Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng thành phần hóa học có hoạt tính chống oxy hóa của cây thù lù cạnh (physalis angulata)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN HUỲNH KIM NGÂN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRONG LÁ CÂY THÙ LÙ CẠNH (PHYSALIS ANGULATA) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Cần Thơ - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN HUỲNH KIM NGÂN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TRONG LÁ CÂY THÙ LÙ CẠNH (PHYSALIS ANGULATA) Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân Cần Thơ – 2020 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn lời cảm ơn sâu sắc em xin gửi đến cô PGs Ts Nguyễn Thị Ngọc Vân Cô dìu dắt em từ cịn sinh viên đại học trở thành học viên cao học Ngồi việc dạy bảo chun mơn cịn dạy em cách sống, thái độ nghề nghiệp truyền cho em nhiệt huyết để theo đuổi đam mê Em cảm thấy may mắn trở thành học trị Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô Liên mơn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm - Độc chất: thầy Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, cô Ths Dương Thị Trúc Ly, thầy Ths Lữ Thiện Phúc, thầy Ths Nguyễn Mạnh Quân, cô Nguyễn Thị Đặng kỹ thuật viên Đỗ Trung Hiền động viên, khích lệ tinh thần tạo điều kiện thuận lợi thời gian em thực luận văn môn Em xin gửi lời cám ơn đến thầy, khoa Dược hết lịng hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành luận văn Và thiếu sót lớn quên đề cập đến anh/chị học viên cao học kiểm nghiệm thuốc – độc chất khóa 2018 - 2020 Cảm ơn anh/chị quan tâm, chăm sóc sát cánh suốt thời gian qua Xin chân thành cám ơn hai đồng nghiệp chị Trịnh Hoài Thương em Lê Thị Hồng Diễm ủng hộ em mặt tinh thần san sẻ công việc cho em để em hồn thành khóa học Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ gia đình ln chỗ dựa vững chắc, nguồn động lực lớn lao tiếp thêm sức mạnh ý chí tinh thần để vượt qua khó khăn, thử thách hồn thành nghiên cứu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết luận văn hoàn toàn trung thực chưa cơng bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày 03 tháng 10 năm 2020 Học viên Nguyễn Huỳnh Kim Ngân i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iiv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ v ĐẶT VẤN ĐỀ Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Thù lù cạnh 1.2 Thành phần hóa học hoạt tính dược lý Thù lù cạnh 1.3 Tổng quan acid chlorogenic, acid caffeic, acid p-coumaric, rutin, quercitrin, quercetin kaempferol 1.3.1 Tính chất vật lý hóa học 1.3.2 Hoạt tính sinh học acid phenolic flavonoid 11 1.4 Các phương định lượng acid phenolic flavonoid 15 1.5 Một số nghiên cứu liên quan đến thù lù cạnh 16 Chương – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Hóa chất, chất chuẩn, thiết bị 18 2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 19 2.2.3 Cỡ mẫu 19 2.2.4 Phương pháp chọn mẫu 19 2.2.5 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.5.1 Đánh giá sơ hàm lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 19 2.2.5.2 Xây dựng quy trình chiết xuất chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 21 ii 2.2.5.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 24 2.2.6 Phương pháp thu thập đánh giá số liệu 31 2.2.7 Phương pháp kiểm soát sai số 31 2.2.8 Phương pháp xử lý phân tích số liệu 31 2.3 Đạo đức nghiên cứu 31 Chương – KẾT QUẢ 32 3.1 Đánh giá sơ hàm lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 32 3.2 Thăm dị điều kiện chiết xuất chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 33 3.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 37 Chương – BÀN LUẬN 47 4.1 Đánh giá sơ hàm lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 47 4.2 Xây dựng quy trình chiết xuất chất có hoạt tính chống oxy hóa (acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 48 4.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 52 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt As Asymmetry Hệ số bất đối AOAC Association of official Hiệp hội hóa học phân tích analytical chemists quốc tế Diode Array Detector Đầu dò dãy diod quang DAD ĐK Điều kiện EtOH Ethanol HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MeCN Acetonitril MeOH Methanol PTFE Poly(tetrafluoroethylene) ROS Reactive oxygen species Gốc tự oxy hóa Rs Resolution Độ phân giải ROS Reactive oxygen species Gốc tự oxy hóa rpm Rotate Per Minute Vịng/phút RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SKĐ Sắc ký đồ tR Retention time THF Tetrahydrofuran Tài liệu tham khảo TLTK UV Thời gian lưu pic Ultraviolet Tử ngoại iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt cơng dụng thù lù cạnh y học cổ truyền Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học thù lù cạnh Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học số acid phenolic 14 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu giới liên quan đến định lượng thành phần acid phenolic flavonoid thù lù cạnh 17 Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết siêu âm .22 Bảng 2.2 Khảo sát dung môi chiết 23 Bảng 2.3 Khảo sát thể tích dung mơi chiết 23 Bảng 2.4 Khảo sát thời gian chiết 24 Bảng 2.5 Khảo sát số lần chiết 24 Bảng 2.6 Các điều kiện gradient khảo sát 26 Bảng 2.7 Các mức nồng độ độ chất phân tích 30 Bảng 3.1 Kết định tính phản ứng hóa học 32 Bảng 3.2 Kết định lượng phenolic tổng 33 Bảng 3.3 Kết định lượng flavonoid tổng 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 34 Bảng 3.5 Kết khảo sát điều kiện pha động 39 Bảng 3.6 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn 42 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ 44 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ xác ngày (n = 6) 45 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ xác liên ngày (n = 18) 45 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ ba mức nồng độ (n=18) 46 Bảng 3.11 Hàm lượng acid phenolic flavonoid mẫu thù lù cạnh thu hái Kiên Giang 46 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cây thù lù cạnh Hình 1.2 Cấu trúc hóa học phổ UV-Vis acid chlorogenic Hình 1.3 Cấu trúc hóa học acid caffeic Hình 1.4 Cấu trúc hóa học acid p-coumaric Hình 1.5 Cấu trúc hóa học rutin Hình 1.6 Cấu trúc hóa học quercitrin 10 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học quercetin 10 Hình 1.8 Cấu trúc hóa học kaempferol 11 Hình 3.1 Kết định tính phản ứng hóa học mẫu lá, đài 32 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chiết methanol 34 Hình 3.3 Phổ UV acid chlorogenic rutin 34 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát dung môi chiết 35 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát tỉ lệ khối lượng dược liệu/thể tích dung mơi chiết 35 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát thời gian chiết 36 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát số lần chiết 36 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chiết acid phenolic flavonoid khảo sát 37 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn điều kiện gradient 38 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn điều kiện gradient 38 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn điều kiện gradient 10 39 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu chuẩn bước sóng 225, 250 300 nm 41 Hình 3.13 Sắc ký đồ tương thích hệ thống mẫu chuẩn 43 Hình 3.14 Sắc ký đồ thể độ đặc hiệu 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Thù lù cạnh (Physalis angulata L thuộc họ Cà – Solanaceae) loại thân thảo vùng nhiệt đới mọc nhiều nơi giới [1] Ở Việt Nam thù lù cạnh mọc hoang dại khắp từ bắc đến nam [4] Đây dược liệu sử dụng lâu đời phổ biến dân gian Việt Nam với nhiều công dụng Ở nước ta, thù lù cạnh (Physalis angulata L.) dễ bị nhầm lẫn với số khác chi Physalis có hình thái tên gọi tương tự thù lù nhỏ (Physalis minima L.), thù lù lông (Physalis peruviana L), thù lù kiểng (Physalis alkekengi L.) [1] Đặc biệt nhiều nơi nhầm lẫn thù lù cạnh với thù lù đực gọi lu lu đực (Slolanum nigrum L.) họ Solanaceae khác chi, nhầm lẫn gây nguy hiểm thù lù đực có chứa độc tố solanin với liều thấp, dùng nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe [4] Do đó, cần có tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu thù lù cạnh nhằm đánh giá chất lượng phân biệt dược liệu với lồi khác Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thu thập chủ yếu từ Ấn Độ, Indonesia, Ghana, Nigeria, Kenya….[12], [14], [21], [25], [42] Thành phần hóa học bao gồm hợp chất thuộc nhóm steroid thực vật, alkaloid, acid phenolic flavonoid [12], [30], [40] Đặc biệt nhóm acid phenolic flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khối u, kháng viêm, trị đái tháo đường…[12], [18], [20], [40], [41] Nhóm acid phenolic flavonoid có hàm lượng hoạt chất thay đổi theo phận dùng, thời điểm sinh trưởng có tính đặc trưng riêng cho lồi thuộc chi Physalis [17], [31] Do dựa vào việc định lượng nhóm hoạt chất flavonoid để đánh giá chất lượng dược liệu thù lù cạnh Ở Việt Nam, cơng trình nghiên cứu thù lù cạnh cịn chủ yếu 56 Nghiên cứu tác giả Cobadela cộng (2017) dùng hệ pha động hai thành phần MeCN acid ortho-phosphoric/nước pH 2,8, tốc độ dịng 0,8 mL/phút, thời gian phân tích 60 phút [17] Nghiên cứu tác giả Akomolafe SA cộng (2018) dùng hệ pha động ba thành phần gồm MeCN, MeOH 1% acid formic/nước, tốc độ dòng 0,7 mL/phút, thời gian phân tích 80 phút định lượng 11 acid phenolic flavonoid thù lù cạnh [9], [10] Nghiên cứu tác giả Oliveira AM cộng (2020) dùng hệ pha động hai thành phần gồm 0,1% THF/MeOH 0,1% THF/nước, tốc độ dòng 0,7 mL/phút, thời gian phân tích 70 phút định lượng acid phenolic thù lù cạnh [35] So sánh với nghiên cứu trên, quy trình định lượng xây dựng có tương đồng thơng số: phân tích hệ thống HPLC/DAD, cột sắc ký C18 (150 mm x 4,6 mm) kích thước hạt µm, hệ pha động gồm ba thành phần MeCN, MeOH đệm acid hóa Tuy nhiên, việc sử dụng ammonium actetate với vai trò vừa hệ đệm vừa chất modifier acid formic tạo pH acid cho hệ pha động đem lại ưu điểm sau: + Nồng độ acid thấp (0,1%) acid formic thân thiện với hệ thống sắc ký acid acetic hay acid phosphoric Việc sử dụng đệm hữu tạo linh hoạt thành phần tỉ lệ pha động acetonitrile so với hệ đệm phosphate + Muối ammonium acetate acid formic dễ bay hơi, quy trình áp dụng cho hệ thống sắc ký đầu dò dãy diod quang (DAD) khối phổ (MS) + Hạn chế tương tác tĩnh điện nhóm Silanol bề mặt pha tĩnh với chất phân tích, giảm ảnh hưởng tốc độ dịng tới chuyển khối chất phân tích pha động pha tĩnh (thơng số C phương trình 57 Van Deemter), tăng lưu giữ với acid phenolic tiến hành phân tích với tốc độ dòng mL/phút + Việc cài đặt tốc độ dòng mL/phút giúp hạn chế tượng kéo đuôi khuếch tán dọc cột chất phân tích (theo phương trình Van Deemter) rút ngắn thời gian phân tích Ngồi ra, nhận thấy việc phân tích chất có độ phân cực trung bình đến cao acid phenolic flavonoid dẫn đến việc loại tạp phân cực từ mẫu không trọng [9], [10], [16], [17] Điều dẫn đến giảm tuổi thọ cột sắc ký, nhanh dơ đầu dò hệ thống tiêm mẫu, gây ảnh hưởng đến mũi tiêm sau dạng pic rửa giải chậm từ mũi tiêm trước Do đó, đa số nghiên cứu chọn tăng tỉ lệ dung môi hữu (thường MeCN) đến 90 – 100% cuối gradient để rửa tạp phân cực khỏi cột [9], [16], [17], nhiên, giải pháp loại bỏ ảnh hưởng tạp từ mũi tiêm trước đến mũi tiêm sau để sót chất phân cực cột, gây thay đổi chất hạt pha tĩnh, gây bẩn hệ thống tiêm mẫu đầu dị Do đó, quy trình định lượng xây dựng có ưu điểm việc loại tạp phân cực n-hexane giai đoạn chuẩn bị mẫu, trước tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký nhằm đảm bảo hiệu hệ thống 4.3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic, acid p-coumaric, rutin, quercitrin, quercetin kaempferol phương pháp HPLC/DAD 4.3.2.1 Độ đặc hiệu Bên cạnh việc xác định tính đặc hiệu dựa vào mũi tiêm mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn qua thông số thời gian lưu, đầu dò dãy diod quang cung cấp thơng tin định tính phổ UV-Vis chất phân tích tinh khiết pic Thơng qua thơng số tinh khiết pic, đánh giá 58 xen phủ pic tạp pic chất phân tích, đặc biệt với mẫu phức tạp mẫu dược liệu Kết kiểm tra tinh khiết pic acid chlorognic, acid caffeic, acid p-coumaric, rutin, quercitrin, quercetin kaempferol mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn đạt 99% Đi kèm với kết thời gian lưu tương đồng phổ UV chất phân tích mẫu thử mẫu chuẩn, kết luận quy trình đạt độ đặc hiệu 4.3.2.2 Tính tuyến tính Từ hiệu suất thu hồi quy trình chiết xử lý mẫu, ảnh hưởng không đáng kể sử dụng đầu dị DAD, xây dựng đường tuyến tính dung mơi Với khoảng tuyến tính từ 5,0 đến 500 µg/mL với hai chất rutin acid chlorogenic; từ 2,0 đến 80 µg/mL với chất acid caffeic, acid pcouamric, quercitrin, quercetin kaempferol Hệ số tương quan lớn 0,995 với tất chất Đây khoảng tuyến tính rộng, phù hợp cho việc định lượng hoạt chất dược liệu vốn có biến động cao nồng độ Ngồi ra, acid chlorogenic rutin diện mẫu thử với hàm lượng cao, có khoảng tuyến tính mở rộng phía nồng độ cao so với hoạt chất cịn lại 4.3.2.3 Độ xác độ Độ xác tiến hành mẫu thử với độ xác ngày có RSD% khoảng 0,80 – 2,58% Độ xác liên ngày chất khoảng 0,77 – 4,03% đạt yêu cầu theo quy định AOAC (RSD% < 4% với độ xác ngày < 8% với độ xác liên ngày) [11] Điều cho thấy quy trình định lượng có sai số ngẫu nhiên kiểm sốt tốt nằm giới hạn cho phép Độ tiến hành mẫu trắng thêm chuẩn với ba mức nồng độ thấp, trung bình cao Do chênh lệch nồng độ acid chlorogenic rutin với chất phân tích cịn lại mẫu nên hai chất thẩm định 59 với mức nồng độ 0,1; 0,2 0,3%, chất lại thẩm định ba mức nồng độ 0,02; 0,04 0,06% Tỉ lệ thu hồi chất nằm khoảng 101,35 – 102,87% đạt yêu cầu theo quy định AOAC (85 – 110%) [11] Cho thấy quy trình định lượng xây dựng có sai số hệ thống kiểm soát tốt nằm giới hạn cho phép Kết định lượng ba mẫu thù lù cạnh thu hái Rạch Giá Châu Thành (Kiên Giang) cho thấy: + Tất mẫu có acid phenolic bao gồm acid chlorogenic, acid caffeic, acid p-coumaric; nhóm flavonoid có rutin quercetin Tuy nhiên, không phát quercitrin kaempferol, kết khác với công bố Carniel cộng (2016), Cobadela cộng (2017), Medina – Medrano cộng (2015) [10], [17], [31] + Hàm lượng rutin acid chlorogenic cao gấp nhiều lần so với acid phenolic flavonoid khác, chiếm khoảng 90% tổng hàm lượng chất định lượng được, khác với nghiên cứu công bố [10], [17], [31] + Hàm lượng acid chlorogenic rutin mẫu dao động khoảng 0,1737 – 0,5681% 0,2121 – 0,6297%; tổng acid phenolic flavonoid định lượng nằm khoảng 0,4534 – 1,3143% Kết cao nhiều so với nghiên cứu định lượng hàm lượng acid phenolic flavonoid tác giả Carniel (2016) tiến hành toàn cây, Moreira (2018) tiến hành toàn mặt đất công bố hàm lượng acid phenolic flavonoid nằm khoảng 0,5 – 88,2 mg/kg [16], [33] Từ số nhận định trên, kết luận sơ sau: + Acid chlorogenic rutin hai thành phần nhóm acid phenolic flavonoid thù lù cạnh mọc Kiên Giang + Thành phần hàm lượng acid phenolic, flavonoid thù lù 60 cạnh thay đổi tùy thuộc vào vị trí địa lý (phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng khí hậu) Medina – Medrano cộng (2015) công bố khác thành phần acid phenolic flavonoid năm loài thuộc chi Physalis có thù lù cạnh Cobadela cộng (2017) công bố thay đổi acid phenolic flavonoid thù lù cạnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phận dùng + Việc tiến hành định lượng mẫu thay tồn toàn mặt đất nghiên cứu Carniel cộng (2017), Akomolafe cộng (2018), Moreira cộng (2018) cho kết hàm lượng acid phenolic, flavonoid cao hẳn (10 – 20 lần) [10], [16], [33] Kết hợp với kết đánh giá sơ hàm lượng acid phenolic flavonoid lá, đài, sơ kết luận phận có hàm lượng chất chống oxy hóa cao định tính chống oxy hóa toàn 61 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài “Xây dựng quy trình định lượng số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa thù lù cạnh (Physalis angulata)” thu kết sau: Đánh giá sơ hàm lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh Hàm lượng acid phenolic flavonoid thù lù cạnh cao gấp nhiều lần đài Xây dựng quy trình chiết xuất chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh Đã khảo sát quy trình chiết xuất sau: cân 0,5 g bột thù lù cạnh vào ống ly tâm 15 mL, thêm 10 mL dung môi chiết hỗn hợp MeOH : H2O – (70 : 30), vortex phút, siêu âm 15 phút, hút dịch chiết qua bình định mức 50 mL Chiết lặp lại lần, gộp dịch vào bình định mức 50 mL định mức đến vạch MeOH Hút mL dịch chiết sang ống ly tâm 15 mL khác thổi khô đến cắn dịng khí Nitơ 45 oC, hịa tan cắn 0,8 mL MeOH : H2O – (25 : 75) Loại tạp phân cực cách lắc chiết lỏng lỏng với n-hexan Lọc mẫu qua màng lọc PTFE 0,22 µm vào vial tiến hành phân tích Xây dựng thẩm định quy trình định lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Đã khảo sát điều kiện sắc ký định lượng đồng thời chất phân tích bao gồm acid chlorogenic, acid caffeic, acid p-coumaric, rutin, quercitrin, quercetin kaempferol hệ thống HPLC Agilent 1100, đầu dò DAD với điều kiện sắc ký sau: - Pha tĩnh: cột sắc ký Kromasil C18 (150 mm x 4,6 mm, 5µm) 62 - Tốc độ dịng: mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 μL - Nhiệt độ cột: 30oC - Bước sóng phát hiện: 250 nm 300nm - Pha động chương trình gradient với ba thành phần MeCN, MeOH ammonium actetate 0,2%, 0,1% acid formic/nước Đã thẩm định quy trình định lượng đồng thời chất phân tích bao gồm acid chlorogenic, acid caffeic, acid p-coumaric, rutin, quercitrin, quercetin, kaempferol đạt tiêu theo hướng dẫn AOAC: - Tính tương thích hệ thống - Tính đặc hiệu - Tính tuyến tính, miền giá trị - Giới hạn phát chất nằm khoảng 0,1 – 0,3 µg/mL, giới hạn định lượng chất nằm khoảng 0,3 – 1,0 µg/mL - Độ xác ngày độ xác liên ngày đạt yêu cầu - Độ đạt với tỉ lệ phục hồi nằm khoảng 85 - 110% 63 KIẾN NGHỊ Sau thời gian thực đề tài “Xây dựng quy trình định lượng số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa thù lù cạnh (Physalis angulata)”, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Thẩm định tiếp tục số tiêu: độ xác trung gian thay đổi kiểm nghiệm viên, độ thơ phương pháp - Áp dụng quy trình xây dựng để định lượng thêm mẫu thu hái từ tỉnh thành khác 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, nhà xuất Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội, trang 792-793 Bộ môn Dược liệu, Trường đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh (2015), Giáo trình Phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr 1-23, tr 119128 Bộ môn Dược liệu, Trường đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh (2012), Giáo trình Nhận thức dược liệu, tr.134 Phạm Hồng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Trẻ, tr 764 – 765 Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học, tập II, Nhà xuất Y học, tr 930 Nguyễn Thị Mai (2017), Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước tầm bóp Physalis angulata” (2017), khóa luận tốt nghiệp đại học, khoa Hóa, Đại học sư phạm Hà Nội Đỗ Thanh Tuân (2017), Nghiên cứu tài nguyên thuốc huyện ven biển tỉnh Thái Bình đề xuất biện pháp bảo tồn, phát triển bền vững, luận án Tiến sĩ sinh học, Học viện khoa học công nghệ Phạm Hồng Vân (2017), Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn diclometan tầm bóp Physalis angulata, khóa luận tốt nghiệp đại học, khoa Hóa, Đại học sư phạm Hà Nội Tiếng Anh Akomolafe SA, Oboh G, Oyeleye SI, Boligon AA (2016), “Aqueous extract from Ficus capensis leaves inhibits key enzymes linked to erectile dysfunction and prevent oxidative stress in rats' penile tissue”, NFS Journal 4, pp 15 –21 10.Akomolafe SA, Oyeleye SI, Olasehinde TA, Oboh G (2018), “Phenolic characterization, antioxidant activities, and inhibitory effects of Physalis angulata and N Newbouldia laevis on enzymes linked to erectile dysfunction”, International journal of food properties, vol 21, no 1, pp 645–654 11 AOAC (2011), Standard Format and Guidance for AOAC Standard Method Performance Requirement (SMPR) Documents 12 Ayodhyareddy P, Rupa P (2016), “Ethno Medicinal, Phyto Chemical and Therapeutic Importance of Physalis angulata L.: A Review”, International Journal of Science and Research, 5, pp 2122 – 2127 13 Bastos CNT, Silveira AJA, Salgado CG, Picanco-Diniz DLW, de Nascimento JLM (2008), “Physalis angulata extracts exerts antiinflammatory effects in rats inhibiting different pathways”, J Etnhopharmacology, 118, pp 251-264 14 Bourdy G, DeWalt S, Chávez L, Roca A, Deharo E, Muñoz V, Balderrama L, Quenevo C, Gimenez A (2000), “Medicinal plants uses of the Tacana, an Amazonian Bolivian ethnic group”, J Ethnopharmacol, 70, pp 87 - 109 15 Brar R, Gupta RC (2017), “Phytochemical Analysis of Two Cytotypes (2x and 4x) of Physalis angulata an Important Medicinal Plant, Collected from Rajasthan”, Biochemistry & Molecular Biology Journal, vol 3, pp – 16 Carniel N, Dallago GM, Dariva C, Bender PJ, Nunes A, Zanella O, Bilibio D, Priamo WL (2016), “Microwave-assisted extraction of Phenolic acids and Flavonoids from Physalis angulata”, Journal of Food Process Engineering, pp – 11 17 Cobaleda-Velasco M, Alanis-Bañuelos RE, Almaraz-Abarca N, RojasLópez M, González-Valdez L, Ávila-Reyes JA, Rodrigo S (2017) “Phenolic profiles and antioxidant properties of Physalis angulata L as quality indicators”, Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research, (2), pp 114-128 18 Donkor AM, Glover RLK, Boateng JK, Gakpo VY (2012), “Antibacterial activity of the fruit extract of Physalis angulata and its formulation”, J Med and Biomed Sci, 1(4), pp 21-26 19 Ferreira LM, Vale AE, Souzal AJ, Leite KB , Sacramento C, Moreno ML et al (2020), “Anatomical and Phytochemical Characterization of Physalis angulata L.: A Plant with Therapeutic Potential”, Pharmacognosy Research, vol 11, pp 171 – 177 20 Ganeshpurkar A, Saluja AK (2017), “The Pharmacological Potential of Rutin”, Saudi Pharm J., 25(2), pp 149-164 21 Geissler P, Harris S, Prince R, Olsen A, Odhiambo R, Oketch-Rabah H, Madiega P, Andersen A, Molgaard P (2002), “Medicinal plants used by Luo mothers and children in Bondo district, Kenya”, J Ethnopharmacol , 83, pp 39 - 54 22 Ghasemzadeh A, Ghasemzadeh N (2011), “Review Flavonoids and phenolic acids: Role and biochemical activity in plants and human”, Journal of medicinal plant research, vol 5, pp 6697 – 6703 23 Ismail N, Alam M (2001), “A novel cytotoxic flavonoid glycoside from Physalis angulate”, Fitoterapia, 72, pp 676-679 24 Jitan SA, Alkhoori SA, Yousef LF (2018), “Phenolic acids from plants: extraction and application to human health”, Studies in Natural Products Chemistry, vol 58, pp 389 – 412 25 Jovel E, Towers G, Cabanillas J (1996), “An ethnobotanical study of the tradicional medicine of the Mestizo people of Suni Miraño, Loreto, Peru”, J Ethnopharmacol, 53, pp 149 – 153 26 Kaurinovic B, Vastag D (2019), “Flavonoids and phenolic acids as potential natural antioxidants”, IntechOpen, pp – 14 27 Lawal I, Uzokwe N, Igboanugo A, Adio A, Awosan E, Nwogwugwu J, Faloye B, Olatunji B, Adesoga A (2010), “Ethno medicinal information on collation and identification of some medicinal plants in Research Institutes of South-west Nigeria”, Afr J Pharm Pharmaco, 4, pp - 28 Liazid A, Palma M, Brigui J, Barroso CG (2007), “Investigation on phenolic compounds stability during microwave-assisted extraction”, Journal of Chromatography A, 1140, pp 29 – 34 29 Lide DR (2016), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 78th Ed., Boca Raton, FL, CRC Press, pp 479 30 Lima LG, Montenegro J, Pimentel de Abreu J, Santos MC, Pimenta Nascimento T, Silva Santos M et al (2020), “Metabolite Profiling by UPLC-MSE, NMR, and Antioxidant Properties of Amazonian Fruits: Mamey Apple (Mammea americana), Camapu (Physalis angulata), and Uxi (Endopleura uchi)”, Molecules 2020, 25, 342, pp – 18 31 Medina‑Medrano JR, Almaraz‑Abarca N, González‑Elizondo S, Uribe‑ Soto NJ, González‑Valdez LS, Herrera‑Arrieta Y (2015), “Phenolic constituents and antioxidant properties of five wild species of Physalis (Solanaceae)”, Bot Stud, 56:24, pp – 13 32 Milena BPS, Moema CB, Ivone MR, Therezinha CBT, Ricardo RS (2003), “Inhibition of macrophage activation and lipopolysaccarideinduced death by seco-steroids purified from Physalis angulata L.”, Eur J Pharmacol, 459, pp 107-112 33 Moreira GC, Souza Dias F (2018), “Mixture design and Doehlert matrix for optimization of the ultrasonic assisted extraction of caffeic acid, rutin, catechin and trans-cinnamic acid in Physalis angulata L and determination by HPLC/DAD”, Microchemical Journal, vol 141, pp 247-252 34 Neue UD (1997), HPLC colums: theory, technology and practice, Wiley – VCH, USA, pp 109 – 115 35 Oliveira AM, Malunga LN, Perusselloc CA, Betad T, Ribanie RH (2020), “Phenolic acids from fruits of Physalis angulata L in two stages of maturation”, South African Journal of Botany, 131, pp 448 – 453 36 Pietro RCLR, Kashima S, Sato DN, Januario AH, Franca SC (2000), “In vitro antimycobacterial activities of Physalis angulata L.”, Phytomedicine, 7(4), pp 335-338 37 Pinto NB, Morais TC, Carvalho KMB, Silva CR, Andrade GM, Brito GAC et al (2010), “Topical anti-inflammatory potential of Physalin E from Physalis angulata on experimental dermatitis in mice”, Phytomedicine, 17, pp 740-743 38 Rathore C, Dutt KR, Sahu S, Deb L (2011), “Antiasthmatic activity of the methanolic extract of Physalis angulata Linn.”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol 5(22), pp 5351-5355 39 Reddy CS, Reddy KN, Murthy EN, Raju VS (2009), “Traditional medicinal plants in Seshachalam hills, Andhra Pradesh, India”, J Med Plant Res,3, pp 408 - 412 40 Rengifo-Salgado E, Vargas-Arana G (2013), “Physalis angulata L (Bolsa Mullaca): A Review of its Traditional Uses, Chemistry and Pharmacology”, Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 12 (5), pp 431 – 445 41 Rivera DE, Ocampo YC, Castro JP, Barrios L, Diaz F, Franco LA (2018), “A screening of plants used in Colombian traditional medicine revealed the anti-inflammatory potential of Physalis angulata calyces”, Saudi Journal of Biological Sciences, pp – 42 Roosita K, Kusharto C, Sekiyama M, Fachrurozi Y, Ohtsuka R (2008) , “Medicinal plants used by the villagers of a Sundanese community in West Java, Indonesia”, J Ethnopharmaco, 115, pp 72 81 43 Setyaningsih W, Saputro IE, Palma M, Barroso CG (2016), “Stability of 40 phenolic compounds during ultrasound-assisted extractions (UAE)”, Advances of Science and Technology for Society, pp – 44 Shu-Jing W, Lean-Teik N, Ching-Hsein Ch, Doung-Liang L, Shyh-Shyan W, Chun-Ching L (2004), “Antihepatoma activity of Physalis angulata and P peruviana extracts and their effects on apoptosis in human Hep G2 cells”, Life Sciences, 74, pp 2061-2073 45 Snyder LR, Kirkland JJ, Dolan JW (2009), Introduction to modern liquid chromatography, 3rd edition, A John Wiley and Sons, USA, pp 304 – 349 46 Susanti RF, Kurnia K, Vania A, Reynaldo IJ (2015), “Total phenol, flavanoid and antioxidant activity of Physalis angulata leaves extract by Subcritical Water Extraction”, Modern Applied Science, vol 9, no 7, pp 190 – 198 47 Ton Nu Lien Huong, Ly Anh Van, Nguyen Duy Thanh, Nguyen Thi Thu Suong, Nguyen Hoang Phuong, Nguyen Dinh Cung Tien (2016), “Chemical constituents of Physalis angulata L (Family Solanaceae)”, Can Tho University Journal of Science, Vol 2, pp 46-49 48 Tungmunnithum J, Thongboonyou A, Pholboon A, Yangsabai A (2018), “Flavonoids and other phenolic compounds from medicinal plants for pharmaceutical and medical aspects: An overview”, Medicines, 5, 93, pp – 16 49 Whistler WA (1991), “Herbal medicine in the kingdom of Tonga”, J Ethnopharmacol, 31, pp 339 - 372 ... 4.2 Xây dựng quy trình chiết xuất chất có hoạt tính chống oxy hóa (acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 48 4.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời chất có hoạt tính chống oxy. .. lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh - Xây dựng quy trình chiết xuất chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh - Xây. .. tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh 21 ii 2.2.5.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa (nhóm acid phenolic flavonoid) thù lù cạnh