Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng glucosamin và chondroitin trong dược phẩm bằng phương pháp uplc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ LƯU VĨNH KHANG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMIN VÀ CHONDROITIN TRONG DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Cần Thơ – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ LƯU VĨNH KHANG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMIN VÀ CHONDROITIN TRONG DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN Cần Thơ – 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô hướng dẫn PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Vân Trong suốt trình thực đề tài, ln tạo nhiều hội để em phát triển thân, trau dồi kiến thức chuyên môn không riêng mảng đề tài tốt nghiệp Cô dạy, quan tâm, động viên giúp đỡ em lúc khó khăn Em xin gửi lời cảm ơn đến khoa Dược trường Đại học Y dược Cần Thơ, thầy cô Liên mơn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm - Độc chất, tận tình giúp đỡ dẫn em q trình làm đề tài mơn Em xin cảm ơn công ty Warrentek tài trợ máy móc, thiết bị, cảm ơn anh chị cơng ty dù bận rộn với công việc tận tình dạy, tạo điều kiện tốt để em hồn thành luận văn tốt nghiệp q trình thực đề tài quý công ty Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị lớp Dược khóa 38 dạy hướng dẫn em từ ngày đầu em nhận đề tài Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới chị Nguyễn Huỳnh Kim Ngân lớp Dược B K38 giúp đỡ, hướng dẫn em từ lúc bắt đầu thực đến hoàn thành luận văn tốt nghiệp Trong trình thực đề tài, em gặp nhiều khó khăn có lúc nản lịng nhờ có bạn lớp Dược K39 đặc biệt bạn Đậu Hương, Minh Toàn, Hải Đăng, Anh Duy, Cẩm Nhung, em Phong, Cường, Thuận lớp Dược K41 anh Duy Kiệt lớp Dược A K37 động viên, ủng hộ, chia sẻ, giúp đỡ em Em xin cảm ơn người nhiều Cuối cùng, xin cảm ơn cha, mẹ em gái làm chỗ dựa vững cho con, nguồn động viên to lớn cho lúc khó khăn nhất, tạo điều kiện tốt để hoàn thành đề tài nghiên cứu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất kết số liệu luận văn hồn tồn trung thực, xác thực nghiệm chưa công bố nghiên cứu khác Cần Thơ, thứ năm ngày 07 tháng 06 năm 2018 Sinh viên Lưu Vĩnh Khang i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan glucosamin sulfat chondroitin sulfat 1.1.1 Glucosamin sulfat 1.1.2 Chondroitin sulfat 1.2 Sự khác thuốc thực phẩm chức quản lý chất lượng 1.3 Tổng quan phương pháp phân tích glucosamin chondroitin 1.3.1 Phương pháp trực tiếp 1.3.2 Phương pháp gián tiếp 1.4 Các kỹ thuật sắc ký thường sử dụng phân tích glucosamin chondroitin 11 1.4.1 Kỹ thuật sắc ký lỏng siêu cao áp (UHPLC) đầu dò Uv-vis PDA11 1.4.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ LC/MSn 14 1.5 Một số nghiên cứu định lượng glucosamin chondroitin 15 1.5.1 Các phương pháp định lượng dược điển 15 1.5.2 Các phương pháp định lượng cơng bố tạp chí 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng-địa điểm nghiêm cứu 19 ii 2.2 Dung mơi-hóa chất 19 2.3 Trang thiết bị 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Chuẩn bị mẫu 20 2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký tách glucosamin chondroitin phương pháp UPLC 21 2.4.3 Thẩm định quy trình định lượng glucosamin chondroitin phương pháp UPLC 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký tách glucosamin chondroitin phương pháp UPLC 31 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ sắc ký glucosamin chondroitin phương pháp UPLC đầu dò MS, cột HILIC 31 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký glucosamin chondroitin hệ thống UPLC đầu dò TUV, cột HILIC 33 3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký glucosamin chondroitin phương pháp gián tiếp tạo dẫn xuất trước cột hệ thống UPLC đầu dò TUV, cột C18 34 3.2 Thẩm định quy trình định lượng glucosamin chondroitin phương pháp UPLC 38 3.2.1 Thẩm định quy trình định lượng glucosamin kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột 38 3.2.2 Thẩm định quy trình định lượng chondroitin phương pháp UPLC đầu dò TUV, cột HILIC 47 3.3 Ứng dụng quy trình định lượng glucosamin chondroitin số chế phẩm thị trường 54 Chương BÀN LUẬN 55 4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký tách glucosamin chondroitin phương pháp sắc UPLC 55 4.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ sắc ký glucosamin chondroitin phương pháp UPLC đầu dò khối phổ, cột HILIC 55 iii 4.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký glucosamin chondroitin phương pháp UPLC đầu dò TUV, cột HILIC 56 4.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng glucosamin chondroitin phương pháp gián tiếp tạo dẫn xuất trước cột hệ thống UPLC, đầu dò TUV, cột C18 57 4.2 Thẩm định quy trình định lượng glucosamin chondroitin phương pháp UPLC 61 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AOAC Ý nghĩa Chữ nguyên Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa học Chemists phân tích As Assymetry Hệ số bất đối BP British Pharmacopoeia Dược điển Anh CFDA China Food and Drug Cục quản lý thực phẩm Aministration dược phẩm Trung Quốc CS Chondroitin Sulfate DMSO Dimethyl Sulfoxide DSHEA Dietary Supplement Health and Cục quản lý giáo dục an Education Act toàn sức khỏe thực phẩm chức ESI Electrospray Ionization Ion hóa tia điện FD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang FMOC-Cl Fluorenylmethyloxycarbonyl chlorid FOSHU Food for Specified Health Uses Quy định thực phẩm đặc biệt hỗ trợ sức khỏe GC Glucosamine Hydro Chlorid GMP Good Manufacturing Practice Thực hành tốt sản xuất HILIC Hydrophilic Interaction Liquid Sắc ký theo chế tương tác Chromatography ưa nước v HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography ICH International Conference Hiệp hội đồng thuận quốc tế Harmonisation LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MeCN CH3CN, Acetonitrile MeOH CH3OH, Methanol MRM Multiple Reaction Monitoring Chế độ kiểm soát đa phản ứng MS Mass Spectrometry Khối phổ OPA ortho-phthalaldehyde PDA/DAD Photodiode Array Đầu dò dãy diod quang RP Reverse Phase Pha đảo RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SRM Selected Reaction Monitoring Chế độ kiểm sốt phản ứng có chọn lọc SIM Selected Ion Monotoring Chế độ theo dõi ion chọn lọc tR Retention time Thời gian lưu TUV Tunable Ultraviolet Đầu dò tử ngoại đa điều chỉnh UHPLC Ultra High Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu Chromatography USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Sự khác thuốc thực phẩm chức quản lý chất lượng Bảng 1.2 So sánh ưu, nhược điểm phương pháp trực tiếp gián tiếp định lượng glucosamin chondroitin 10 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu định lượng glucosamin chondroitin 17 Bảng 2.1 Dung môi, hóa chất 19 Bảng 2.2 Trang thiết bị 20 Bảng 2.3 Khảo sát tỉ lệ pha động tìm điều kiện sắc ký hệ thống UPLC/TUV, cột HILIC 22 Bảng 2.4 Tỉ lệ pha động hệ gradient MeCN - Nước 24 Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ glucosamin chondroitin 31 Bảng 3.2 Kết khảo sát thay đổi tỉ lệ pha động MeCN – Nước 33 Bảng 3.3 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng 35 Bảng 3.4 Các sắc ký đồ tỉ lệ pha động khảo sát định lượng glucosamin phương pháp tạo dẫn xuất với FMOC-Cl 36 Bảng 3.5 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn dẫn xuất glucosamin-FmocCl 38 Bảng 3.6 Kết nồng độ diện tích dẫn xuất glucosamin-FmocCl khảo sát tính tuyền tính miền giá trị 40 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính tuyến tính dẫn xuất glucosamin-FmocCl 41 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ lặp lại (n = 6) dẫn xuất glucosamin-FmocCl 42 Bảng 3.9 Kết độ xác liên ngày dẫn xuất glucosamin-FmocCl 44