0110 nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng vitamin c trong viên sủi bọt đa thành phần bằng phương pháp hplc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN PHƯƠNG MINH THẢO NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C TRONG VIÊN SỦI BỌT ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Cần Thơ - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN PHƯƠNG MINH THẢO NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C TRONG VIÊN SỦI BỌT ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khoa học: Ts Nguyễn Thị Ngọc Vân Ds Nguyễn Thị Tường Vi Cần Thơ – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin kính gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Ts Nguyễn Thị Ngọc Vân cô Ds Nguyễn Thị Tường Vi, người ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên em trình thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người thầy nhiệt tình giúp đỡ ln tận tình truyền đạt cho em kinh nghiệm kiến thức quý báu, tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến tất thầy Bộ mơn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm – Độc Chất, trường Đại học Y Dược Cần Thơ, đặc biệt thầy ThS Lữ Thiện Phúc, cô ThS Dương Thị Trúc Ly truyền đạt cho em kiến thức vô quý giá, Nguyễn Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Đặng cô Trần Thị Thanh Thúy giúp đỡ em tạo điều kiện thuận lợi trình em làm đề tài môn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất quý thầy cô trường Đại học Y Dược Cần Thơ hết lòng truyền đạt kiến thức phát triển kỹ cho em suốt năm học vừa qua Con xin cảm ơn ba mẹ ln chăm sóc, u thương nguồn động lực to lớn giúp học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn anh chị phịng Kiểm Nghiệm Cơng Ty Cổ Phần Dược Hậu Giang tận tình giúp đỡ em trình em làm luận văn Xin gửi lời cảm ơn đến bạn làm luận văn mơn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm – Độc Chất bạn mơn khác ln sẵn lịng giúp đỡ bên cạnh thời gian qua LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Nguyễn Phương Minh Thảo xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết nêu luận văn hoàn toàn trung thực, chưa sử dụng tài liệu khác Thành phố Cần Thơ – 9/6/2015 Nguyễn Phương Minh Thảo i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vitamin C 1.2 Các phương pháp phân tích vitamin C 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 12 1.4 Thẩm định quy trình phương pháp HPLC 12 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Địa điểm phương tiện nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 Chương - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Kết khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu 22 3.2 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 24 3.3 Kết thẩm định quy trình 26 3.4 Áp dụng quy trình định lượng 34 Chương - BÀN LUẬN 36 4.1 Điều kiện sắc ký tối ưu 36 4.2 Tính tương thích hệ thống 41 4.3 Thẩm định quy trình định lượng 41 4.4 Áp dụng quy trình định lượng 44 ii KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt, ký hiệu Chữ nguyên Ý nghĩa As Asymmetry Hệ số bất đối Bocalex Bocalex Multi Chế phẩm Bocalex Multi vitamin Dược Điển Anh BP British Pharmacopoeia DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EP European Pharmacopoeia Dược Điển Châu Âu HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao International Conference Hiệp hội đồng thuận on Harmonisation quốc tế ICH LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng 10 MeOH Methanol Dung môi Methanol 11 N Number of theoretical Số đĩa lý thuyết plates 12 Plusssz Plusssz Max Multi Chế phẩm Plusssz Max Multi 13 Ppm Parts per million Một phần triệu 14 RNI Recommended Nutrition Lượng dinh dưỡng Intakes khuyến cáo ngày 15 RS Resolution Độ phân giải 16 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối 17 S Area Diện tích đỉnh (đơn vị: mAU.phút) 18 SD Standard deviation Độ lệch chuẩn iv 19 tR Retention time Thời gian lưu pic (đơn vị: phút) 20 TT Thuốc thử 21 TT/BYT Thông tư Bộ Y Tế 22 USP The United States Dược Điển Mỹ Pharmacopeia 23 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Lượng dùng vitamin C khuyến cáo ngày cho người Việt Nam (RNI) Bảng 1.2 Các phương pháp định lượng nguyên liệu vitamin C Bảng 1.3 Các phương pháp định lượng vitamin C viên nén 10 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu định lượng vitamin C phương pháp HPLC11 Bảng 2.1 Các sản phẩm để xây dựng, thẩm định quy trình định lượng (1) áp dụng quy trình (2) 15 Bảng 2.2 Các hóa chất, dung mơi dùng 16 Bảng 2.3 Các thiết bị dùng 16 Bảng 3.1 Kết tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn (n=6) 24 Bảng 3.2 Kết tính tương thích hệ thống mẫu thử Bocalex 25 Bảng 3.3 Kết tính tương thích hệ thống mẫu thử Plusssz 25 Bảng 3.4 Diện tích đỉnh trung bình vitamin C mẫu chuẩn nồng độ 27 Bảng 3.5 Kết độ xác vitamin C mẫu thử Bocalex 29 Bảng 3.6 Kết độ xác vitamin C mẫu thử Plusssz 31 Bảng 3.7 Kết độ vitamin C mẫu thử Bocalex 32 Bảng 3.8 Kết độ vitamin C mẫu thử Plusssz 33 Bảng 3.9 Hàm lượng vitamin C lô sản phẩm định lượng Bocalex Plusssz 35 Bảng 4.1 Các thông số pic vitamin C không điều chỉnh pH dung dịch mẫu Bocalex 36 vi Bảng 4.2 Các thông số pic vitamin C sau điều chỉnh pH dung dịch mẫu Bocalex 37 Bảng 4.3 Các thông số pic vitamin C sau điều chỉnh pH dung dịch mẫu Plusssz 37 Bảng 4.4 Các thơng số kiểm định phương trình hồi quy 42 Bảng 4.5 Nhu cầu vitamin C ngày theo WHO 45 37 Thực điều chỉnh pH dung dịch mẫu thử Bocalex pH acid H3PO4 trước bổ sung thể tích vào bình định mức thu thông số pic đạt (Bảng 4.2) Bảng 4.2 Các thông số pic vitamin C sau điều chỉnh pH dung dịch mẫu Bocalex Mẫu Bocalex Trung bình TR S (phút) (mAU*phút) 4,03 60,25 RS As N 4,77 0,98 12248 Kết RSD% diện tích đỉnh mũi tiêm liên tiếp mẫu đạt: 1,39% Khi áp dụng quy trình pha mẫu vào chế phẩm Plusssz, thu kết bảng 4.3 Bảng 4.3 Các thông số pic vitamin C sau điều chỉnh pH dung dịch mẫu Plusssz Mẫu Plusssz Trung bình TR S (phút) (mAU*phút) 3,99 71,13 RS As N 6,70 0,99 11699 Kết RSD% diện tích đỉnh mũi tiêm liên tiếp mẫu đạt: 0,49% Do đó, chúng tơi chọn quy trình pha mẫu mục 2.3.1.2 Chọn bước sóng để định lượng: Từ kết phổ UV, vitamin C có đỉnh hấp thu 248nm Nên chọn bước sóng để xây dựng điều kiện sắc ký tối ưu 248 nm Chọn hệ pha động thích hợp: Tiến hành sắc ký với hệ pha động dự kiến để tiến hành sắc mẫu thử Bocalex Plusssz Tuy nhiên để tiết kiệm thời gian hóa chất nghiên cứu, bắt đầu tiến hành điều kiện sắc ký vào mẫu thử Bocalex trước, có hệ pha động phù hợp áp dụng hệ vào mẫu thử Plusssz để khảo sát lại Với hệ pha động isocratic MeOH : H3PO4 pH 4,0 (5:95) (1), pic vitamin C có thời gian lưu dài dài (khoảng 10 phút) pic có tượng bị doãng (chiều rộng đáy lên đến khoảng 1,72 phút) Điều kiện sắc ký với hệ pha động không đạt 38 hệ số bất đối pic (hệ số bất đối 0,55) Do đó, khơng phải điều kiện sắc ký tối ưu Chúng tiến hành thăm dò thêm với hệ khác Vitamin C Hình 4.1 Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (1) Với hệ pha động isocratic MeOH : H3PO4 pH 3,5 (5:95) (2), pic vitamin C có cải thiện thời gian lưu pic vitamin C (ngắn hệ (1) 5,5 phút) Nhưng pic cịn bị dỗng với chiều rộng đáy pic 0,36 phút hệ số bất đối không đạt (0,63), nên chúng tơi thăm dị điều kiện Vitamin C Hình 4.2 Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (2) Với hệ pha động isocratic MeOH : H3PO4 pH 3,0 (5:95) (3), kết thu pic vitamin C mẫu chuẩn: 39 - Pic có chiều rộng chân pic hẹp (từ 0,36 phút xuống 0,14 phút), đỉnh nhọn - Thời gian lưu ngắn (từ 5,5 phút xuống 4,0 phút) - Hệ số bất đối 1,00 Vitamin C Hình 4.3 Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (3) Áp dụng hệ pha động (3), tiêm mẫu thử Bocalex, thu kết quả: - Thời gian lưu pic vitamin C 4,02 phút - Chiều rộng chân pic 0,13 phút - Hệ số bất đối 0,97 - Tách hoàn toàn pic vitamin C khỏi pic tạp chất (đối với pic vitamin C tiêm mẫu thử Bocalex) - Thời gian pic tạp cuối khỏi cột khoảng phút 40 Vitamin C Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu thử Bocalex với hệ pha động (3) Khi áp dụng quy trình lên mẫu thử Plusssz, thu kết tương tự mẫu thử Bocalex: pic vitamin C tách tốt khỏi pic khác thông số pic vitamin C đạt yêu cầu Vitamin C Hình 4.5 Sắc ký đồ mẫu thử Plusssz với hệ pha động (3) Từ đó, điều kiện sắc ký tối ưu là: - Hệ thống máy Dionex Ultimate 3000 - Hệ pha động: MeOH : H3PO4 pH 3,0 (5:95) - Pha tĩnh: cột Phenomenex Luna (250mm; 4,6mm; 5µm; 100Å) - Thể tích tiêm mẫu: 20µl - Tốc độ dịng: 1,0ml/phút 41 - Nhiệt độ cột: 25oC - Đầu dị: UV-Vis - Bước sóng phát hiện: 248nm So sánh với quy trình nghiên cứu trước [18], [24], [34], [36], quy trình xử lý pha động đơn giản phù hợp khơng sử dụng dung dịch muối làm dung mơi pha động, tránh tình trạng đóng muối cột hệ thống máy 4.2 Tính tương thích hệ thống Qua bảng kết tương thích hệ thống mẫu chuẩn, mẫu thử Bocalex Plusssz cho thấy thông số thời gian lưu diện tích đỉnh có RSD% lần sắc ký lien tiếp nhỏ 2%, chứng tỏ quy trình hệ thống máy HPLC Dionex Ultimate 3000 có độ lặp lại cao, áp dụng quy trình để phân tích nồng độ vitamin C sản phẩm chọn 4.3 Thẩm định quy trình định lượng [4], [14] 4.3.1 Tính đặc hiệu Pic vitamin C hai mẫu thử có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic vitamin C mẫu chuẩn Pic vitamin C mẫu thử thêm chuẩn có tăng lên chiều cao diện tích đỉnh Mẫu trắng pha động khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mẫu chuẩn Từ kết trên, kết luận quy trình có tính đặc hiệu cho vitamin C 4.3.2 Tính tuyến tính Kết khảo sát xử lý phần mềm Microsoft Excel 2013 Qua trắc nghiệm t (phân phối Student, mức ý nghĩa α = 0,05) đánh giá ý nghĩa thống kê hệ số B0 (hệ số b) B (hệ số a) Trắc nghiệm F (phân phối Fisher) đánh giá tính thích hợp phương trình hồi quy, cho thấy có tương quan tuyến tính diện tích đỉnh nồng độ hoạt chất hay không Giả thuyết cho trắc nghiệm t: - H0: hệ số khơng có ý nghĩa thống kê 42 - HA: hệ số có ý nghĩa thống kê Giả thuyết cho trắc nghiệm F: - H0: phương trình hồi quy khơng tương thích - HA: phương trình hồi quy tương thích Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2013 để phân tích cho bảng 3.4, ta thu bảng 4.4 Bảng 4.4 Các thơng số kiểm định phương trình hồi quy Vitamin C Thông số so sánh Hệ số tương quan 0,9999 t(0,05;3) = 3,18 Giá trị F 26827,64 F(0,05;1;3) = 10,13 Giá trị t B0 0,68 Giá trị t B 163,79 F = 26827,64 > F(0,05;1;3) = 10,13, nên chấp nhận giả thuyết HA Phương trình hồi quy tương thích t B0 = 0,68 < t(0,05;3) = 3,18, nên chấp nhận giả thuyết H0 Hệ số B0 khơng có ý nghĩa t B = 48,47 > t(0,05;3) = 3,18, nên chấp nhận giả thuyết HA Hệ số B có ý nghĩa  Do đó, phương trình hồi quy là: Y = 1,0617x 4.3.3 Độ xác Độ xác thực mẫu thử, dùng phép kiểm định T để loại sai số thô Với độ tin cậy P = 95% n = 6, Tlt = 1,996 - Với mẫu thử Bocalex: + Giá trị hàm lượng vitamin C lớn xmax = 55,38 Ttn = 0,457 < Tlt = 1,996 Nên chấp nhận giá trị xmax + Giá trị hàm lượng vitamin C nhỏ xmin = 54,67 43 Ttn = 1,571 < Tlt = 1,996 Nên chấp nhận giá trị xmin Do đó, khơng có sai số thơ dãy số liệu độ xác mẫu thử Bocalex - Với mẫu thử Plusssz: + Giá trị hàm lượng vitamin C lớn xmax = 65,19 Ttn = 0,682 < Tlt = 1,996 Nên chấp nhận giá trị xmax + Giá trị hàm lượng vitamin C nhỏ xmin = 63,18 Ttn = 1,682 < Tlt = 1,996 Nên chấp nhận giá trị xmin Do đó, khơng có sai số thơ dãy số liệu độ xác mẫu thử Plusssz Nồng độ vitamin C RSD% hàm lượng vitamin C có mẫu thử Bocalex khoảng 30 ppm 0,64%, với Plusssz khoảng 30 ppm 1,32% Theo Sổ tay Hướng dẫn đăng ký thuốc, giá trị RSD (%) kết định lượng hàm lượng hoạt chất có mẫu phải ≤ 2,0% Do đó, RSD% hàm lượng hoạt chất mẫu thử đáp ứng yêu cầu độ xác Sổ tay Hướng dẫn đăng ký thuốc 4.3.4 Độ Theo Sổ tay Hướng dẫn đăng ký thuốc, độ phương pháp phải nằm khoảng 98,0% đến 102,0% giá trị RSD ≤ 2,0% Với mẫu thử Bocalex, độ hồi phục thấp 98,62%, cao 101,52%, trung bình mẫu thử 100,35% Với mẫu thử Plusssz, độ hồi phục thấp 98,66%, cao 101,48%, trung bình mẫu thử 100,47% Độ hồi phục nồng độ độ hồi phục trung bình mẫu thử nằm giới hạn yêu cầu theo Sổ tay Hướng dẫn đăng ký thuốc Hệ thống máy HPLC Dionex Ultimate 3000 cho thấy hiệu tốt với độ lặp lại cao Với hệ pha động MeOH: H3PO4 pH 3,0 (5:95), pic vitamin C xuất phút thứ 4,02 với hệ số bất đối khoảng 0,95-1,02, tách khỏi pic tá dược pic vitamin khác với hệ số phân giải đạt yêu cầu 44 Sự có mặt thành phần khác công thức viên sủi vitamin khác (B1, B6, B12, v.v ) số tá dược không làm ảnh hưởng đến pic vitamin C Do phương pháp có tính chọn lọc vitamin C Miền giá trị phương pháp 15-120ppm với đường tuyến tính có hệ số R2=0,9999 Độ xác phương pháp chứng minh qua giá trị RSD% nồng độ vitamin C có mẫu thử (0,64% mẫu thử Bocalex 1,32% mẫu thử Plusssz) Độ phục hồi vitamin C khoảng 98,62-101,52% chứng minh độ phương pháp Nhìn chung, kết cho thấy quy trình xây dựng thích hợp để định lượng vitamin C ứng dụng quy trình để định lượng vitamin C sản phẩm viên sủi đa thành phần 4.4 Áp dụng quy trình định lượng Các lơ Bocalex Plusssz định lượng có thành phần nhãn giống với lơ thẩm định Do đó, áp dụng quy trình định lượng cho lơ sản phẩm Hàm lượng vitamin C trung bình lơ sản phẩm Bocalex 56,66mg, 56,02mg 56,61mg Hàm lượng đạt theo Tiêu chuẩn sở: ± 20% so với hàm lượng nhãn (48mg – 72mg vitamin C) Hàm lượng vitamin C trung bình lơ sản phẩm Plusssz 65,70mg, 63,5mg 64,54mg, gần với hàm lượng ghi nhãn 60mg vitamin C Theo khuyến cáo Thông tư Quy định quản lý thực phẩm chức (43/2014/TT-BYT), hàm lượng vitamin có thực phẩm theo liều khuyên dùng ngày nhà sản xuất phải đạt tối tiểu 15% RNI hàm lượng tối đa vitamin có thực phẩm theo liều khuyên dùng ngày nhà sản xuất không vượt mức tối đa cho phép vitamin có thực phẩm chức Liều vitamin C khuyên dùng ngày từ 25-55mg/ngày tùy theo nhóm tuổi mức tối đa cho phép vitamin C thực phẩm chức quy định thông tư 1000mg/ngày [3] 45 Liều khuyên dùng ngày từ nhà sản xuất sản phẩm Bocalex Plusssz 1-2viên/ngày, tương đương 60-120mg vitamin C/ngày Do đó, liều ghi nhãn sản phẩm phù hợp theo Quy định Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nhu cầu vitamin C theo nhóm tuổi trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Nhu cầu vitamin C ngày theo WHO Nhóm tuổi Nhu cầu vitamin C (mg/ngày) Trẻ em 0-9 tuổi 25-35 10-18 tuổi 40 19-65 tuổi 45 Trên 65 tuổi 45 Phụ nữ có thai 55 Tuy nhiên số người, dùng vitamin C 2-3g/ngày dẫn đến tiêu chảy Bên cạnh đó, oxalat (sản phẩm dị hóa cuối vitamin C) yếu tố quan trọng góp phần hình thành sỏi thận, đặc biệt liều dùng 1000mg/ngày [37] Liều vitamin C ngày khuyên dùng từ nhà sản xuất phù hợp theo quy định WHO 46 KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, hoàn thành số mục tiêu đề luận văn, bao gồm: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng vitamin C sản phẩm viên sủi đa thành phần phổ biến lưu hành thị trường phương pháp HPLC với hệ pha động isocratic MeOH : H3PO4 pH 3,0 (5:95) pha tĩnh cột Phenomenex Lunar C18 (250mm; 4,6 mm; µm; 100Å) Thời gian cho lần tiêm mẫu 10 phút pic vitamin C xuất khoảng phút thứ 4, tách khỏi pic tạp Áp dụng định lượng thành công hàm lượng vitamin C lô khác sản phẩm Các lô sản phẩm Bocalex có hàm lượng vitamin C đạt so với Tiêu chuẩn sở hàm lượng vitamin C lô sản phẩm Plusssz gần với hàm lượng ghi nhãn 47 KIẾN NGHỊ Áp dụng định lượng lô sản phẩm khác lưu hành thị trường Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng dành cho thực phẩm chức sản xuất nước nhập để đảm bảo hàm lượng tác dụng hoạt chất 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Bộ Y Tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam, lần xuất thứ hai tập I, Nhà xuất Khoa học Kỹ Thuật Bộ Y Tế (2014), Thông tư Quy định quản lý thực phẩm chức Cục Quản lý Dược (2013), Sổ tay Hướng dẫn đăng ký thuốc Liên Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm – Độc chất (2014), Giáo trình lý thuyết Kiểm nghiệm Dược Phẩm, Khoa Dược – Đại học Y Dược Cần Thơ, tr.87 – 130 Liên Bộ mơn Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm – Độc chất (2012), Giáo trình lý thuyết Hóa phân tích 2, Khoa Dược – Đại học Y Dược Cần Thơ, trang 160 – 187 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Council of Europe (2010), European Pharmacopoeia Seventh edition Supplement 7.1 Juan Du, Joseph J Cullen, Garry R Buettner (2012), “Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer”, Biochimica et Biophysica Acta, 1826 443–457 Juan Du , Sean M Martin , Mark Levine , Brett A Wagner , Garry R Buettner, Sih-han Wang, Agshin F Taghiyev , Changbin Du , Charles M Knudson, and Joseph J Cullen (2010), Mechanisms of Ascorbate-Induced Cytotoxicity in Pancreatic Cancer, Clinical Cancer Research 10 Michael Graham Espeya, Ping Chenb , Brian Chalmersb, Jeanne Driskob, Andrew Y Suna, Mark Levinea, and Qi Chen (2011), “Pharmacologic ascorbate synergizes with gemcitabine in preclinical models of pancreatic cancer”, Free Radical Biology and Medicine Journal, Vol 50, 1610-1619 49 11 John N Hathcock PhD (2004), Vitamin and mineral safty 2nd edition, Council For Responsible Nutrition 12 Ashley N Hiatt, Mario G Ferruzzi, Lynne S Taylor, and Lisa J Mauer (2011), “Deliquescence behavior and chemical stability of vitamin C forms (ascorbic acid, sodium ascorbat, and calcium ascorbat) and blends”, International Journal of Food Properties, 14:1330–1348 13 Ashley N Hiatt, Lynne S Taylor, Lisa J Mauer (2010), “Influence of Simultaneous Variations in Temperature and Relative Humidity on Chemical Stability of Two Vitamin C Forms and Implications for Shelf Life Models”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Volume 58, issue 14 ICH (2005), Q2(R1) Validation of analytical procedures: Text and Methodology 15 Hallberg L, Brune M, Rossander L (1986), ”Effect of ascorbic acid on iron absorbtion on different types of meals”, Human Nutrition: Applied Nutrition, 40A: 97-113 16 Mark Levine, Steven C Rumsey, Rushad Daruwala, Jae B Park, Yaohui Wang (1999), Criteria and recommendations for vitamin C intake, American Medical Association 17 S Maggini, S Wenzlaff and D Hornig (2010), “Essential Role of Vitamin C and Zinc in Child Immunity and Health”, The Journal of International Medical Research, 38: 386 – 414 18 Snezana S Mitić, Danijela A Kostić, Danijela C Nasković-Đokić, Milan N Mitic (2011), “Rapid and Reliable HPLC Method for the Determination of Vitamin C in Pharmaceutical Samples”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research,10 (1): 105-111 19 K Akhilender Naidu (2003), "Vitamin C in human health and disease is still a mystery ? An overview", Journal Nutrition, 2, (7) 50 20 L Nova´kova´, P Solich, D Solichova (2008), ”HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids”, Trends in Analytical Chemistry, Vol 27, No 10 21 Oyetade, O.A., Oyeleke, G.O., Adegoke, B.M and Akintunde, A.O (2012), “Stability Studies on Ascorbic Acid (Vitamin C) From Different Sources”, IOSR Journal of Applied Chemistry (IOSR-JAC), ISSN: 2278-5736 Volume 2, Issue (Sep-Oct 2012), PP 20-24 22 Pavlos Papoulidis , Olga Ananiadou, Eleftherios Chalvatzoulis , Fotini Ampatzidou , Charilaos Koutsogiannidis , Theodoros Karaiskos , Athanasios Madesis , George Drossos (2010), The role of ascorbic acid in the prevention of atrial fibrillation after elective on-pump myocardial revascularization surgery: a single-center experience – a pilot study 23 Ranu Paul, Uma Ghosh (2012), “Effect of thermo treatment on acid ascorbic content of pomegranate juice”, Indian Journal of Biotechnology, Vol 11, pp 309-313 24 Valeria Radulescu, Diana-Carolina Ilies, Ion Voiculescu(2013), “Determination of acid ascorbic in shoots from different coniferous species by HPLC”, Farmacia, Vol 61, 6, 1158-1166 25 Brittney J Randolph, Hardikkumar M Patel & Matthew D Muller (2015), “Ascorbic acid attenuates the pressor response to voluntary apnea in postmenopausal women”, Physiologycal reports, Vol 26 Matthias W Rath Linus C Pauling (1994), Prevention and treatment of occlusive cardiovascular disease with ascorbate and substances that inhibit the binding of lipoprotein (a), United States Patent 27 C Rekha, G Poornima, M Manasa, V Abhipsa, J Pavithra Devi, H T Vijay KumaRand, T R Prashith Kekuda (2012), “Ascorbic Acid, Total Phenol Content and Antioxidant Activity of Fresh Juices of Four Ripe and Unripe Citrus Fruits”, Chemical Science Transactions, 1(2), 303-310 51 28 Southern California−RAND Evidence-based Practice Center (2003), “Effect of Supplemental Antioxidants Vitamin C, Vitamin E, and Coenzyme Q10 for the Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease”, Evidence Report/Technology Assessment, 83 29 Vítor Spínola, Berta Mendes, José S Câmara, Paula C Castilho (2012), “Effect of time and temperature on vitamin C stability in horticultural extracts UHPLC-PDA vs iodometric titration as analytical methods”, LWT - Food Science and Technology, ELSERVIER 30 Andrea Stesková– Monika Morochovicová - Emília Lesková (2006), “Vitamin C degradation during storage of fortified foods”, Journal of Food and Nutrition Research, Vol 45, 2006, No 2, pp 55-61 31 The British Pharmacopoeia (2013), CD-Rom 32 The United States Pharmacopoeia 35 (2012), CD-Rom 33 James E Tingstad, Lee H Macdonald, and Peter D Meister (1963), “Stability of Ascorbic Acid in a Liquid Multivitamin Emulsion Containing Sodium Fluoride”, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 52, No 34 Shafqat ullah, Arshad Hussain, Javid Ali, Khaliqurrehman and Asad ullah (2012), “A Simple and Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin-C in Local Packed Juices of Pakistan”, Middle-East Journal of Scientific Research, 12 (8): 1085-1091 35 M C Uprety, B Revis, S M Japar (1963), “Ascorbic Acid Stability in Certain Aqueous and Fruit Juice Vehicles Subjected to Elevated Temperature”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 1002 36 Alley E Watada (1982), “A High-performance Liquid Chromatography Method for Determining Ascorbic Acid Content of Fresh Fruits and Vegetables”, HortScience, Vol 17(3): 334-335 37 World Health Organization (2004), Vitamin and Mineral Requirements in Human Nutrition, Second Edition, Geneva: World Health Organization