0131 nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng đồng thời dư lượng một số kháng sinh nhóm phenicol quinolon có trong nước bằng phương pháp lc m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN NGỌC KHÁNH THƯ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL, QUINOLON CÓ TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC CẦN THƠ - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN NGỌC KHÁNH THƯ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL, QUINOLON CÓ TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ ThS DƯƠNG THỊ TRÚC LY Cần Thơ - 2018 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu thực luận văn hướng dẫn khoa học Thầy TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ cô ThS Dương Thị Trúc Ly em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ cô ThS Dương Thị Trúc Ly ln tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ cho em ý kiến bổ ích suốt q trình thực luận văn Các thầy Liên mơn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm - Độc chất, thầy Nguyễn Mạnh Quân cho lời khuyên hữu ích giúp đỡ, tạo điều kiện cho em có đầy đủ dụng cụ, trang thiết bị, máy móc để thực đề tài Xin gởi lời cám ơn chân thành đến Ths Huỳnh Thị Ngọc Liên Ths Nguyễn Văn Luy (Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 6, NAFI 6) giúp đỡ hỗ trợ chất chuẩn, hóa chất, kinh nghiệm phân tích mẫu để em hồn thành tốt luận văn Cảm ơn anh chị Dược K38, anh Huỳnh Huỳnh Anh Thi bạn bè Dược K39 giúp đỡ, động viên em suốt quãng thời gian vừa qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân ln ủng hộ, đồng hành LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ ThS Dương Thị Trúc Ly Các số liệu, kết thực nghiệm nêu luận văn trung thực, chưa công bố tài liệu khác Cần Thơ, ngày 11 tháng 06 năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Ngọc Khánh Thư MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC HÌNH ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nhóm kháng sinh phenicol 1.1.1 Tổng quan cloramphenicol 1.1.2 Tổng quan florfenicol 1.1.3 Tổng quan thiamphenicol 1.2 Tổng quan nhóm quinolon 1.2.1 Tổng quan ofloxacin 1.2.2 Tổng quan ciprofloxacin 1.2.3 Tổng quan enrofloxacin 1.3 Các nghiên cứu liên quan đến đến phương pháp định lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nước thải phương pháp sắc ký lỏng 1.3.1 Nghiên cứu nước 1.3.2 Nghiên cứu giới: 10 1.3.3 Nhận xét cơng trình nghiên cứu 11 1.4 Tổng quan phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu nước thải 11 1.4.1 Phương pháp lấy mẫu nước thải 11 1.4.2 Xử lí mẫu 12 1.5 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ 16 1.5.1 Sắc ký lỏng 16 1.5.2 Đầu dò khối phổ ba lần tứ cực 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19 2.3 Phương tiện nghiên cứu 19 2.3.1 Hóa chất, thuốc thử 19 2.3.2 Chất chuẩn đối chiếu nội chuẩn 20 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu: 21 2.4.1 Chuẩn bị mẫu 21 2.4.2 Xây dựng quy trình định lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nước thải phương pháp LC-MS/MS 22 2.4.3 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin nước thải phương pháp LC-MS/MS 27 2.4.4 Ứng dụng quy trình định lượng thẩm định phân tích dư lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có mẫu nước thải thu thập vùng nuôi trồng thủy sản tỉnh Bạc liêu, Sóc trăng, Trà Vinh 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ 31 3.1 Khảo sát xây dựng quy trình định lượng 31 3.1.1 Khảo sát lựa chọn nội chuẩn 31 3.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 32 3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp 35 3.1.4 Quy trình xử lý mẫu thích hợp 36 3.1.5 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích 37 3.1.6 Đánh giá ảnh hưởng nhiễu lên chất phân tích 38 3.2 Thẩm định quy trình phân tích 38 3.2.1 Tính tương thích hệ thống 38 3.2.2 Tính đặc hiệu- chọn lọc 40 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 43 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 44 3.2.5 Độ độ xác 46 3.3 Áp dụng quy trình thẩm định để phân tích dư lượng kháng sinh nhóm phenicol quinolon mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản thu thập tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh 49 CHƯƠNG BÀN LUẬN 50 4.1 Xây dựng quy trình định lượng 50 4.1.1 Khảo sát nội chuẩn 50 4.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu 50 4.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp 54 4.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp 56 4.1.5 Khảo sát ổn định mẫu phân tích 58 4.1.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiễu lên chất phân tích 58 4.2 Thẩm định quy trình định lượng 58 4.2.1 Tính tương thích hệ thống 58 4.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 60 4.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 60 4.2.5 Độ độ xác 60 4.3 Ứng dụng quy trình định lượng thẩm định 61 KẾT LUẬN 62 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT Chữ tắt, ký hiệu AOAC Chữ nguyên Association of Official Analytical Chemists ADR Adverse Drug Reaction CB CLOR CLOR-d5 CIP EC ERF ESI FLOR Conduction band Cloramphenicol Cloramphenicol-d5 Ciprofloxacin European Commission Enrofloxacin Electrospray ion Florfenicol High Performance Liquid Chromatography Internal Standard Liquid Chromatography Liquid ChromatographyMass Spectrometry Limit Of Detection Limit Of Quantification HPLC IS LC LC-MS LOD LOQ m/z MRL MRM MS MTBE NOR OFL PAD RSD S/N SIM SPE THI Maximum Residue Limit Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry Methyl terbuthyl ether Norfloxacin Ofloxacin Photodiode Array Detector Relative Standard Deviation Signal/Noise Selected Ion Mornitoring Solid Phase Extraction Thiamphenicol Ý nghĩa Hiệp hội hóa học phân tích quốc tế Tác dụng khơng mong muốn thuốc Vùng dẫn lượng cao Cloramphenicol Đồng vị Cloramphenicol Ciprofloxacin Hội đồng Châu Âu Enrofloxacin Ion hoá phun điện tử Florfenicol Sắc ký lỏng hiệu cao Chuẩn nội Sắc ký lỏng Sắc ký lỏng ghép khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Khối lượng/điện tích Giới hạn dư lượng tối đa Chế độ chọn lọc nhiều lần Khối phổ Methyl terbuthyl ether Norfloxacin Ofloxacin Đầu dị dãy diod quang Độ lệch chuẩn tương đối Tín hiệu/Nhiễu Chế độ quét chọn lọc ion Chiết pha rắn Thiamphenicol ii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo cloramphenicol Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo florfenicol Hình 1.3 Công thức cấu tạo thiamphenicol Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo ofloxacin Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo ciprofloxacin Hình 1.6 Công thức cấu tạo enrofloxacin Hình 1.7 Tóm tắt quy trình chiết pha rắn (SPE) 15 Hình 1.8 Cấu tạo phận khối phổ lần tứ cực 18 Hình 2.1 Hệ thống UPLC-MS/MS Xevo-TQD Waters 21 Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu 24 Hình 2.3 Quy trình xử lý mẫu 25 Hình 2.4 Quy trình xử lý mẫu 25 Hình 3.1 Kết lượng phân mảnh tối ưu tín hiệu cho nội chuẩn 31 Hình 3.2 Kết autotune manual-tune chất chuẩn OFL 33 Hình 3.3 Kết autotune manual-tune chất chuẩn CLOR 34 Hình 3.4 SKĐ phân tích đồng thời CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF 36 Hình 3.5 Độ thu hồi chất phân tích qua quy trình xử lý mẫu 37 Hình 3.6 Sắc ký đồ overlay lần tiêm liên tiếp Cloramphenicol 40 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn lần chất cloramphenicol 41 Hình 3.8 Phổ đồ MS fullscan ES+ mẫu trắng thêm chuẩn 421 Hình 3.9 Phổ đồ Phổ đồ Daughter Scan Ciprofloxacin 422 Hình 3.10 Đường tuyến tính CIP CLOR truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1 44 Hình 3.11 S/N xác định LOD CIP CLO 46 Hình 3.12 Độ thu hồi ngày liên ngày CIP, OFL, ERF, CLOR, THI, FLOR nồng độ 10 ppb 48 Hình 3.13 Độ xác ngày liên ngày CIP, OFL, ERF, CLOR, THI, FLOR nồng độ 10 ppb 48 iii Hình 4.1 Phân mảnh đặc trưng cho phân tích định lượng CLOR, THIAM, FLOR, CIP, OFL, ERF nội chuẩn NOR kỹ thuật LC-MS/MS so với Thư viện Phổ chuẩn (European Massbank) 53 Hình 4.2 Sắc ký đồ minh họa hệ pha động ACN-nước acid formic pH 2,99 55 Hình 4.3 Sắc ký đồ mẫu nước có dư lượng kháng sinh 61 37 Compound name: Ofloxacin 38 Method: D:\PROJECT DK39\VINHTHO.PRO\MethDB\0504 chat.mdb 30 May 2018 12:04:54 Calibration: D:\PROJECT DK39\VINHTHO.PRO\CurveDB\300518 tuyen tinh chuan phenicol.cdb 30 May 2018 17:05:33 Compound name: Chloramphenicol 39 Compound name: Chloramphenicol 40 Compound name: Chloramphenicol 41 Compound name: Thiamphenicol 42 Compound name: Thiamphenicol 43 Compound name: Thiamphenicol 44 Compound name: Florfenicol 45 Compound name: Florfenicol 46 Compound name: Florfenicol 47 Phụ lục Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng S/N xác định LOD, LOQ ciprofloxacin S/N xác định LOD, LOQ ofloxacin 48 S/N xác định LOD, LOQ enrofloxacin S/N xác định LOD, LOQ cloramphenicol 49 S/N xác định LOD, LOQ thiamphenicol S/N xác định LOD, LOQ florfenicol 50 Phụ lục Kết phân tích mẫu thử Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh 51