0122 nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine trong quả ngô thù du (evodiae fructus) bằng phương pháp hplc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN DƯ QUỲNH NHƯ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EVODIAMINE VÀ RUTAECARPINE TRONG QUẢ NGÔ THÙ DU (EVODIAE FRUCTUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC CẦN THƠ – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN DƯ QUỲNH NHƯ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EVODIAMINE VÀ RUTAECARPINE TRONG QUẢ NGÔ THÙ DU (EVODIAE FRUCTUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN Cần Thơ – 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Ts Nguyễn Thị Ngọc Vân, liên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, trường Đại học Y dược Cần Thơ, người tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em kiến thức quý báu chia sẻ quan tâm tận tình để em hồn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy, cô liên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, thầy ThS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, cô ThS Dương Thị Trúc Ly, Nguyễn Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Tường Vi, thầy Lữ Thiện Phúc, cô Nguyễn Thị Đặng động viên tạo điều kiện thuận lợi để em thực tốt đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cô môn Dược liệu, đặc biệt cô ThS Nguyễn Ngọc Quỳnh tạo điều kiện giúp em thực luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn đến anh, chị lớp Dược khóa 34 bạn làm luận văn lớp Dược khóa 35, đặc biệt bạn làm luận văn liên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất quan tâm giúp đỡ trình thực đề tài Con xin gửi đến cha, mẹ gia đình lịng biết ơn sâu sắc quan tâm chỗ dựa tinh thần lớn cho LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết luận văn trung thực, hồn tồn riêng tơi chưa cơng bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày 24 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Dư Quỳnh Như MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực vật học Ngô thù du 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái Ngô thù du 1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 1.2 Tổng quan Ngô thù du 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm vi phẫu 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng dược lý 1.3 Tổng quan hai alkaloid phạm vi nghiên cứu đề tài 1.3.1 Evodiamine 1.3.2 Rutaecarpine .9 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 10 1.4.1 Khái niệm HPLC 10 1.4.2 Các thông số đặc trưng trình sắc ký 10 1.5 Các phương pháp chiết xuất dược liệu 13 1.5.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 13 1.5.2 Các phương pháp hòa tan chiết xuất 15 1.5.3 Một số phương pháp chiết xuất dùng nghiên cứu đối tượng Ngô thù du 17 1.6 Một số nghiên cứu có liên quan đến Ngô thù du 18 Chương - ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Dung mơi – hóa chất 20 2.3 Trang thiết bị 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Kiểm tra mẫu dược liệu 21 2.4.2 Khảo sát điều kiện để định lượng đồng thời evodiamine rutaecarpine phương pháp HPLC 21 2.4.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất evodiamine rutaecarpine từ Ngơ thù du 22 2.4.4 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine rutaecarpine phương pháp HPLC 27 2.5 Ứng dụng quy trình định lượng thẩm định để định lượng vài mẫu thu mua thị trường 31 Chương - KẾT QUẢ 33 3.1 Kiểm tra mẫu dược liệu Ngô thù du 33 3.2 Khảo sát điều kiện để định lượng đồng thời evodiamine rutaecarpine phương pháp HPLC 34 3.3 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du 37 3.3.1 Quy trình chiết xuất evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du phương pháp chiết hồi lưu (PP 1) .37 3.3.2 Quy trình chiết xuất evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (PP 2) 41 3.3.3 Đánh giá hiệu chiết evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du phương pháp chiết hồi lưu phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm 45 3.4 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine rutaecarpine phương pháp HPLC 48 3.4.1 Tính tương thích hệ thống 48 3.4.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine rutaecarpine 50 3.5 Ứng dụng quy trình định lượng thẩm định để định lượng vài mẫu thu mua thị trường 56 Chương - BÀN LUẬN 58 4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 58 4.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du 59 4.2.1 Quy trình chiết xuất evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du phương pháp chiết hồi lưu 60 4.2.2 Quy trình chiết xuất evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm 61 4.2.3 Đánh giá hiệu chiết evodiamine rutaecarpine từ Ngô thù du phương pháp chiết hồi lưu phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm 61 4.3 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine rutaecarpine phương pháp HPLC 62 4.3.1.Tính tương thích hệ thống 62 4.3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine rutaecarpine phương pháp HPLC 63 4.4 Ứng dụng quy trình định lượng thẩm định để định lượng vài mẫu thu mua thị trường 65 KẾT LUẬN 67 KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt, STT ký hiệu ACN AOAC Chữ nguyên Ý nghĩa Acetonitrile Dung môi acetonitril Association of Official Hiệp hội hóa học phân tích Analytical Chemists quốc tế As Asymmetry Hệ số bất đối DCM Dichloromethan Dung môi dicloromethan DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography International conference Hiệp hội đồng thuận harmonisation quốc tế ICH LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng 10 MeOH Methanol Dung môi methanol 11 PDA Photo Diode Array Đầu dò dãy diod quang 12 PP Phương pháp 13 Rs Resolution 14 SKĐ Sắc ký đồ 15 tR Retention time 16 tt Thể tích Độ phân giải Thời gian lưu pic DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số phương pháp chiết xuất dùng nghiên cứu đối tượng Ngô thù du 17 Bảng 1.2 Một số nghiên cứu liên quan đến Ngô thù du 18 Bảng 2.1 Danh mục dung môi hóa chất sử dụng 20 Bảng 2.2 Các điều kiện pha động khảo sát .22 Bảng 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết hồi lưu 23 Bảng 2.4 Khảo sát dung môi chiết cho PP 24 Bảng 2.5 Khảo sát thời gian chiết cho PP .24 Bảng 2.6 Khảo sát thể tích dung mơi chiết cho PP .24 Bảng 2.7 Khảo sát số lần chiết cho PP 25 Bảng 2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết có hỗ trợ siêu âm 25 Bảng 2.9 Khảo sát dung môi chiết cho PP 26 Bảng 2.10 Khảo sát thời gian chiết cho PP 26 Bảng 2.11 Khảo sát thể tích dung môi chiết cho PP .26 Bảng 2.12 Khảo sát số lần chiết cho PP 27 Bảng 2.13 Khảo sát tính tuyến tính miền giá giá trị evodiamine rutaecarpine 29 Bảng 2.14 Một số mẫu dược liệu Ngô thù du mua thành phố Cần Thơ 31 Bảng 3.1 Kết khảo sát điều kiện sắc ký 34 Bảng 3.2 Kết khảo sát dung môi chiết cho PP .37 Bảng 3.3 Kết khảo sát thời gian chiết cho PP 37 Bảng 3.4 Kết khảo sát thể tích dung mơi chiết cho PP 38 Bảng 3.5 Kết khảo sát số lần chiết cho PP .38 Bảng 3.6 Kết khảo sát dung môi chiết cho PP .41 Bảng 3.7 Kết khảo sát thời gian chiết cho PP 41 Bảng 3.8 Kết khảo sát thể tích dung mơi chiết cho PP 42 Bảng 3.9 Kết khảo sát số lần chiết cho PP .42 Bảng 3.10 Hàm lượng evodiamine từ phương pháp chiết hồi lưu (PP 1) phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (PP 2) 45 Bảng 3.11 Hàm lượng rutaecarpine từ phương pháp chiết hồi lưu (PP 1) phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (PP 2) 46 Bảng 3.12 Kết so sánh phương sai PP PP 46 Bảng 3.13 Kết so sánh hàm lượng trung bình evodiamine PP1 PP2 47 Bảng 3.14 Kết so sánh hàm lượng trung bình rutaecarpine PP1 PP2 47 Bảng 3.15 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu hỗn hợp chuẩn 48 Bảng 3.16 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử 49 Bảng 3.17 Kết khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ 52 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ xác ngày (n=6) 53 Bảng 3.19 Kết khảo sát độ xác liên ngày (n=3) 54 Bảng 3.20 Kết khảo sát độ evodiamine 55 Bảng 3.21 Khảo sát độ rutaecarpine 56 Bảng 3.22 Hàm lượng evodiamine rutaecarpine mẫu dược liệu Ngô thù du mua thành phố Cần Thơ 56 PHỤ LỤC Kết kiểm tra mẫu dược liệu Hình PL.2 Kết kiểm tra mẫu dược liệu (1) Mẫu dược liệu Ngô thù du 2, (2) Dương tính với thuốc thử Mayer, (3) Dương tính với thuốc thử PDAB, (4) Lông che chở đa bào, (5) Lông che chở đa bào chứa chất tiết màu vàng nâu, (6) Mảnh mạch vạch, (7) Mảnh nhựa màu, (8) Tinh thể calci oxalat hình lăng trụ PHỤ LỤC Kết kiểm tra mẫu dược liệu Hình PL.3 Kết kiểm tra mẫu dược liệu (1) Mẫu dược liệu Ngơ thù du 3, (2) Dương tính với thuốc thử PDAB, (3) Dương tính với thuốc thử Mayer, (4) Lông che chở đa bào, (5) Lông che chở đa bào chứa chất tiết màu vàng nâu, (6) Mảnh mạch vạch, (7) Lông tiết, (8) Tinh thể calci oxalat hình lăng trụ PHỤ LỤC Kết kiểm tra mẫu dược liệu Hình PL.4 Kết kiểm tra mẫu dược liệu (1) Mẫu dược liệu Ngô thù du 4, (2) Dương tính với thuốc thử PDAB, (3) Dương tính với thuốc thử Mayer, (4) Lơng che chở đa bào, (5) Lông che chở đa bào chứa chất tiết màu vàng nâu, (6) Mảnh mạch vạch, (7) Tinh thể calci oxalat hình lăng trụ, (8) Mảnh nhựa màu PHỤ LỤC Kết kiểm tra mẫu dược liệu Hình PL.5 Kết kiểm tra mẫu dược liệu (1) Mẫu dược liệu Ngô thù du 5, (2) Dương tính với thuốc thử PDAB, (3) Dương tính với thuốc thử Mayer, (4) Lơng che chở đa bào, (5) Lông che chở đa bào chứa chất tiết màu vàng nâu, (6) Mảnh mạch vạch, (7) Mảnh nhựa màu, (8) Lông tiết