0123 nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời các flavonoid trong cây nhân trần tía (adenosma bracreosum bonati scrophulariaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ NGUYỄN NHỰT MINH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG CÂY NHÂN TRẦN TÍA (Adenosma bracteosum Bonati) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Cần Thơ – Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ NGUYỄN NHỰT MINH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG CÂY NHÂN TRẦN TÍA (Adenosma bracteosum Bonati - Scrophulariaceae) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC ThS NGUYỄN NGỌC QUỲNH Cần Thơ – Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Con xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ gia đình ln ủng hộ, chỗ dựa tinh thần, giúp hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Cô Ths Nguyễn Ngọc Quỳnh, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, theo sát giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn Cô Ths Thạch Trần Minh Uyên, Thầy Ths Lê Thanh Vĩnh Tuyên, Cô Ths Nguyễn Thị Trang Đài, Chị Nguyễn Vũ Phƣơng Lan, Chị Ngô Thị Kim Hƣơng động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy Ths Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, thầy Ds Lữ Thiện Phúc thầy cô LBM Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện làm việc tốt cho em Em xin cảm ơn tất thầy cô trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ tận tình dạy dỗ chúng em năm vừa qua để chúng em có kết nhƣ ngày hôm Xin chân thành cảm ơn anh chị lớp Dƣợc khóa 35, bạn làm luận văn lớp Dƣợc khóa 36 ln quan tâm, chia sẽ, giúp đỡ lúc khó khăn, để hồn thành đề tài tốt nghiệp Nguyễn Nhựt Minh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất kết luận văn hồn tồn riêng tơi chƣa đƣợc cơng bố cơng trình Cần Thơ, ngày tháng Sinh viên ký tên Nguyễn Nhựt Minh năm i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÂN TRẦN TÍA 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng sinh học 1.2 TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID 10 1.2.1 Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AD6) 11 1.2.2 Isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AD4) 12 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 12 1.3.1 Khái niệm cấu tạo máy HPLC 12 1.3.2 Các thông số đặc trƣng trình sắc ký 13 1.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG BẰNG HPLC 16 1.4.1 Tính tƣơng thích hệ thống 16 1.4.2 Tính đặc hiệu/ tính chọn lọc 17 1.4.3 Độ xác 17 1.4.4 Độ 18 1.4.5 Tính tuyến tính miền giá trị 18 1.4.6 Giới hạn phát (LOD) – Giới hạn định lƣợng (LOQ) 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.1.1 Mẫu nguyên liệu 20 ii 2.1.2 Chất chuẩn đối chiếu 20 2.1.3 Dung mơi, hóa chất 20 2.1.4 Trang thiết bị 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Tinh khiết hóa flavonoid làm chất đối chiếu 21 2.2.2 Khảo sát quy trình chiết xuất flavonoid từ Nhân trần tía 22 2.2.3 Khảo sát điều kiện để định lƣợng đồng thời flavonoid HPLC 27 2.2.4 Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời flavonoid HPLC 28 2.2.5 Ứng dụng quy trình thẩm định để định lƣợng flavonoid Nhân trần tía đƣợc thu hái tỉnh thời kỳ sinh trƣởng khác 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU 33 3.1.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 33 3.1.3 Phƣơng pháp HPLC 34 3.2 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC FLAVONOID TỪ NHÂN TRẦN TÍA 35 3.2.1 Dung mơi chiết 35 3.2.2 Nhiệt độ chiết 35 3.2.3 Thời gian chiết 36 3.2.4 Thể tích dung mơi chiết 36 3.2.5 Số lần chiết 36 3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC 37 3.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 37 3.3.2 Thăm dò điều kiện sắc ký 39 3.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC 42 3.4.1 Tính tƣơng thích hệ thống 42 3.4.2 Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời flavonoid HPLC 42 3.5 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA THU HÁI TỪ TỈNH, Ở CÁC THỜI ĐIỂM SINH TRƢỞNG KHÁC NHAU 46 iii CHƢƠNG BÀN LUẬN 48 4.1 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU 48 4.1.1 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 48 4.1.2 Phƣơng pháp HPLC 48 4.2 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT CÁC FLAVONOID TỪ CÂY NHÂN TRẦN TÍA 49 4.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC 50 4.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 50 4.3.2 Thăm dò điều kiện sắc ký 51 4.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC 55 4.4.1 Tính tƣơng thích hệ thống 55 4.4.2 Tính đặc hiệu 55 4.4.3 Tính tuyến tính, LOD LOQ 56 4.4.4 Độ xác 58 4.4.5 Độ 58 4.5 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG MỘT VÀI MẪU THU HÁI Ở CÁC TỈNH, Ở CÁC THỜI ĐIỂM SINH TRƢỞNG KHÁC NHAU 58 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên % ACN AOAC As Selectivity factor Acetonitrile Assiocation of Official Analytical Chemists Asymmetry DĐVN IV Nghĩa tiếng Việt Phần trăm Hệ số chọn lọc Dung môi acetonitril Hiệp hội hóa học phân tích quốc tế Hệ số bất đối Dƣợc điển Việt Nam IV DMSO Dimethyl sulfoxide Dung môi dimethyl sulfoxid EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao ICH Hiệp hội đồng thuận quốc tế IR International conference Harmonisation Infrared k’ Capacity factor Hệ số dung lƣợng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol Dung môi methanol (Phổ) hồng ngoại Số đĩa lý thuyết N NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân PDA Photo Diod Array Dãy diod quang PL Phụ lục ppm Phần triệu Rf Retardation factor Hệ số lƣu trữ Rs SKĐ Resolution Độ phân giải Sắc ký đồ SKLM RSD S Sắc ký lớp mỏng Relative stadard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối Diện tích pic v Chữ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt SD Stadard deviation Độ lệch chuẩn S/N Signal/ Noise Tỷ số tín hiệu/ nhiễu tR Retention time Thời gian lƣu tt Thể tích UV Ultra violet Tử ngoại VS Vanilin sulfuric Vanilin sulfuric YHCT Y học cổ truyền vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Kết hoạt tính chống oxy hóa in vitro loại cao chiết Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn đối chiếu .20 Bảng 2.2 Các yếu tố khảo sát quy trình chiết xuất .23 Bảng 2.3 Khảo sát dung môi chiết 23 Bảng 2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết 24 Bảng 2.5 Khảo sát thời gian chiết .25 Bảng 2.6 Khảo sát thể tích dung mơi chiết 25 Bảng 2.7 Khảo sát số lần chiết .26 Bảng 2.8 Một số điều kiện pha động khảo sát 28 Bảng 2.9 Khảo sát tính tuyến tính miền giá giá trị AD6, AD4 30 Bảng 3.1 Kết khảo sát dung môi chiết 35 Bảng 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ chiết 35 Bảng 3.3 Kết khảo sát thời gian chiết 36 Bảng 3.4 Kết khảo sát thể tích dung mơi .36 Bảng 3.5 Kết khảo sát số lần chiết 36 Bảng 3.6 Một số điều kiện pha động khảo sát 39 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu chuẩn (n=6) 42 Bảng 3.8 Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu thử (n=6) 42 Bảng 3.9 Khoảng tuyến tính isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AD6) 44 Bảng 3.10 Khoảng tuyến tính isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AD4) 44 Bảng 3.11 Kết khảo sát tính tuyến tính .44 Bảng 3.12 Tỷ lệ S/N AD6, AD4 nồng độ ppm, 0,5 ppm 0,25 ppm 45 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ xác ngày (n=6) 45 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ .46 Bảng 3.15 Kết khảo sát hàm lƣợng flavonoid số mẫu Nhân trần tía 46 Bảng 4.1 Điều kiện pha động tối ƣu 54 Phát đèn UV 365 Phụ lục Kết khảo sát thể tích dung mơi sắc ký lớp mỏng Phát đèn UV 254 Phát đèn UV 365 Phụ lục Kết khảo sát số lần chiết sắc ký lớp mỏng Phát đèn UV 254 Phát đèn UV 365 Phụ lục Kiểm tra độ tinh khiết chất chuẩn đối chiếu HPLC/PDA Hình PL-6.1 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết AD6 Hình PL-6.2 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết AD6 chế độ max plot Bảng PL-6.2 Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống đo tinh khiết AD6 Lần AD6 tR (phút) S (mAU*phút) Rs As 3,83 8297941 2,73 1,50 3,83 8374854 2,71 1,49 3,82 8572147 2,73 1,47 3,82 8610231 2,70 1,46 3,81 8605794 2,66 1,45 3,80 8645986 2,63 1,48 TB 3,82 8517825 2,69 1,47 SD 0,01 144529 RSD (%) 0,33 1,70 Hình PL-6.3 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết AD4 Hình PL-6.4 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết AD4 chế độ max plot Bảng PL-6.2 Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống đo tinh khiết AD4 Lần AD4 tR (phút) S (mAU*phút) Rs As 3,52 13636090 1,97 1,46 3,51 13166593 1,93 1,47 3,51 13253628 1,91 1,47 3,51 13463218 1,93 1,46 3,51 13753093 1,90 1,45 3,51 13847890 1,89 1,43 TB 3,51 13520085 1,92 1,46 SD 0,01 273640 RSD% 0,14 2,0 Phụ lục Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu chuẩn Hình PL-7 Overlay sắc ký đồ khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu chuẩn Bảng PL-7 Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu chuẩn Lần AD6 tR (phút) S (mAU*phút) Rs As 17,46 7979654 3,06 1,12 17,56 7976039 3,14 1,17 17,56 8056042 3,11 1,21 18,01 8034101 3,08 1,17 17,60 8222376 3,11 1,19 17,85 7943989 3,16 1,19 TB 17,67 8035367 3,11 1,18 SD 0,21 100374 RSD (%) 1,19 1,25 Lần AD4 tR (phút) S (mAU*phút) Rs As 21,29 7054300 1,78 1,38 21,53 7273211 1,85 1,38 22,27 7170215 1,86 1,42 21,95 7084979 1,84 1,47 21,56 7071010 1,83 1,39 21,86 7069721 1,84 1,36 TB 21,74 7120573 1,83 1,40 SD 0,35 85398 RSD (%) 1,61 1,20 Phụ lục Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu thử Hình PL-8 Overlay sắc ký đồ khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu thử Bảng PL-8 Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống mẫu thử Lần AD6 tR (phút) S (mAU*phút) Rs As 18,18 1814496 5,14 1,08 18,17 1860525 5,00 1,11 18,26 1862931 4,96 1,08 18,52 1852875 5,17 1,11 18,17 1882299 5,17 1,13 18,17 1894152 5,17 1,12 TB 18,25 1861213 5,10 1,11 SD 0,14 27514 RSD (%) 0,76 1,48 Lần AD4 tR (phút) S (mAU*phút) Rs As 22,57 2693310 1,91 1,29 22,64 2600006 1,95 1,25 22,78 2659766 1,96 1,31 23,00 2665856 2,04 1,25 22,59 2699956 1,96 1,31 22,57 2680753 1,98 1,22 TB 22,72 2663779 1,96 1,28 SD 0,18 39586 RSD (%) 0,79 1,49 Phụ lục Định tính AD6 AD4 dựa tR mẫu chuẩn mẫu thử Hình PL-9.1 Định tính AD6 dựa tR mẫu chuẩn mẫu thử Hình PL-9.2 Định tính AD4 dựa tR mẫu chuẩn mẫu thử Phụ lục 22 Kết xác định độ ẩm dƣợc liệu tồn Nhân trần tía Bảng PL-22 Kết xác định độ ẩm dƣợc liệu Nhân trần tía Nơi thu mẫu Tây Ninh Bình Dương An Giang Độ ẩm Thời kỳ sinh trưởng Lần %) Trước hoa 7,58 7,53 7,55 7,55 Đang hoa 7,58 7,93 8,01 7,51 Ra hoa đầy đủ 10,02 10,91 11,01 10,64 Trước hoa 7,18 7,18 7,19 7,18 Đang hoa 10,87 10,91 10,88 10,89 Ra hoa đầy đủ 7,53 7,84 8,12 7,83 Trước hoa 7,58 8,16 7,18 7,64 Đang hoa 7,59 7,63 7,60 7,61 12,84 12,72 13,02 12,86 B nh vi n YHCT Cần Thơ Lần %) Lần %) TB (%)