Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng và khảo sát độ ổn định của viên nang mềm chứa tinh dầu chúc (citrus hystrix) dùng để xông

Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của sabinen trong mẫu thử dịch nhân viên xông có chứa tinh dầu Chúc.. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của β-pinen trong mẫu thử dịch

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Tinh dầu Chúc (Citrus hystrix) được chưng cất tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học

Y Dược Cần Thơ từ nguyên liệu vỏ quả Chúc (được thu hái tại Tịnh Biên-

An Giang vào tháng 9/2017) Các hóa chất và dung môi khác sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Tinh dầu Gừng Việt Nam TCCS

4 Dầu Lạc Việt Nam TCCS

8 Màu pea green Ấn Độ TCCS

11 Na2SO4 khan Trung Quốc TCCS

12 Ethyl acetat Trung Quốc Tinh khiết

14 Chuẩn citronellal Sigma-Aldrich Phân tích

15 Chuẩn limonen Dr Ehrenstorfer Phân tích

16 Chuẩn sabinen ChromaDex Phân tích

17 Chuẩn β-pinen Dr Ehrenstorfer Phân tích

18 Chuẩn nội camphor Sigma-Aldrich Phân tích Đối tượng nghiên cứu là viên nang mềm chứa tinh dầu Chúc có công thức sau:

Tinh dầu Chúc 50mg Tinh dầu Gừng 4mg

Dầu lạc dược dụng, gelatin, glycerin, nipagin, nipasol, chất màu pea green vừa đủ 1 viên

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Phòng nghiên cứu Liên bộ môn Bào chế-Công nghiệp dược-Quản lí dược

Phòng nghiên cứu Liên bộ môn Dược liệu-Dược cổ truyền-Thực vật dược.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thẩm định quy trình định lượng β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong viên xông có chứa tinh dầu vỏ quả Chúc bằng phương pháp GC-FID

2.2.1.1 Cách pha mẫu và điều kiện sắc ký

Chuẩn bị mẫu chuẩn nội: cân chính xác 10mg camphor, cho vào bình định mức 100ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (N)

STT Tên thiết bị Số hiệu Nguồn gốc

1 Máy đóng nang mềm tự động Cube R 150 Hàn Quốc

2 Máy sắc ký khí GC-FID Agilent Mỹ

3 Cân phân tích Ep 214C-Ohaus Mỹ

4 Tủ vi khí hậu Global 5000

Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác 1g dịch nhân, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (T1) Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (T2)

Chuẩn bị mẫu chuẩn: ̵ Chuẩn β-pinen: Cân chính xác 10mg β-pinen cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (β1) Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (β2) ̵ Chuẩn sabinen: Cân chính xác 10mg sabinen cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (S1) Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (S2) ̵ Chuẩn limonen: Cân chính xác 10mg limonen cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (L1) Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (L2) ̵ Chuẩn citronellal: Cân chính xác 10mg citronellal cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (C1) Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (C2) Điều kiện sắc ký ̵ Nhiệt độ tiêm mẫu: 250 o C ̵ Tỷ lệ chia dòng: 1/10 ̵ Cột phõn tớch DB–5MS (30m x 250àm x 0,25àm) ̵ Đầu dò ion hóa ngọn lửa ̵ Nhiệt độ detector: 280 o C ̵ Thể tớch tiờm mẫu: 2àl

Quy trình định lượng β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong dịch nhân của viên xông có chứa tinh dầu Chúc

+ Chuẩn bị dung dịch thử theo mục 2.2.1.1 Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xác định ở mục 2.2.1.1

+ Hỗn hợp chuẩn (H): hỳt chớnh xỏc 2300àl dung dịch (β2), 1500àl dung dịch (S2), 900àl dung dịch (L2), 2200àl dung dịch (C2), 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó xỏc định ở mục 2.2.1.1

+ Xác định diện tích đỉnh β-pinen, sabinen, limonen, citronellal, camphor trong dung dịch chuẩn, thử, tính toán hàm lượng các chất trong viên xông có chứa tinh dầu chúc

X(%): phần trăm β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Schuẩn, Sthử: lần lượt là diện tích đỉnh của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu chuẩn, và diện tích đỉnh của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu thử

SCN/C, SCN/T: lần lượt là diện tích chuẩn nội trong mẫu chuẩn, và diện tích chuẩn nội trong mẫu thử Đề tài thẩm định quy trình định lượng sabinen, β-pinen, limonen, citronellal theo hướng dẫn của AOAC

2.2.1.2 Xác định tính tương thích hệ thống

Cách tiến hành: ̵ Mẫu thử chuẩn bị theo mục 2.2.1.1 ̵ Mẫu hỗn hợp chuẩn: hỳt chớnh xỏc 500àl dung dịch (β2), 500àl dung dịch (S2), 500àl dung dịch (L2), 500àl dung dịch (C2), 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat

Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp cho các mẫu thử và mẫu hỗn hợp chuẩn theo điều kiện sắc ký tối ưu đã được xác định ở mục 2.2.1.1

Tính tương thích hệ thống được khảo sát với các thông số sắc ký đặc trưng: thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), số đĩa lý thuyết (N), hệ số dung lượng (k’), độ phân giải (Rs) và hệ số bất đối (As)

Yêu cầu: ̵ Rs> 1,5 ̵ As = 0,8-1,5 ̵ RSD 6 lần liên tiếp tiến hành không quá 2%

Cách tiến hành: thực hiện trên các mẫu: ̵ Mẫu không khí ̵ Mẫu dung mụi: dung mụi ethyl acetat được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập ̵ Mẫu hỗn hợp chuẩn: hỳt chớnh xỏc 500àl dung dịch (β2), 500àl dung dịch (S2), 500àl dung dịch (L2), 500àl dung dịch (C2) cho vào bỡnh định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập ̵ Mẫu chuẩn thờm chuẩn nội: hỳt chớnh xỏc 500àl dung dịch (β2), 500àl dung dịch (S2), 500àl dung dịch (L2), 500àl dung dịch (C2), 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập ̵ Mẫu thử: Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch (T1), cho vào bỡnh định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập ̵ Mẫu thử thờm chuẩn nội: Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch (T1), 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập ̵ Mẫu chuẩn nội: Hút chính xác 1ml dung dịch (N), cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập ̵ Mẫu phacebo không chứa tinh dầu Chúc: cân chính xác 1g dịch nhân không chứa tinh dầu Chúc, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập ̵ Mẫu dầu Lạc: cân chính xác 1g dầu Lạc, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập ̵ Chuẩn bị các mẫu phân hủy:

+ Mẫu được chiếu sáng liên tục trong 8 giờ và mẫu phân hủy ở 60 0 C trong

8 giờ, chuẩn bị như mục 2.2.1.1

+ Mẫu được phân hủy bởi NaOH 1N trong 8 giờ, mẫu phân hủy bởi H2O2

30% trong 6 giờ và mẫu phân hủy bởi H3PO4 đặc trong 8 giờ: cân 2g dịch nhân cho vào bình định mức 100mL, điền đủ bằng dung dịch NaOH 1N,

H2O2 30% hoặc H3PO4 đặc, siêu âm trong 10 phút Để yên tránh ánh sáng, thỉnh thoảng lắc trong thời gian như trên Gạn lấy lớp trên Cân chính xác 1g dịch thu được, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat.lọc qua màng lọc 0,45àm thu được dung dịch phõn hủy bởi tỏc nhõn kiềm, oxi húa và acid ̵ Tiến hành sắc ký với điều kiện đã xác định ở mục 2.2.1.1 ̵ Yêu cầu: thời gian lưu của pic β-pinen, sabinen, limonen, citronellal ở dung dịch mẫu chuẩn và các mẫu phân hủy phải tương đương nhau Các pic tạp phân hủy phải tách hoàn toàn với pic của các hoạt chất Đánh giá kết quả: ̵ Sắc ký đồ của mẫu thử phải có các pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của các pic có trong chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử và mẫu phân hủy nếu xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp) không phải pic của hoạt chất cần phân tích, thì pic của hoạt chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được quy định trong Dược điển ̵ Sắc ký đồ dung môi và khí mang, mẫu chuẩn nội không có các pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu các pic trong mẫu chuẩn ̵ Sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn: phải có sự tăng lên về chiều cao và diện tích của các pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của các pic trong mẫu chuẩn ̵ Sắc ký đồ mẫu chuẩn nội không trùng thời gian lưu với các pic định lượng, pic chuẩn nội tách hoàn toàn khỏi các pic khác trong các mẫu, và không gây nhiễu cho bất kỳ thành phần nào trong các mẫu thêm chuẩn nội

Tính tuyến tính và khoảng tuyến tính

Tiến hành pha loãng dung dịch (β2), (S2), (L2), (C2) thành 5 mẫu có nồng độ xác định khác nhau của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal

Tiến hành sắc ký các dãy mẫu của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal theo điều kiện sắc ký đã xác định ở mục mẫu mục 2.2.1.1

Vẽ đường biểu diễn tương quan diện tích đỉnh theo nồng độ chất phân tích Đánh giá kết quả: ̵ Xác định hệ số a (độ dốc), b (tung độ gốc), R 2 (bình phương của hệ số tương quan) của phương trình hồi quy y= ax + b Tính tuyến tính thường được chấp nhận khi 0,995 ≤R 2 ≤ 1,000 ̵ Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy bằng trắc nghiệm F và ý nghĩa của hệ số trong phương trình hồi quy bằng trắc nghiệm T Độ đúng

Xác định hàm lượng β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu thử bằng phương pháp đã khảo sát

Chuẩn bị mẫu thử theo mục 2.2.1.1 Tính hàm lượng trung bình

Chuẩn bị mẫu thử thêm chuẩn: lần lượt thêm vào 7 mẫu thử lượng chuẩn với mức 80%, 100%, 120% so với hàm lượng trung bình β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu thử

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập để tìm tỷ lệ hồi phục Đánh giá kết quả:

Dựa vào diện tích đỉnh để xác định hàm lượng mẫu thử, mẫu thử đã thêm chuẩn Từ đó tính ra tỷ lệ hồi phục của phương pháp định lượng theo công thức:

Y là tỷ lệ phục hồi

Xr là lượng chuẩn tìm thấy thực tế

Xa là lượng chuẩn cho vào trên lý thuyết

Tỷ lệ phục hồi phải đạt 80 – 110% [16] [3] Độ lặp lại

Chuẩn bị 7 mẫu thử như mục 2.2.1.1

Tiến hành sắc ký các mẫu theo điều kiện sắc ký đã xác định ở mục 2.2.1.1 Đánh giá kết quả: ̵ Xác định hàm lượng sabinen, β-pinen, limonen, citronellal trong mỗi mẫu thử ̵ Tính RSD, Xtb với yêu cầu RSD ≤ 1,3% [17]

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc

SD: độ lệch chuẩn của mẫu trắng hay độ lệch chuẩn của đường hồi quy a: độ dốc của đường cong hiệu chuẩn (đường tuyến tính) của phương pháp phân tích

Giới hạn định lượng (LOQ): dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc

SD: độ lệch chuẩn của đáp ứng mẫu trắng hay độ lệch chuẩn của đường hồi quy a: độ dốc của đường cong hiệu chuẩn (đường tuyến tính) của phương pháp phân tích

2.2.2 Khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc

2.2.2.2 Kế hoạch theo dõi độ ổn định Độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc được thực hiện trên 3 lô sản xuất ở quy mô 1000 viên, tiến hành thử ở cả hai điều kiện: ̵ Điều kiện dài hạn: nhiệt độ 30 o C + 2 o C, độ ẩm tương đối 75% + 5% (tiến hành trong 12 tháng) Thời điểm lấy mẫu: 1,2,3,4,5,6,9,12 tháng ̵ Điều kiện cấp tốc: nhiệt độ 40 o C + 2 o C, độ ẩm tương đối 75% + 5% (tiến hành trong 6 tháng) Thời điểm lấy mẫu: 1,2,3,4,5,6 tháng

2.2.2.3 Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm: ̵ Hình thức: viên nang mềm hình bầu dục, size 7, màu xanh lá nhạt, không méo mó, không rỉ dịch, dung dịch chứa trong nang có mùi thơm của tinh dầu, không có vật lạ nhìn thấy bằng mắt thường ̵ Thời gian giải phóng tinh dầu: cho một viên nang mềm vào một cốc chứa 200mL nước nhiệt độ khoảng 80-85 o C, ghi nhận thời gian từ khi cho viên nang mềm vào cốc nước đến khi vỏ gelatin tan ra để giải phóng khối dịch nhân chứa bên trong hay thời điểm bắt đầu ngửi thấy mùi thơm tinh dầu Lặp lại với 5 viên khác trong cùng điều kiện ̵ Thời gian bền mùi: Cho một viên nang mềm vào một cốc chứa 200mL nước nhiệt độ khoảng 80-85 o C, ghi nhận thời gian từ khi bắt đầu có mùi thơm đến khi hết mùi thơm Lặp lại với 5 viên khác trong cùng điều kiện ̵ Định lượng: Hàm lượng sabinen, β-pinen, limonen, citronellal phải đạt từ 90,0%-110% so với hàm lượng ghi trên nhãn Đối với điều kiện cấp tốc chỉ tiến hành trên chỉ tiêu định lượng

2.2.3 Xác định tuổi thọ của viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Phương pháp thử nghiệm ở điều kiện dài hạn Đề tài này áp dụng phương pháp tính tuổi thọ của thuốc dựa theo hằng số tốc độ phản ứng k

KẾT QUẢ

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SABINEN, β-PINEN, LIMONEN, CITRONELLAL TRONG VIÊN XÔNG CÓ CHỨA TINH DẦU VỎ QUẢ CHÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-FID

VỎ QUẢ CHÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-FID

3.1.1 Tính tương thích hệ thống

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn sabinen

Lần tiêm tR Ssabinen/Scamphor As k’ N Rs

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn β-pinen

Lần tiêm tR Sβ-pinen/Scamphor As k’ N Rs

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn limonen

Lần tiêm tR Slimonen/Scamphor As k’ N Rs

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn citronellal

Lần tiêm tR Scitronellal/Scamphor As k’ N Rs

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của sabinen trong mẫu thử dịch nhân viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Lần tiêm tR Ssabinen/Scamphor As k’ N Rs

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của β-pinen trong mẫu thử dịch nhân viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Lần tiêm tR Sβ-pinen/Scamphor As k’ N Rs

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của limonen trong mẫu thử dịch nhân viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Lần tiêm tR Slimonen/Scamphor As k’ N Rs

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của citronellal trong mẫu thử dịch nhân viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Lần tiêm tR Scitronellal/Scamphor As k’ N Rs

Các giá trị Xtb, SD, RSD của các thông số sắc ký tR, S, As, k’,N, Rs, cho thấy mẫu chuẩn có RSD < 2% sau 6 lần tiêm mẫu liên tiếp, chứng tỏ quy trình đạt tính tương thích hệ thống, điều kiện sắc ký đã trình bày thích hợp để tiến hành thẩm định

Hình 3.1 Chồng sắc ký đồ độ đặc hiệu

(1-Mẫu không khí, 2-Mẫu dung môi, 3-Mẫu hỗn hợp chuẩn, 4-Mẫu chuẩn nội, 5-Mẫu hỗn hợp chuẩn thêm chuẩn nội, 6-Mẫu thử, 7-Mẫu thử thêm chuẩn, 8-Mẫu thử thêm chuẩn nội, 9-Mẫu Placebo không chứa tinh dầu Chúc, 10-Mẫu dầu Lạc)

Kết quả thử tạp chất phân huỷ: Kết quả overlay sắc ký đồ cho thấy pic tạp phân hủy tách hoàn toàn khỏi pic của sabinen, β-pinen, limonen, citronellal

Hình 3.2 Overlay sắc ký đồ tạo tạp phân hủy

3.1.3 Tính tuyến tính và miền giá trị

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ của sabinen

Khoảng tuyến tớnh (àg/ml)

LOD (àg/ml) LOQ (àg/ml)

Bảng 3.10 Khoảng nồng độ tuyến tính của sabinen

Diện tích đỉnh sabinen (pA)

Diện tích đỉnh chuẩn nội (pA)

Tỷ số Diện tích đỉnh (sabinen/chuẩn nội)

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ của β-pinen

Bảng 3.12 Khoảng nồng độ tuyến tính của β-pinen STT Nồng độ β-pinen

Diện tích đỉnh β-pinen (pA)

Tỷ số Diện tích đỉnh (β-pinen /chuẩn nội)

Bảng 3.13 Khảo sát tính tuyến tính LOD, LOQ của limonen

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của limonen STT Nồng độ limonen

Diện tích đỉnh limonen (pA)

Tỷ số Diện tích đỉnh (limonen/chuẩn nội)

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ của Citronellal

Bảng 3.16 Khoảng nồng độ tuyến tính của citronellal STT Nồng độ limonen

Diện tích đỉnh limonen (pA)

Tỷ số Diện tích đỉnh (limonen/chuẩn nội)

Nhận xét: Miền giá trị được xây dựng trong khoảng rộng, phương trình hồi quy có

0,995≤ R 2 ≤ 1,000 Ý nghĩa các hệ số trong phương trình đều phù hợp, có thể áp dụng phương trình hồi quy này cho việc định lượng

Hàm lượng sabinen trung bỡnh trong mẫu thử là: 12,438àg/ml (RSD = 0,361%) Tham khảo phụ lục 5

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ đúng sabinen trong viên xông tinh dầu Chúc

Lượng chuẩn sabinen thêm vào (àg/ml)

Lượng chuẩn sabinen tìm lại (àg/ml)

Hàm lượng β-pinen trung bỡnh trong mẫu thử là: 21,809àg/ml (RSD = 0,392%) Tham khảo phụ lục 5

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ đúng β-pinen trong viên xông tinh dầu Chúc

Lượng chuẩn β-pinen thêm vào (àg/ml)

Lượng chuẩn β-pinen tìm lại (àg/ml)

Hàm lượng limonen trung bỡnh trong mẫu thử là: 9,380àg/ml (RSD = 0,462%) Tham khảo phụ lục 5

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ đúng limonen trong viên xông tinh dầu Chúc

Lượng chuẩn limonen thêm vào (àg/ml)

Lượng chuẩn limonen tìm lại (àg/ml)

Hàm lượng citronellal trung bỡnh trong mẫu thử là: 27,100àg/ml (RSD = 0,321%) Tham khảo phụ lục 5

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ đúng citronellal trong viên xông tinh dầu Chúc

Lượng chuẩn citronellal thêm vào (àg/ml)

Lượng chuẩn citronellal tìm lại (àg/ml)

Nhận xét: tỷ lệ phục hồi ở mỗi nồng độ riêng biệt 80%, 100%, 120% và tỷ lệ phục hồi trung bình đều nằm trong giới hạn 80,0%110,0% theo AOAC (2016) Kết luận, quy trình đạt độ đúng

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày 1 (n=7) của sabinen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng sabinen trong mẫu (%) Kết quả xử lý thống kê

Nhận xét: RSD ≤ 2%, đạt giới hạn theo hướng dẫn của AOAC (2016) Kết luận, quy trình đạt độ lặp lại

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày 1 (n=7) của β-pinen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng β-pinen trong mẫu (%) Kết quả xử lý thống kê

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày 1 (n=7) của limonen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng limonen trong mẫu (%) Kết quả xử lý thống kê

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày 1 (n=7) của citronellal trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng citronellal trong mẫu (%) Kết quả xử lý thống kê

7 1,098 Độ chính xác liên ngày

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát độ chính xác liên ngày 2, ngày 3 (n=7) của sabinen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng sabinen trong mẫu ngày 2 (%)

Hàm lượng sabinen trong mẫu ngày 3 (%)

Kết quả xử lý thống kê

Vậy hàm lượng sabinen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc qua 3 ngày khảo sát liên tiếp có giá trị Xtb = 0,504%, vào RSD qua ba ngày là 0,802% Độ sai khác kết quả định lượng liên ngày khác nhau không có ý nghĩa Kết luận, quy trình đạt độ chính xác liên ngày

Tương tự, hàm lượng β-pinen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc qua 3 ngày khảo sát liên tiếp có giá trị Xtb = 0,893%, vào RSD qua ba ngày là 0,953% Độ sai khác kết quả định lượng liên ngày khác nhau không có ý nghĩa Như vậy, quy trình đạt độ chính xác liên ngày

Bảng 3.26 Kết quả khảo sát độ chính xác liên ngày 2, ngày 3 (n=7) của β-pinen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng β-pinen trong mẫu ngày 2 (%)

Hàm lượng β-pinen trong mẫu ngày 3 (%)

Bảng 3.27 Kết quả khảo sát độ chính xác liên ngày 2, ngày 3 (n=7) của limonen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng limonen trong mẫu ngày 2 (%)

Hàm lượng limonen trong mẫu ngày 3 (%)

Vậy hàm lượng limonen trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc qua 3 ngày khảo sát liên tiếp có giá trị Xtb = 0,378%, vào RSD qua ba ngày là 0,305% Độ sai khác kết quả định lượng liên ngày khác nhau không có ý nghĩa Kết luận, quy trình đạt độ chính xác liên ngày

Bảng 3.28 Kết quả khảo sát độ chính xác liên ngày 2, ngày 3 (n=7) của citronellal trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc

Mẫu Hàm lượng citronellal trong mẫu ngày 2 (%)

Hàm lượng citronellal trong mẫu ngày 3 (%)

Vậy hàm lượng citronellal trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc qua 3 ngày khảo sát liên tiếp có giá trị Xtb = 1,086%, vào RSD qua ba ngày là 0,555% Độ sai khác kết quả định lượng liên ngày khác nhau không có ý nghĩa Kết luận, quy trình đạt độ chính xác liên ngày.

KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN XÔNG CÓ CHỨA TINH DẦU CHÚC

Bảng 3.29 Kết quả kiểm nghiệm viên xông có chứa tinh dầu Chúc từ 3 lô trước khi đưa vào nghiên cứu độ ổn định

Thời gian giải phóng tinh dầu

Thời gian bền mùi Định lượng

(25 phút) Đạt sabinen (100,01%) β-pinen (100,03%) limonen(100,00%) citronellal (100,01%)

(25 phút) Đạt sabinen (100,92%) β-pinen (101,02%) limonen (100,43%) citronellal (100,53%)

Nhận xét: Các lô thuốc trước khi đưa vào nghiên cứu độ ổn định đều đạt các yêu cầu kiểm nghiệm Kết luận, được phép đưa các lô thuốc đã bào chế vào nghiên cứu độ ổn định viên xông có chứa tinh dầu Chúc

3.2.1 Kết quả khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc ở điều kiện dài hạn Đề tài khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc ở điều kiện dài hạn được 5 tháng, kết quả như sau:

Bảng 3.30 Kết quả khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc ở điều kiện dài hạn (lô 1)

Nhận xét: Kết quả kiểm nghiệm lô 1 tại các thời điểm khảo sát đều đạt các mức chỉ tiêu yêu cầu

3.2.2 Kết quả khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc ở điều kiện cấp tốc Đề tài khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc ở điều kiện cấp tốc được 5 tháng, kết quả như sau:

Bảng 3.33 Kết quả khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc ở điều kiện cấp tốc (lô 1)

Không đạt sabinen (89,86%) β-pinen (90,77%) limonen (87,96%) citronellal (83,82%)

Nhận xét: Kết quả kiểm nghiệm lô 1 tại các thời điểm khảo sát không đạt về chỉ tiêu cảm quan ngay từ tháng đầu tiên, riêng chỉ tiêu định lượng đến tháng thứ 5 không đạt về chỉ tiêu định lượng của sabinen, limonen, citronellal

Nhận xét: Kết quả kiểm nghiệm lô 2 tại các thời điểm khảo sát không đạt về chỉ tiêu cảm quan ngay từ tháng đầu tiên, riêng chỉ tiêu định lượng đến tháng thứ 5 không đạt về chỉ tiêu định lượng của sabinen, limonen, citronellal

Nhận xét: Kết quả kiểm nghiệm lô 3 tại các thời điểm khảo sát không đạt về chỉ tiêu cảm quan ngay từ tháng đầu tiên, riêng chỉ tiêu định lượng đến tháng thứ 5 không đạt về chỉ tiêu định lượng của sabinen, limonen, citronellal.

KẾT QUẢ ƯỚC TÍNH TUỔI THỌ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÃO HÓA CẤP TỐC

Kết quả khảo sát độ ổn định của viên xông chứa tinh dầu Chúc bằng phương pháp lão hóa cấp tốc cho thấy hàm lượng sabinen, β-pinen, limonen, citronellal giảm dần theo thời gian khảo sát, đến tháng thứ năm hàm lượng hoạt chất ở lô 1, 2 và 3 còn dưới 90%, nghĩa là có sự thay đổi “đáng kể” vì vậy chúng tôi ước tính tuổi thọ dựa trên kết quả nghiên cứu dài hạn.

BÀN LUẬN

Tính tương thích hệ thống

Kiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong nhiều quy trình phân tích Đánh giá tính tương thích của hệ thống nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử

Tính tương thích hệ thống thực hiện trên mẫu thử và mẫu chuẩn cho các đỉnh sabinen, β-pinen, limonen, citronellal, camphor với các thông số thời gian lưu, hệ số bất đối và hệ số dung lượng tương đương nhau Kết quả đã trình bày ở mục 3.1.1 cho thấy thông số sắc ký đều đạt và có RSD F(lt), nên chấp nhận giả thuyết HA Kết luận: phương trình hồi quy 𝑦=0,1233𝑥 − 0,0793 là tương thích

Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra tính ý nghĩa của các hệ số hồi quy

Giả thuyết: H0: hệ số b không có ý nghĩa thống kê

HA: hệ số b có ý nghĩa thống kê

Biện luận: t(tn) < t(lt), nên chấp nhận giả thuyết H0 Kết luận: hệ số b không có ý nghĩa thống kê

Như vậy, phương trình hồi quy tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của sabinen là 𝑦=0,1233𝑥 (hệ số tương quan R 2 = 0,9997) có ý nghĩa trong khoảng nồng độ [2,8–51] àg/mL hay núi cỏch khỏc là phương trỡnh hồi quy 𝑦=0,1233𝑥 với R 2 0,9997 cho phộp ngoại suy ra nồng độ sabinen trong khoảng [2,8–51] àg/mL

Bảng 4.2 Kết quả xử lý thống kê tính tuyến tính của β-pinen

Giá trị t của hệ số a 77,624 F(0,05;1;4) = 7,709

Giá trị t của hệ số b -0,743

Sử dụng trắc nghiệm F kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy

Giả thuyết: H0: phương trình hồi quy không tương thích

HA: phương trình hồi quy tương thích

Biện luận: F(tn) > F(lt), nên chấp nhận giả thuyết HA Kết luận: phương trình hồi quy 𝑦=0,1242𝑥 − 0,0299 là tương thích

Bảng 4.3 Kết quả xử lý thống kê tính tuyến tính của limonen

Bảng 4.4 Kết quả xử lý thống kê tính tuyến tính của citronellal

Như vậy, phương trình hồi quy tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của sabinen là 𝑦=0,0881𝑥 (hệ số tương quan R 2 = 0,9994) có ý nghĩa trong khoảng nồng độ [2,6–

51] àg/mL hay núi cỏch khỏc là phương trỡnh hồi quy 𝑦=0,0881𝑥 với R 2 = 0,9994 cho phộp ngoại suy ra nồng độ sabinen trong khoảng [2,6–51] àg/mL

Với kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác ở các mức nồng độ 80%, 100% và 120% đều đạt theo quy định Bên cạnh đó, trong khoảng nồng độ từ 80%120% so với hàm lượng ghi trên nhãn cũng nằm trong đường tuyến tính nên vẫn đảm bảo được tính tuyến tính Như vậy, trong khoảng nồng độ từ 80%120% so với hàm lượng ghi trên nhãn quy trình phân tích vẫn đảm bảo được độ đúng, độ chính xác và tính tuyến tính hay nói cách khác khoảng xác định của quy trình phân tích là từ 80%120% so với hàm lượng ghi trên nhãn đáp ứng theo yêu cầu của Sổ tay đăng ký thuốcCục Quản lý Dược Việt Nam

Kết luận: kết quả thẩm định quy trình định lượng β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong viên xông có chứa tinh dầu vỏ quả Chúc bằng phương pháp GC-FID theo ICH đạt yêu cầu đề ra, có thể áp dụng quy trình để nghiên cứu độ ổn định của thuốc.

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN XÔNG CÓ CHỨA TINH DẦU CHÚC

4.2.1 Khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc Đề tài tiến hành khảo sát độ ổn định của viên xông có chứa tinh dầu Chúc trên 3 lô với cỡ lô nghiên cứu là 1000 viên bằng phương pháp thử nghiệm dài hạn ở điều kiện:

30 o C ± 2 o C, độ ẩm tương đối 75% ± 5% và phương pháp lão hóa cấp tốc ở điều kiện:

40 o C ± 2 0 C, độ ẩm tương đối 75% ± 5% Các mẫu thử trước khi đưa vào nghiên cứu đã được đánh giá các chỉ tiêu chất lượng như hình thức cảm quan, độ đồng đều khối lượng, thời gian giải phóng tinh dầu, thời gian bền mùi, định tính, định lượng của tất cả các lô bào chế đều đủ điều kiện để đưa vào nghiên cứu độ ổn định

4.2.2 Độ ổn định vật lý

Bằng phương pháp thử nghiệm dài hạn: Sau 5 tháng theo dõi, chỉ tiêu về cảm quan của các lô không thay đổi, viên nang mềm hình bầu dục, màu xanh lá nhạt, không méo mó, không rỉ dịch, dung dịch chứa trong nang có mùi thơm của tinh dầu, không có vật lạ nhìn thấy bằng mắt thường Các chỉ tiêu khác như độ đồng đều khối lượng, thời gian giải phóng tinh dầu, thời gian bền mùi, định tính, đều nằm trong giới hạn cho phép

Bằng phương pháp lão hóa cấp tốc: chỉ tiêu về cảm quan của các lô có sự thay đổi ngay từ tháng đầu tiên Viên nang mềm bị dính, méo mó Do tính chất của viên nang

Tiêu đề	Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng và khảo sát độ ổn định của viên nang mềm chứa tinh dầu chúc (Citrus hystrix) dùng để xông
Tác giả	Sơn Thị Huỳnh Na
Người hướng dẫn	ThS. Lê Thị Minh Ngọc
Trường học	Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ
Chuyên ngành	Dược Sĩ Đại Học
Thể loại	Luận Văn Tốt Nghiệp
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Cần Thơ

Định dạng
Số trang	78
Dung lượng	2,31 MB