Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thẩm định quy trình định lượng β-pinen, sabinen, limonen, citronellal
2.2.1.1. Cách pha mẫu và điều kiện sắc ký
Chuẩn bị mẫu chuẩn nội: cân chính xác 10mg camphor, cho vào bình định mức 100ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (N).
STT Tên thiết bị Số hiệu Nguồn gốc 1 Máy đóng nang mềm tự động Cube R 150 Hàn Quốc 2 Máy sắc ký khí GC-FID Agilent Mỹ
3 Cân phân tích Ep 214C-Ohaus Mỹ
4 Tủ vi khí hậu Global 5000
5 Tủ đông
Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác 1g dịch nhân, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (T1). Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (T2).
Chuẩn bị mẫu chuẩn:
̵ Chuẩn β-pinen: Cân chính xác 10mg β-pinen cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (β1). Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (β2).
̵ Chuẩn sabinen: Cân chính xác 10mg sabinen cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (S1). Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (S2).
̵ Chuẩn limonen: Cân chính xác 10mg limonen cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (L1). Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (L2).
̵ Chuẩn citronellal: Cân chính xác 10mg citronellal cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (C1). Hút 1ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat (C2).
Điều kiện sắc ký
̵ Nhiệt độ tiêm mẫu: 250 oC
̵ Tỷ lệ chia dòng: 1/10
̵ Cột phõn tớch DB–5MS (30m x 250àm x 0,25àm)
̵ Đầu dò ion hóa ngọn lửa
̵ Nhiệt độ detector: 280 oC
̵ Thể tớch tiờm mẫu: 2àl.
Quy trình định lượng β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong dịch nhân của viên xông có chứa tinh dầu Chúc.
+ Chuẩn bị dung dịch thử theo mục 2.2.1.1. Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xác định ở mục 2.2.1.1.
+ Hỗn hợp chuẩn (H): hỳt chớnh xỏc 2300àl dung dịch (β2), 1500àl dung dịch (S2), 900àl dung dịch (L2), 2200àl dung dịch (C2), 1ml dung dịch chuẩn nội
cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó xỏc định ở mục 2.2.1.1.
+ Xác định diện tích đỉnh β-pinen, sabinen, limonen, citronellal, camphor trong dung dịch chuẩn, thử, tính toán hàm lượng các chất trong viên xông có chứa tinh dầu chúc.
𝑋(%) =𝑆𝑡ℎử×[𝐶]
𝑆𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 ×𝑆𝐶𝑁/𝐶
𝑆𝐶𝑁/𝑇× 400 Trong đó:
X(%): phần trăm β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong viên xông có chứa tinh dầu Chúc.
Schuẩn, Sthử: lần lượt là diện tích đỉnh của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu chuẩn, và diện tích đỉnh của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu thử.
[C]: nồng độ mẫu chuẩn.
SCN/C, SCN/T: lần lượt là diện tích chuẩn nội trong mẫu chuẩn, và diện tích chuẩn nội trong mẫu thử.
Đề tài thẩm định quy trình định lượng sabinen, β-pinen, limonen, citronellal theo hướng dẫn của AOAC.
2.2.1.2. Xác định tính tương thích hệ thống Cách tiến hành:
̵ Mẫu thử chuẩn bị theo mục 2.2.1.1.
̵ Mẫu hỗn hợp chuẩn: hỳt chớnh xỏc 500àl dung dịch (β2), 500àl dung dịch (S2), 500àl dung dịch (L2), 500àl dung dịch (C2), 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat.
Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp cho các mẫu thử và mẫu hỗn hợp chuẩn theo điều kiện sắc ký tối ưu đã được xác định ở mục 2.2.1.1.
Tính tương thích hệ thống được khảo sát với các thông số sắc ký đặc trưng: thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), số đĩa lý thuyết (N), hệ số dung lượng (k’), độ phân giải (Rs) và hệ số bất đối (As).
(2.4)
Yêu cầu:
̵ Rs> 1,5.
̵ As = 0,8-1,5.
̵ RSD 6 lần liên tiếp tiến hành không quá 2%.
Tính đặc hiệu
Cách tiến hành: thực hiện trên các mẫu:
̵ Mẫu không khí.
̵ Mẫu dung mụi: dung mụi ethyl acetat được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập.
̵ Mẫu hỗn hợp chuẩn: hỳt chớnh xỏc 500àl dung dịch (β2), 500àl dung dịch (S2), 500àl dung dịch (L2), 500àl dung dịch (C2) cho vào bỡnh định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập.
̵ Mẫu chuẩn thờm chuẩn nội: hỳt chớnh xỏc 500àl dung dịch (β2), 500àl dung dịch (S2), 500àl dung dịch (L2), 500àl dung dịch (C2), 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập.
̵ Mẫu thử: Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch (T1), cho vào bỡnh định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập.
̵ Mẫu thử thờm chuẩn nội: Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch (T1), 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập.
̵ Mẫu chuẩn nội: Hút chính xác 1ml dung dịch (N), cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập.
̵ Mẫu phacebo không chứa tinh dầu Chúc: cân chính xác 1g dịch nhân không chứa tinh dầu Chúc, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho
vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập.
̵ Mẫu dầu Lạc: cân chính xác 1g dầu Lạc, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat.
Mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó thiết lập.
̵ Chuẩn bị các mẫu phân hủy:
+ Mẫu được chiếu sáng liên tục trong 8 giờ và mẫu phân hủy ở 60 0C trong 8 giờ, chuẩn bị như mục 2.2.1.1.
+ Mẫu được phân hủy bởi NaOH 1N trong 8 giờ, mẫu phân hủy bởi H2O2
30% trong 6 giờ và mẫu phân hủy bởi H3PO4 đặc trong 8 giờ: cân 2g dịch nhân cho vào bình định mức 100mL, điền đủ bằng dung dịch NaOH 1N, H2O2 30% hoặc H3PO4 đặc, siêu âm trong 10 phút. Để yên tránh ánh sáng, thỉnh thoảng lắc trong thời gian như trên. Gạn lấy lớp trên. Cân chính xác 1g dịch thu được, cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat. Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch vừa pha, 1ml dung dịch chuẩn nội cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ethyl acetat.lọc qua màng lọc 0,45àm thu được dung dịch phõn hủy bởi tỏc nhõn kiềm, oxi húa và acid.
̵ Tiến hành sắc ký với điều kiện đã xác định ở mục 2.2.1.1.
̵ Yêu cầu: thời gian lưu của pic β-pinen, sabinen, limonen, citronellal ở dung dịch mẫu chuẩn và các mẫu phân hủy phải tương đương nhau. Các pic tạp phân hủy phải tách hoàn toàn với pic của các hoạt chất.
Đánh giá kết quả:
̵ Sắc ký đồ của mẫu thử phải có các pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của các pic có trong chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử và mẫu phân hủy nếu xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp) không phải pic của hoạt chất cần phân tích, thì pic của hoạt chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic
tạp và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được quy định trong Dược điển.
̵ Sắc ký đồ dung môi và khí mang, mẫu chuẩn nội không có các pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu các pic trong mẫu chuẩn.
̵ Sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn: phải có sự tăng lên về chiều cao và diện tích của các pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của các pic trong mẫu chuẩn.
̵ Sắc ký đồ mẫu chuẩn nội không trùng thời gian lưu với các pic định lượng, pic chuẩn nội tách hoàn toàn khỏi các pic khác trong các mẫu, và không gây nhiễu cho bất kỳ thành phần nào trong các mẫu thêm chuẩn nội.
Tính tuyến tính và khoảng tuyến tính Cách tiến hành:
Tiến hành pha loãng dung dịch (β2), (S2), (L2), (C2) thành 5 mẫu có nồng độ xác định khác nhau của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal.
Tiến hành sắc ký các dãy mẫu của β-pinen, sabinen, limonen, citronellal theo điều kiện sắc ký đã xác định ở mục mẫu mục 2.2.1.1.
Vẽ đường biểu diễn tương quan diện tích đỉnh theo nồng độ chất phân tích.
Đánh giá kết quả:
̵ Xác định hệ số a (độ dốc), b (tung độ gốc), R2 (bình phương của hệ số tương quan) của phương trình hồi quy y= ax + b. Tính tuyến tính thường được chấp nhận khi 0,995 ≤R2≤ 1,000.
̵ Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy bằng trắc nghiệm F và ý nghĩa của hệ số trong phương trình hồi quy bằng trắc nghiệm T.
Độ đúng
Cách tiến hành:
Xác định hàm lượng β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu thử bằng phương pháp đã khảo sát.
Chuẩn bị mẫu thử theo mục 2.2.1.1. Tính hàm lượng trung bình.
Chuẩn bị mẫu thử thêm chuẩn: lần lượt thêm vào 7 mẫu thử lượng chuẩn với mức 80%, 100%, 120% so với hàm lượng trung bình β-pinen, sabinen, limonen, citronellal trong mẫu thử.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã thiết lập để tìm tỷ lệ hồi phục.
Đánh giá kết quả:
Dựa vào diện tích đỉnh để xác định hàm lượng mẫu thử, mẫu thử đã thêm chuẩn. Từ đó tính ra tỷ lệ hồi phục của phương pháp định lượng theo công thức:
Y = Xr
Xa× 100%
Trong đó:
Y là tỷ lệ phục hồi.
Xr là lượng chuẩn tìm thấy thực tế.
Xa là lượng chuẩn cho vào trên lý thuyết.
Tỷ lệ phục hồi phải đạt 80 – 110%. [16] [3]
Độ lặp lại Cách tiến hành:
Chuẩn bị 7 mẫu thử như mục 2.2.1.1
Tiến hành sắc ký các mẫu theo điều kiện sắc ký đã xác định ở mục 2.2.1.1 Đánh giá kết quả:
̵ Xác định hàm lượng sabinen, β-pinen, limonen, citronellal trong mỗi mẫu thử.
̵ Tính RSD, Xtb với yêu cầu RSD ≤ 1,3%. [17]
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD): dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc.
LOD = 3,3 × SD a Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của mẫu trắng hay độ lệch chuẩn của đường hồi quy.
a: độ dốc của đường cong hiệu chuẩn (đường tuyến tính) của phương pháp phân tích.
Giới hạn định lượng (LOQ): dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc.
LOQ = 10 × SD a
(2.1)
(2.2)
(2.3)
Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của đáp ứng mẫu trắng hay độ lệch chuẩn của đường hồi quy.
a: độ dốc của đường cong hiệu chuẩn (đường tuyến tính) của phương pháp phân tích.