA, bước sóng 210nm, tốc độ pha động: 0,2 mL/phút, thể tích tiêm mẫu: 10μL, nhiệt độ cột: 30ºC, dung môi pha động 0,01% acid phosphoric/ ACN với chương trình sau: Thời gian (phút) 0,01% Acid phosphoric % ACN 0,00 → 10,20 90 10 10,20 → 11,90 55 45 11,90 → 12,00 45 55 12,00 → 15,00 90 10 Đã thẩm định quy trình định lượng đồng thời BER SAIKO thuốc NGL Phương pháp định lượng thẩm định đáp ứng đầy đủ yêu cầu tính tương thích hệ thống, độ chọn lọc – đặc hiệu, khoảng tuyến tính từ 5,0 – 50,0 μg/mL, giới hạn phát BER SAIKO 0,124 μg/mL 0,625 μg/mL, giới hạn định lượng BER SAIKO 0,377 μg/mL 1,895 μg/mL, độ cao (độ thu hồi từ 98,13% 102,37% BER từ 98,73% - 103,57% SAIKO, độ xác cao (giá trị RSD BER SAIKO < 2%) 42 KIẾN NGHỊ Sau hoàn thành đề tài, kiến nghị số vấn đề sau: - Nghiên cứu khảo sát, xây dựng quy trình chiết xuất hoạt chất từ thuốc NGL - Bào chế bán thành phẩm, khảo sát tính an tồn, tác dụng thuốc NGL 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Quốc Anh, Ngô Quý Châu (2012), “Xơ gan”, Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr 494-497 Đại học Y Hà Nội (2011), “Viêm gan B”, Điều trị học Nội khoa Tập I, nhà xuất Y học, tr 197 -199 Bộ Y tế (2014), “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan vi rút B”, (Ban hành kèm theo Quyết định số 5448/QĐ-BYT ngày 30 tháng 12 năm 2014 Bộ trưởng Bộ Y tế) Hải Thượng Lãn Ơng Lê Hữu Trác (2008), Hải Thượng Y tơng tâm lĩnh tập 2, NXB Y học Trần Văn Kỳ (2013), Dược học cổ truyền, Nhà xuất Đà Nẵng Liu C.T., Chuang P.T., Wu C.Y., et al (2006), Antioxidative and in vitro hepatoprotective activity of bupleurum kaoi leaf infusion. Phytother Res PTR, tr 1003–1008 Aoxue Liu, Tongtong Xu Wenning Yang (2021), Quantitative Determination of Saikosaponins in Xiaochaihu Granules Using HighPerformance Liquid Chromatography with Charged Aerosol Detection Journal of Analytical Methods in Chemistry, tr 65-69 G.A Akowuah cộng (2014), Evaluation of HPLC and Spectrophotometric Methods for Analysis of Bioactive Constituent Berberine in Stem Extracts of Coscinium fenestratum, Acta Chromatographica 26(2), tr 243–254 Kamal Yt, Mhaveer Singh Ennus Tajuddin Tamboli (2011), Quantitative Analysis of Berberine in Berberis aristata Fruits and in a Traditional Anti-Inflammatory Unani Formulation by Use of a Validated HPLC Method Acta Chromatographica 23(1), tr 157-168 10 L.A Baltina cộng (2015), Glycyrrhizic acid derivatives as influenza A/H1N1 virus inhibitors, Bioorg Med Chem Lett 25, tr 1742-1746 44 11 Li, X Q cộng (2005), High performance liquid chromatographic assay of saikosaponins from radix Bupleuri in China, Biol Pharm Bull 28(9), tr 1736-1742 12 Lin Ma, Jun-qing Li Yuan-dong Hu (2015), Determination of berberine in Phellodendron amurense from different sites of Changbai Mountain Journal of Forestry Research 26(1), tr 201–207 13 Maria A Neag cộng (2018), Berberine: Botanical Occurrence, Traditional Uses, Extraction Methods, and Relevance in Cardiovascular, Metabolic, Hepatic, and Renal Disorders, The research topic 9, tr 557 14 Sung Ok Kim, Ji Yeoung Park, Seo Young Jeon, (2015), Saikosaponin a, an active compound of Radix Bupleuri, attenuates inflammation in hypertrophied 3T3-L1 adipocytes via ERK/NF-κB signaling pathway, International Journal of Molecular Medicine, tr 1126-1132 15 U.S National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information (2018), “Berberine” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7843460/, truy cập ngày 15 tháng năm 2018 16 U.S National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information (2018), "Saikosaponin A" https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6126128/, truy cập ngày 23 tháng năm 2018 17 Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học), Nhà xuất giáo dục Việt Nam, tr.135-184 18 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr.10-59 19 Vụ khoa học đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, tr.68-84 45 20 Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4) 21 Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography B, 993-994, tr.69-74 22 European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, tr.9-10 23 Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9), tr 654-663 24 Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7), tr.1515-1609 25 The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, tr.2056-2057 26 The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), tr.6-13 27 In-Seon Park, Eun Mi Kang, and Namsoo Kim (2010), HighPerformance Liquid Chromatographic Analysis of Saponin Compounds in Bupleurum falcatum Journal of Chromatographic Science, tr 229233 28 Jung Won Choi, Juree Kim, Sam Sik Kang, et al (2021), Simultaneous determination of saikosaponin derivatives in Bupleurum falcatum by HPLC-ELSD analysis using different extraction methods, Bioactive Materials, tr 57-61 46 29 J.V Srinivasan, K P Unnikrishnan, A B Rema Shree, et al (2008), HPLC Estimation of berberin in Bupleurum falcatum, Bioactive Materials tr 96-99 30 Bộ Y tế (2018), “Hoàng bá”, Dược điển Việt Nam V tập II, nhà xuất Y học, tr 1185 47