Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng ochratoxin a và aflatoxin b1 trong hạt cà phê bằng phương pháp lc ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TÀO MAI VINH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG OCHRATOXIN A VÀ AFLATOXIN B1 TRONG HẠT CÀ PHÊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT Mã số: 60.72.04.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ Cần Thơ – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Các số liệu, kết nêu luận văn chưa công bố công trình khác Cần Thơ, ngày 01 tháng 04 năm 2019 Học viên Tào Mai Vinh LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý Thầy, Cô Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Đặc biệt, xin trân trọng bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: Q Thầy, Cơ Liên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em hồn thành luận văn Với lịng kính trọng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ người tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, góp ý cho em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ - 2019 Tào Mai Vinh i MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt iii Danh mục bảng iv Danh mục hình iv Danh mục sơ đồ vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nội độc tố Ochratoxin A Aflatoxin B1 1.2 Tổng quan phƣơng pháp sắc ký lực miễn dịch LC-MS/MS 1.3 Thẩm định quy trình phân tích 12 1.4 Tình hình nghiên cứu định lƣợng OTA AFB1 hạt cà phê 14 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng 21 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 21 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 21 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 2.1.5 Nguyên vật liệu nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 23 2.2.2 Cỡ mẫu 23 2.2.3 Phƣơng pháp chọn mẫu 24 2.2.4 Nội dung nghiên cứu 24 2.2.5 Phƣơng pháp thu thập đánh giá số liệu 33 2.2.6 Phƣơng pháp kiểm soát sai số 34 2.2.7 Xử lý thống kê kết phân tích 34 2.2.8 Đạo đức nghiên cứu 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Xây dựng quy trình định lƣợng OTA AFB1 hạt cà phê phƣơng pháp LC – MS/MS 35 3.1.1 Khảo sát lựa chọn nội chuẩn 35 ii 3.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 36 3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp 39 3.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 41 3.1.5 Khảo sát ảnh hƣởng nhiễu lên chất phân tích 42 3.2 Kết thẩm định quy trình phân tích 43 3.2.1 Tính tƣơng thích hệ thống 43 3.2.2 Tính đặc hiệu 44 3.2.3 Tính tuyến tính – miền giá trị 48 3.2.4 Gi i hạn phát gi i hạn định lƣợng 50 3.2.5 Độ xác độ đ ng 52 3.3 Xác định hàm lƣợng độc tố OTA AFB1 hạt cà phê Thành Phố Cần Thơ phƣơng pháp LC-MS/MS vừa xây dựng 52 Chƣơng BÀN LUẬN 55 4.1 Xây dựng quy trình phân tích 55 4.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 55 4.1.2 Khảo sát lựa chọn nội chuẩn 57 4.1.3 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ƣu 59 4.1.4 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp 61 4.1.5 Khảo sát ảnh hƣởng nhiễu 63 4.2 Thẩm định quy trình phân tích 64 4.2.1 Tính tƣơng thích hệ thống 64 4.2.2 Tính đặc hiệu 64 4.2.3 Tính tuyến tính – miền giá trị 65 4.2.4 Gi i hạn phát gi i hạn định lƣợng 66 4.2.5 Độ đ ng độ xác 68 4.3 Ứng dụng quy trình phân tích 68 4.4 So sánh phƣơng pháp LC-MS/MS vừa xây dựng v i LC-FD 69 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt Từ nguyên AF Aflatoxin AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AOAC Association of Official Hiệp hội nhà hố phân tích Analytical Chemists BYT ELISA Bộ Y Tế Enzyme Linked Miễn dịch huỳnh quang Immunosorbent Assay ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun ion IAC Immunoaffinity column Cột sắc ký lực miễn dịch LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng LC-FD Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng - Đầu dò huỳnh Fluorecence detector quang LOD Limit of Detection Gi i hạn phát LOQ Limit of Quantitation Gi i hạn định lƣợng MRL Maximum residue level Gi i hạn ô nhiễm độc tố vi nấm MS Mass Spectrometry Khối phổ OTA PBS Ochratoxin A Phosphate Buffered Saline QCVN UPLC Quy chuẩn Việt Nam Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu Chromatography UV Ultra Violet Tia cực tím iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình nghiên cứu gi i 14 Bảng 1.2 Tình hình nghiên cứu nƣ c 18 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất dung môi sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Danh mục trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.3 Mẫu cà phê thu thập để kiểm tra hàm lƣợng nội độc tố 23 Bảng 2.4 Gi i hạn sai lệch cho phép tối đa tỉ lệ ion 31 Bảng 3.1 Thông tin khảo sát nội chuẩn AFB2 35 Bảng 3.2 Các thông số điều kiện khối phổ tối ƣu chất 36 Bảng 3.3 Khảo sát điều kiện pha động 39 Bảng 3.4 Phƣơng trình hồi qui xây dựng mẫu trắng dung môi 42 Bảng 3.5 Tính tƣơng thích hệ thống mẫu chuẩn dung mơi 43 Bảng 3.6 Tính tƣơng thích hệ thống mẫu chuẩn mẫu trắng 43 Bảng 3.7 Tỉ lệ ion định tính định lƣợng chất phân tích 47 Bảng 3.8 Độ lệch chuẩn thời gian lƣu cho chất phân tích 48 Bảng 3.9 Khoảng tuyến tính, đƣờng chuẩn OTA, AFB1 mẫu trắng50 Bảng 3.10 Giá trị LOD LOQ chất 51 Bảng 3.11 Độ đ ng, độ xác ngày liên ngày chất 52 Bảng 3.12 Kết xác định hàm lƣợng OTA AFB1 hạt cà phê 53 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tr c hóa học Ochratoxin A Hình 1.2 Cấu tr c hóa học Aflatoxin B1 (a) Aflatoxin B2 (b) Hình 3.1 Kết cone (a) lƣợng phân mảnh (b) cho AFB2 35 Hình 3.2 Kết autotune chất chuẩn OTA 37 Hình 3.3 Cơ chế phân mảnh mảnh chất phân tích 38 Hình 3.4 Sắc ký đồ chất điều kiện sắc ký tối ƣu 40 Hình 3.5 Độ thu hồi chất phân tích quy trình chiết 41 Hình 3.6 Sắc ký đồ pha động, dung môi pha mẫu, mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn lần OTA 44 Hình 3.7 Sắc ký đồ pha động, dung môi pha mẫu, mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn lần AFB1 45 Hình 3.8 Phổ đồ MS1 scan mẫu trắng thêm chuẩn 46 Hình 3.9 Phổ đồ Daughter scan OTA 46 Hình 3.10 Phổ đồ Daughter scan AFB1 47 Hình 3.11 Đƣờng tuyến tính (a) OTA (b) AFB1 đƣợc truy xuất từ phần mềm masslynx 4.1 49 Hình 3.12 S/N xác định (a) LOQ, (b) LOD OTA 51 Hình 3.13 S/N xác định (a) LOQ, (b) LOD AFB1 51 Hình 3.14 SKĐ mẫu M19 (a) M26 (b) dƣơng tính v i OTA 54 Hình 3.15 SKĐ mẫu M19 dƣơng tính v i AFB1 54 Hình 4.1 Thơng tin khối chuẩn nội AFB2 từ Thƣ viện Phổ chuẩn Châu Âu59 Hình 4.2 Thơng tin khối OTA từ Thƣ viện Phổ chuẩn Châu Âu 60 Hình 4.3 Thơng tin khối AFB1 từ Thƣ viện Phổ chuẩn Châu Âu 60 vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình xử lý mẫu 28 Sơ đồ 2.2 Quy trình xử lý mẫu 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề an toàn thực phẩm thu h t nhiều quan tâm Trong đó, ngộ độc nhiễm nội độc tố đƣợc sinh từ chủng nấm mốc Aspergillus sp Penicillium sp., ngày gia tăng Các nội độc tố bao gồm nhiều dạng, đặc biệt đƣợc quan tâm khả gây độc cao loại khác Ochratoxin A (OTA) Aflatoxin B1 (AFB1) Theo phân loại chất có khả gây ung thƣ cho ngƣời động vật, AFB1 đƣợc ghi nhận thuộc nhóm gây ung thƣ nhóm 1, độc tính gan, mật; OTA đƣợc xếp vào nhóm 2B có khả gây ung thƣ cho ngƣời động vật [52] Theo thống kê FDA Hoa Kỳ, năm 2003, nƣ c khí hậu nhiệt đ i khu vực Châu Á có tỷ lệ nhiễm nội độc tố thực phẩm cao nƣ c khác (54,5%), Aflatoxin chiếm tỷ lệ cao [33] Kết nghiên cứu bệnh nhân ung thƣ gan điều trị Hà Nội phát có AFB1 tổ chức gan 83% bệnh nhân Theo tác giả, bệnh ung thƣ gan nguyên phát Việt Nam liên quan chặt chẽ v i nhiễm AFB1 qua thực phẩm [14] Trong thực phẩm chiếm sản lƣợng l n, cà phê thức uống thơng dụng đƣợc u thích nhiều lợi ích cho sức khỏe, nhƣng bị phát v i khả gây ngộ độc nội độc tố, đặc biệt ung thƣ gan thận Nội độc tố đƣợc nghiên cứu nhiều cà phê OTA Tuy nhiên, nghiên cứu nội độc tố AFB1 cà phê hạn chế, nội độc tố có độc tính cao phổ biến Nghiên cứu C.E Magnoli cộng cho thấy 25% 100 mẫu cà phê bị nhiễm A sp Mức nhiễm OTA dao động 2,7 – 14 ppb AFB1 9,5 – 17,5 ng/g sợi nấm [25] Từ cho thấy, nội độc tố AFB1 đƣợc phát cà phê nhƣng chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu Và đến chƣa tìm thấy nghiên cứu phân tích đồng thời OTA AFB1 hạt cà phê Việt Nam PL-24 AFB1 AFB2 OTA Phổ đồ MS1 scan chất ES (+) OTA Phổ đồ Daughter scan OTA PL-25 AFB1 Phổ đồ Daughter scan AFB1 AFB2 Phổ đồ Daughter scan chuẩn nội AFB2 PL-26 Phụ lục Tính tuyến tính đường chuẩn Đường chuẩn OTA mẫu trắng PL-27 Đường chuẩn AFB1 mẫu trắng PL-28 Đường chuẩn OTA dung môi pha mẫu Đường chuẩn AFB1 dung môi pha mẫu PL-29 Phụ lục Giới hạn phát giới hạn định lượng LOQ OTA nồng độ 0,05 ppb LOD OTA nồng độ 0,02 ppb PL-30 LOQ AFB1 nồng độ 0,05 ppb LOD AFB1 nồng độ 0,01 ppb PL-31 Phụ lục Độ độ xác Độ ngày OTA PL-32 Độ ngày OTA PL-33 Độ ngày OTA PL-34 Độ ngày AFB1 PL-35 Độ ngày AFB1 PL-36 Độ ngày AFB1 PL-37 Phụ lục Kết phân tích mẫu thực cà phê Nội độc tố: OTA PL-38 Nội độc tố: AFB1 ... cao OTA AFB1 cà phê phƣơng pháp LC- MS/ MS có tính m i cần thiết Vì thế, ch ng tơi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng Ochratoxin A Aflatoxin B1 hạt cà phê phƣơng pháp LC- MS/ MS”... pháp LC- MS/ MS” Với mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời Ochratoxin A Aflatoxin B1 hạt cà phê phƣơng pháp LCMS /MS Ứng dụng quy trình thẩm định để xác định hàm... [M+H]+ m/z 370 Masahiro OTA - OTA: sử dụng - LC- FD Nakajima (2008) AFB1 cà phê IAC OTA Mab - AFB1: Florisil SPE, IAC - LC- FD Chia-Ding Liao (2011) Aflatoxin (B1, B2, G1, G2), OTA, zearalenone (ZON)